低溫乳制品中沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法體系的建立

陶文靖，趙婷婷，王 琦，董 彬，王玉花，王維嘉，劉赫東，曲連海*

（1.北京美正生物科技有限公司，北京 102200；2.光明乳業(yè)股份有限公司華東中心工廠，上海 201111；3.通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)（青島）有限公司，山東青島 266071；4.天津光明夢(mèng)得乳品有限公司，天津 300499；5.通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司武漢分公司，湖北武漢 430056）

近年來，我國居民對(duì)營養(yǎng)健康的關(guān)注度越來越高，對(duì)牛奶可以提升免疫力的認(rèn)可度較高[1]。液態(tài)乳制品中低溫鮮奶以“更新鮮、更營養(yǎng)”的特點(diǎn)受到消費(fèi)者的青睞?！?020中國奶商指數(shù)報(bào)告》顯示，96.0%的中國消費(fèi)者認(rèn)為低溫鮮奶富含乳鐵蛋白和免疫球蛋白等活性因子，能有效提升機(jī)體免疫力[2]。

近幾年，國產(chǎn)優(yōu)質(zhì)低溫巴氏殺菌乳的滅菌溫度已由105 ℃降低到75 ℃，乳中含有的乳鐵蛋白、免疫球蛋白、過氧化物酶等對(duì)人體有益的活性成分得到最大限度的保留，可以達(dá)到進(jìn)口乳制品的8倍[3-4]。這種殺菌工藝殺滅了大部分微生物，允許殘留部分微生物，將微生物含量降低到不會(huì)威脅人體健康的程度[5]。低溫乳制品保質(zhì)期短，根據(jù)包裝形式的不同，在2～6 ℃條件下，巴氏殺菌乳保質(zhì)期一般為2～7 d，低溫酸奶保質(zhì)期一般為14～21 d[6]。巴氏殺菌乳對(duì)運(yùn)輸、儲(chǔ)存條件要求較高，一旦儲(chǔ)存溫度達(dá)不到要求，可能會(huì)存在微生物增殖的風(fēng)險(xiǎn)[7]。食源性致病菌是引起食品安全問題的主要因素之一，而微生物污染是導(dǎo)致牛奶質(zhì)量問題的重要因素，因此牛奶中的致病菌成為消費(fèi)者關(guān)注的焦點(diǎn)[8-10]。根據(jù)我國國標(biāo)要求，需重點(diǎn)關(guān)注的致病性微生物有金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等。

沙門氏菌（Salmonella）屬于腸桿菌科革蘭氏陰性需氧及兼性厭氧菌，沙門氏菌感染是引起人類食源性腸胃炎的重要病因之一[11]。沙門氏菌感染最常見于動(dòng)物源食物，通過攝入動(dòng)物源性受污染的食品造成的食物中毒占人類沙門氏菌病例的75%[12]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）規(guī)定，我國乳及乳制品中沙門氏菌的限量是n=5，c=0，m=0 CFU/25 g（mL）；國際食品法典委員 會(huì)（Codex Alimentarius Commission，CAC）對(duì) 于乳制品中沙門氏菌的限量是n=15，c=0，m=0 CFU/25 g（mL），對(duì)于用于特殊食療目的乳制品的采樣方案相對(duì)嚴(yán)格，n=30，c=0，m=0 CFU/25 g（mL）[13]；澳大利亞、新西蘭、美國、韓國和英國等眾多國家對(duì)沙門氏菌的限量要求也是25 g（mL）不得檢出，取樣量n略有差別[14]。

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016）中沙門氏菌檢驗(yàn)流程通常為3～7 d，此標(biāo)準(zhǔn)在食品安全領(lǐng)域?yàn)楸Ｕ先藗兊纳眢w健康作出突出貢獻(xiàn)，但操作較煩瑣，耗時(shí)長，不能滿足快速檢測(cè)需求[15]。低溫乳制品保質(zhì)期較短，終成品快速放行以及流通過程中的快速監(jiān)控尤為重要。2021年8月《乳制品生產(chǎn)許可審查細(xì)則（征求意見稿）》公開征求意見中，要求企業(yè)針對(duì)短保產(chǎn)品建立有效的微生物快速檢測(cè)方法。

國內(nèi)現(xiàn)行有效的沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法，操作環(huán)節(jié)復(fù)雜，對(duì)人員操作要求較高，需要2步增菌，時(shí)間較長[16]。本研究是要建立一套更嚴(yán)格、簡單、適合企業(yè)操作的沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法，以滿足低溫乳制品生產(chǎn)加工過程及終產(chǎn)品快速放行、及時(shí)糾偏的需求，提高致病菌檢測(cè)技術(shù)能力，降低食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ATCC 14028鼠傷寒沙門氏菌、CICC 21498鴨沙門氏菌、CMCC（B）50071傷寒沙門氏菌、CMCC（B）50093甲型副傷寒沙門氏菌、CMCC（B）50094乙型副傷寒沙門氏菌、CMCC（B）50335腸炎沙門氏菌，標(biāo)準(zhǔn)菌株；高溫殺菌乳（低溫保藏）；巴氏殺菌乳；發(fā)酵乳；腦心浸液培養(yǎng)基(Brian Heart Infusion，BHI)；緩沖蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）培養(yǎng)基；MicroFast?沙門氏菌快速增菌培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀（型號(hào)為SLAN-96P，上海宏石醫(yī)療科技有限公司）；勻質(zhì)器（型號(hào)為BagMixer@400，Interscience）；渦旋振蕩器（型號(hào)為MX-S，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司）；恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)為BPC-150F，LRH-250，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；恒溫?fù)u床（型號(hào)為ZWY-240，上海智誠分析儀器制造有限公司）；離心機(jī)（型號(hào)為5430R，Eppendorf）；金屬?。ㄐ吞?hào)為OSE-DB-01，天根生化科技有限公司）。

1.3 方法體系的選擇

結(jié)合準(zhǔn)確性、可操作性、方法趨勢(shì)、整體檢測(cè)時(shí)間以及成本等，最終選定的方法體系為快速增菌結(jié)合實(shí)時(shí)熒光PCR，增菌液直接進(jìn)行初篩，陽性結(jié)果進(jìn)一步采用國標(biāo)方法進(jìn)行確認(rèn)。進(jìn)而對(duì)方法體系進(jìn)行可行性研究、優(yōu)化以及方法評(píng)價(jià)，最后形成方法體系。

1.4 方法可行性研究

1.4.1 實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒靈敏度評(píng)價(jià)

取沙門氏菌培養(yǎng)物，用無菌水進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌的濃度。以不同濃度的稀釋液為樣本，用檢測(cè)體系中的裂解液裂解后，使用PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度梯度重復(fù)10次。記錄不同沙門氏菌不同濃度的陽性檢出率。

1.4.2 培養(yǎng)基的增菌效果評(píng)價(jià)

取 25 g（mL）樣品于 225 mL MicroFast?沙門氏菌快速增菌培養(yǎng)基中，按照（5～10） CFU/25 g的濃度進(jìn)行沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的添加，勻質(zhì)2 min，（36±1）℃培養(yǎng)24 h。計(jì)數(shù)增菌后18 h和24 h的沙門氏菌濃度。

1.5 方法體系的評(píng)價(jià)

在方法系統(tǒng)針對(duì)目標(biāo)菌沙門氏菌檢測(cè)的特異性方面，使用20株目標(biāo)菌和15株非目標(biāo)菌驗(yàn)證其包容性和排他性；在方法體系針對(duì)低溫乳制品的適用性方面，通過采用人工添加菌種到不同類型樣品的方式，驗(yàn)證方法體系在靈敏度、方法準(zhǔn)確度等方面與參考標(biāo)準(zhǔn)方法的一致性。

1.5.1 特異性驗(yàn)證

取沙門氏菌陽性菌株20株和非沙門氏菌15株，用無菌接種環(huán)將各菌株劃線接種于BHI瓊脂平板中，（37±1）℃培養(yǎng)18～24 h。用無菌接種環(huán)挑取單菌落，置于50 μL無菌PBS中混勻，制備成菌懸液，分別按照PCR方法體系進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.2 與參考標(biāo)準(zhǔn)方法一致性驗(yàn)證

（1）菌懸液制備。將沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028、腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335、傷寒沙門氏菌 CMCC（B）50071）和非沙門氏菌（大腸埃希氏菌ATCC 25922、福氏志賀氏菌 CMCC（B）51572、銅綠假單胞菌 ATCC 27853）用無菌接種環(huán)分別劃線接種于BHI瓊脂平板上，（37±1）℃培養(yǎng)18～24 h。用無菌接種環(huán)挑取單菌落，接種于BHI液體培養(yǎng)基，恒溫?fù)u床（37±1）℃，160 r/min，振搖培養(yǎng)18 h。用平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基計(jì)數(shù)菌液濃度，并用無菌PBS培養(yǎng)基制備10倍梯度稀釋液。

（2）人工添加樣品制備。取高溫殺菌乳（低溫保藏）、巴氏殺菌乳、發(fā)酵乳各60個(gè)，每個(gè)樣品稱取2份各25 g，其中一份按照方法體系加入225 mL沙門氏菌增菌培養(yǎng)基，另一份加入GB 4789.4—2016中的稀釋液緩沖蛋白胨水（BPW），發(fā)酵乳樣品使用無菌1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.5。分別同時(shí)添加目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌，制備成陰性控制樣品54個(gè)（目標(biāo)菌濃度為0 CFU/25 g，非目標(biāo)菌濃度為50～100 CFU/g）、低濃度污染樣品63個(gè)（目標(biāo)菌濃度為5～10 CFU/25 g，非目標(biāo)菌濃度為50～100 CFU/g）和高濃度污染樣品63個(gè)（目標(biāo)菌濃度為50～100 CFU/25 g，非目標(biāo)菌濃度為500～1 000 CFU/g）。

（3）樣品測(cè)試。加入沙門氏菌增菌培養(yǎng)基的樣品按照方法體系進(jìn)行測(cè)試，加入BPW增菌液的樣品，按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016）進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的靈敏度驗(yàn)證

用試劑盒檢測(cè)不同沙門氏菌菌株的不同濃度，如圖1所示，當(dāng)菌濃度＞104CFU/mL時(shí)，陽性檢出率為100%。（圖1中ATCC 14028與CICC 21498曲線重合，CMCC（B）50093與CMCC（B）50335曲線重合，所有編號(hào)菌株曲線末端重合）。

圖1 不同濃度沙門氏菌的陽性檢出率

2.2 培養(yǎng)基的增菌效果驗(yàn)證

使用MicroFast?沙門氏菌快速增菌培養(yǎng)基，以無菌水和發(fā)酵乳為基質(zhì)，進(jìn)行不同沙門氏菌的低濃度加標(biāo)（100CFU），經(jīng)過（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h后，沙門氏菌的菌株終濃度＞107CFU/mL，以沙門氏菌最低檢出限1 CFU/25 g來計(jì)算，最終增菌濃度＞106CFU/mL，見圖2。

圖2 快速增菌培養(yǎng)基增菌效果

2.3 方法體系的確定

經(jīng)過可行性研究確定，由快速增菌培養(yǎng)基結(jié)合實(shí)時(shí)熒光PCR組成的體系是可行的，建立的方法體系如圖3所示。

圖3 方法體系流程圖

2.4 方法體系特異性驗(yàn)證

取沙門氏菌陽性菌株20株和非沙門氏菌15株，制備菌懸液后，取40 μL菌懸液制備DNA模板后，使用PCR方法體系檢測(cè)。結(jié)果表明，20株沙門氏菌陽性菌株的檢測(cè)Ct值均小于35，結(jié)果均判定為“沙門氏菌陽性”；而對(duì)15株非沙門氏菌菌株均沒有出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，檢測(cè)Ct值均大于40或無值，結(jié)果均判定為“沙門氏菌陰性”，具體結(jié)果見表1。

表1 PCR方法體系特異性檢測(cè)結(jié)果

2.5 與參考標(biāo)準(zhǔn)方法一致性驗(yàn)證

對(duì)高溫殺菌乳（低溫保藏）、巴氏殺菌乳、發(fā)酵乳各60個(gè)人工污染的樣品，每個(gè)樣品稱取2份各25 g，分別用方法體系和GB 4789.4—2016進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果匯總見表2。

表2 兩種檢測(cè)方法對(duì)人工污染樣品的檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果表明，54份陰性控制樣品用兩個(gè)方法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，126份添加了陽性目標(biāo)菌的樣品，PCR方法體系全部檢測(cè)陽性，而國標(biāo)方法為122份樣品檢出陽性，4份樣品為陰性。4份未檢出的樣品全部為低染菌濃度的發(fā)酵乳樣品。對(duì)兩個(gè)方法的檢測(cè)結(jié)果，采用卡方檢驗(yàn)比較差異性，表明PCR方法體系與參考方法GB 4789.4—2016的陽性確證率在5%置信區(qū)間內(nèi)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=2.25＜3.84）。根據(jù)ISO 16140-2：2016計(jì)算PCR方法體系的靈敏度為100%，國標(biāo)方法的靈敏度為96.8%，相對(duì)正確度為97.8%。

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)方法體系的系統(tǒng)化驗(yàn)證，該方法可以實(shí)現(xiàn)沙門氏菌24 h內(nèi)的增菌和檢測(cè)。其中高溫滅菌乳、巴氏殺菌乳參比方法與驗(yàn)證方法檢測(cè)結(jié)果與加標(biāo)結(jié)果一致，發(fā)酵乳樣品驗(yàn)證方法靈敏度稍高于參比方法。發(fā)酵乳樣品的pH一般在4.5左右，而沙門氏菌最適生長pH為6.6～8.2，酸性環(huán)境會(huì)抑制沙門氏菌生長[17]。因此，在檢測(cè)發(fā)酵乳樣品的時(shí)候需要調(diào)整pH至中性。大部分發(fā)酵乳樣品中會(huì)添加濃度超過1×106CFU/mL的活性益生菌成分，這些益生菌在增菌過程中會(huì)大量生長，對(duì)沙門氏菌生長造成抑制[18-19]。本方法體系中采用的培養(yǎng)基中含有部分pH緩沖成分，能夠緩沖樣本帶來的pH值變化。同時(shí)，體系中含有部分中和劑，能減弱乳酸菌素等對(duì)腸道致病菌的抑制作用。

方法體系的建立考慮了實(shí)際操作者的需求，一個(gè)方法體系的準(zhǔn)確性是由方法學(xué)的準(zhǔn)確性和操作可實(shí)施性共同決定的。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇的PCR試劑盒在生產(chǎn)的過程中就進(jìn)行預(yù)分裝，減少實(shí)驗(yàn)室操作，并降低污染風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)優(yōu)化了核酸提取的操作，直接將增菌液加入裂解液中進(jìn)行熱裂解，降低操作造成的誤差，前處理時(shí)間由3～4 h縮短為40 min。在確保準(zhǔn)確性的情況下，更方便企業(yè)用戶的實(shí)際應(yīng)用。有關(guān)部門在修訂制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)可以綜合考慮方法的可實(shí)施性因素。