離子色譜-脈沖安培法測定糖果中的D-甘露糖醇

俞所銀，聶 磊，閆 晴

（1.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233；2.國家保潔產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（上海），上海 200233；3.上海食品快速檢測工程技術(shù)研究中心，上海 200233）

0 引言

D-甘露糖醇（D-Mannitol）又叫己六醇、甘露醇等，廣泛存在于多種陸地和海洋植物中，如橄欖、柿子樹和藻類等。因保濕補(bǔ)水、雙糖代用劑和制備利尿劑等功效在醫(yī)藥、食品和飼料等領(lǐng)域被廣泛使用。目前針對D-甘露糖醇分離檢測的研究不多，更多的是作為某一種方法同時(shí)測定、分離多種糖或糖醇中的一種［1］。市場上出現(xiàn)了很多添加了D-甘露糖醇的無糖食品，已經(jīng)成為糖尿病患者飲食行業(yè)的一個(gè)銷售亮點(diǎn)，企業(yè)將其作為代糖食品為宣傳賣點(diǎn)，實(shí)際產(chǎn)品中添加的量由于沒有相應(yīng)的檢測而不得而知。D-甘露糖醇在產(chǎn)品中的添加，可能涉及到產(chǎn)品標(biāo)簽整改，虛假宣傳；且添加量高則可能不被人體代謝，造成腎臟損傷。目前，市場中使用D-甘露糖醇的糖果很多，尤其是無糖薄荷糖和口香糖，但是由于缺乏相應(yīng)的檢測方法，政府部門對其監(jiān)管以及企業(yè)對產(chǎn)品質(zhì)量的提升均缺少有力的手段，因此建立一種適用食品中D-甘露糖醇的檢測方法顯得尤為重要。

現(xiàn)行有效的GB 1886.177-2016《食品添加劑D-甘露糖醇》只規(guī)定了淀粉、淀粉糖或蔗糖為原料制得的食品添加劑D-甘露糖醇的鑒別試驗(yàn)、理化指標(biāo)的測定［2］，操作相對復(fù)雜，且對低含量添加靈敏度和準(zhǔn)確性不高。而現(xiàn)行食品中D-甘露糖醇含量尚無檢測方法。針對糖醇類物質(zhì)的檢測，主要是比色法［3］、高效液相色譜法和高效離子色譜法等［4-10］。比色法操作簡單，成本低，但是抗干擾性差，對于復(fù)雜樣品定量不準(zhǔn)確；高效液相色譜法使用示差或者蒸發(fā)光檢測器，穩(wěn)定性好，前處理方便，但是對于糖類檢測的靈敏度不夠，難以滿足低含量樣品的檢測；離子色譜法前處理簡單，靈敏度高，適合復(fù)雜樣品的分析。

本文采取離子色譜脈沖安培檢測器（ion chromatography with pulsed amperometricdetection，IC-PAD），利用糖類在強(qiáng)堿性條件下呈現(xiàn)離子狀態(tài)，可在陰離子色譜柱上被分離出來的特性進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)對糖果中D-甘露糖醇含量的定量分析，方法快速高效，適用于大批量樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

ICS-5000 型離子色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司，配備電化學(xué)檢測器）；電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器公司）；SK8210LHC 型超聲波清洗儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；Milli-Q 型超純水器（美國 Millipore 公司）；G560E型渦旋振蕩器（美國Scientific Industries 公司）；5804 型高速離心機(jī)（德國 Eppendorf 公司）；0.22μm Filter Unit 濾膜（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

D- 甘露糖醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%，德國Dr.ehrenstorfer 公司）；山梨糖醇、麥芽糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、麥芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98%，美國A ChemTek，Inc 公司）；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅（優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙腈（色譜純，美國Sigma 公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

膠基糖果（口香糖）：準(zhǔn)確稱取樣品1 g（精確到0.001 g）于50 mL 具塞玻璃管中，加入6 mL 水，渦旋1 min；80 ℃水浴加熱至全溶，渦旋1 min；冷卻至室溫后，緩慢加入亞鐵氰化鉀（106 mg/mL）和乙酸鋅（219 mg/mL）各1 mL，用水定容到10 mL，渦旋1 min；以9 000 rad/min 離心作用2 min，過0.22 μm（PTFE）微孔濾膜至樣品瓶，待測。

其他糖果（硬糖、軟糖、凝膠糖果）：準(zhǔn)確稱取樣品1 g（精確到0.001 g）于50 mL具塞玻璃管中，加入6 mL 水，渦旋1 min；80 ℃水浴加熱至全溶，渦旋1 min；冷卻至室溫后，用水定容到10 mL，渦旋1 min；以9 000 rad/min 離心作用2 min，過0.22μm（PTFE）微孔濾膜至樣品瓶，待測。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

D-甘露糖醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.0 mg/mL）：稱取0.010 0 g（精確到0.000 1 g）D-甘露糖醇于10.0 mL 容量瓶中，用水溶解并定容到刻度，4 ℃冰箱中保存一個(gè)月。

D-甘露糖醇標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 μg/mL）：吸取D-甘露糖醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL 于10.0 mL 容量瓶，加水定容至刻度。

D-甘露糖醇標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取0.10，0.20，0.50，0.80，1.00 mL 甘露糖醇標(biāo)準(zhǔn)中間液于10.0 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，相當(dāng)于1.0，2.0，5.0，8.0，10.0 μg/mL 濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 離子色譜分析條件

色譜柱為Dionex CarboPacTMMA1 BioLCTM（4×250 mm）分離柱，流動相為500 mmol/L 氫氧化鈉，等度洗脫；流速為0.45 mL/min；進(jìn)樣量25 μL；柱溫為30 ℃；檢測器為安培電化學(xué)檢測器。脈沖積分安培檢測器（工作電極：Au 電極；參比電極：Ag/AgCl 電極）。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

對于食品中的糖醇測定，目前現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中只有GB 5009.279-2016《食品中木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、赤蘚糖醇的測定》，使用該液相方法測定D-甘露糖醇時(shí)，山梨糖醇和D-甘露糖醇出峰時(shí)間重合，無法分離，如圖1所示。

圖1 D-甘露糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇和麥芽糖醇的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC 色譜圖Fig.1 Liquid chromatograms of the mixed standard solutions of D-mannitol，erythritol，xylitol，sorbitol and maltitol

離子色譜分離糖醇常用的色譜柱有PA1、PA20 和MA1 等，分別使用上述3 種色譜柱對D-甘露糖醇進(jìn)行分析。使用PA1 和PA20 色譜柱分離時(shí)，由于糖醇的保留時(shí)間較短，出峰時(shí)間過早（5 min 前），如圖2、圖3所示。在對實(shí)際樣品分析時(shí)，基質(zhì)干擾很大，不適于復(fù)雜樣品分析。

圖2 D-甘露糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇和麥芽糖醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的PA1 柱色譜圖Fig.2 Chromatograms of the mixed standard solutions of D-mannitol，erythritol，xylitol，sorbitol and maltitol by PA1 column

圖3 D-甘露糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇和麥芽糖醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的PA20 柱色譜圖Fig.3 Chromatograms of the mixed standard solutions of D-mannitol，erythritol，xylitol，sorbitol and maltitol by PA20 column

MA1 色譜柱保留時(shí)間適中，更適用于糖醇的分析。由于MA1 色譜柱對于氫氧化鈉梯度變化不敏感，且不適于使用醋酸鈉，所以選擇氫氧化鈉等度洗脫。通過比較不同濃度的氫氧化鈉濃度（500，300，250，200 mmol/L），考察保留時(shí)間、峰形和抗干擾情況，最終選擇500 mmol/L 氫氧化鈉等度洗脫50 min 作為流動相條件。在此條件下D-甘露糖醇的峰形對稱且具有良好的保留時(shí)間，不受常見的果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的干擾。對于無糖食品中經(jīng)常使用的木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇和赤蘚糖醇也可以有效分離，如圖4所示。

圖4 D-甘露糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇和麥芽糖醇的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MA1 柱色譜圖Fig.4 Chromatograms of the mixed standard solutions of D-mannitol，erythritol，xylitol，sorbitol and maltitol by MA1 column

2.2 加熱溫度的確定

選擇成分比較復(fù)雜的基質(zhì)糖果（口香糖）作為空白基質(zhì)，加入相同質(zhì)量濃度的D-甘露糖醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別選取60，80，100 ℃作為低、中、高3 個(gè)溫度點(diǎn)［11］，在相同條件下對分析物進(jìn)行測定，結(jié)果如圖5所示。加熱20 min 后80，100 ℃樣品全部溶解，提取率分別為98.29%，98.63%，而60 ℃加熱20 min 的樣品沒有完全溶解，提取率僅為62.33%。綜合考慮選擇80 ℃作為提取溫度。

圖5 不同提取溫度對D-甘露糖醇提取效率的影響Fig.5 The effect of extraction temperature on D-mannitol extraction efficiency

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

在糖果中除去瓊脂、變性淀粉、明膠和果膠等凝固劑、色素和蛋白質(zhì)后，再進(jìn)行后續(xù)分析，有利于延長色譜柱壽命和降低分析干擾。本文通過不同的沉淀方法，考察其提取效率。在空白的膠基糖果中，加入相同質(zhì)量濃度的D-甘露糖醇，分別使用乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液（1∶1；V∶V）、3%的乙酸溶液、乙腈和乙醇作為沉淀蛋白質(zhì)的試劑［12］，在相同的條件下對D-甘露糖醇進(jìn)行測定。使用乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液的樣品的D-甘露糖醇提取率最好，結(jié)果如圖6所示。故選擇乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液作為沉淀試劑。

圖6 不同沉淀方式對D-甘露糖醇提取效率的影響Fig.6 The effects of precipitation methods on D-mannitol extraction efficiency

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限

將甘露糖醇的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按離子色譜條件進(jìn)行分析，以峰面積對濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中以對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)y，待測組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。經(jīng)線性回歸后求得相關(guān)系數(shù)，以及分別計(jì)算出檢出限（LOD）、定量限（LOQ），結(jié)果如表1所示。

表1 D-甘露糖醇的線性方程、檢出限和定量限Tab.1 Linear equation，limits of detection and limits of quantification of D-mannitol

2.4.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度

選取3 種有代表性的陰性空白樣品基質(zhì)（凝膠糖果、口香糖、硬糖），分別按0.001%，0.002%，0.005%水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平做6 次平行試驗(yàn)。檢測結(jié)果如表2所示，方法回收率在77.8%～117.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）（n=6）為1.77%～9.41%，均小于10%，具有較高的準(zhǔn)確性。

表2 3 種糖果中D-甘露糖醇含量的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Recoveries and relative standard deviations of D-mannitol in three kinds of candies （n=6） （單位：%）

2.5 實(shí)際樣品測定

采用已建立的方法對上海市和蘇州市抽查糖果30 份（凝膠糖果10 份、口香糖10 份、硬糖10 份）進(jìn)行D-甘露糖醇檢測，其中凝膠糖果7 份樣品被檢測出D-甘露糖醇，含量在0.001 099%～0.836 8%，3 份未檢出?？谙闾? 份樣品被檢測出D-甘露糖醇，含量在1.018 1%～1.817%，僅1 份未檢出。硬糖9 份樣品被檢測出D-甘露糖醇，含量在0.000 519%～0.605 8%，1份未檢出。

3 結(jié)語

本文建立離子色譜-脈沖安培檢測器測定糖果中D-甘露糖醇含量的方法，前處理簡單，抗干擾性強(qiáng)，穩(wěn)定性高，適合大批量樣品的檢測。該方法的建立填補(bǔ)現(xiàn)行檢測方法的空白，可以為企業(yè)提高產(chǎn)品質(zhì)量提供技術(shù)支持，同時(shí)為政府監(jiān)管部門進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測提供有效的技術(shù)支撐。