酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀在HIV抗體篩查試驗(yàn)ELISA法中的應(yīng)用與探討

陳晶 昌圖縣疾病預(yù)防控制中心 （遼寧 鐵嶺 112500）

內(nèi)容提要： 目的：探討研究酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀在HIV抗體篩查試驗(yàn)ELISA法中的應(yīng)用。方法：選取2019年1月～2019年12月在本中心對(duì)艾滋病自愿咨詢檢測(cè)的521例人員采集靜脈血進(jìn)行研究，在ELISA法試驗(yàn)中分別酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀和水浴法，以此來(lái)探討酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀在HIV檢測(cè)中的作用；并以梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（TPPA）檢驗(yàn)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，分析ELISA法在HIV抗體篩查中的效果。結(jié)果：本研究結(jié)果顯示，酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀的靈敏度高于傳統(tǒng)水浴法，并且檢測(cè)時(shí)間也短于傳統(tǒng)水浴法（P＜0.05）。加速儀法的檢出率與水浴法完全一致（P＞0.05）。ELISA檢測(cè)結(jié)果與TPPA結(jié)果相比較，準(zhǔn)確率為98.84%、靈敏度為85.71%、特異度為99.80%。結(jié)論：ELISA法在HIV抗體篩查中準(zhǔn)確性較高，且酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀與水浴法能達(dá)到一致的檢驗(yàn)效果，但是前者大幅度縮短ELISA檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)靈敏度，提升了工作效率。

艾滋病全稱(chēng)" 獲得性免疫缺陷綜合征"，是由人類(lèi)免疫缺陷病毒引起的一種傳染病?；颊呙庖吡O度下降，由此引起一系列的感染、腫瘤等惡性病變，甚至導(dǎo)致患者的死亡[1]。艾滋病的潛伏期長(zhǎng)，且在發(fā)病之前沒(méi)有明顯癥狀特點(diǎn)，因此患者的治療時(shí)間往往比較偏后，對(duì)患者的生命健康安全造成巨大傷害。另一方面，艾滋病在目前尚無(wú)可以完全治愈的手段，因此艾滋病的預(yù)防與診斷就顯得十分重要。隨著艾滋病感染人數(shù)的逐年增多，各個(gè)縣級(jí)醫(yī)院也逐步建立起HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)室，目前在進(jìn)行入院檢查與輸血前檢查的必檢項(xiàng)目就是HIV抗體篩查，這項(xiàng)艱巨而繁重的工作則由HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展[2]。梅毒抗體檢測(cè)中梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（Treponema Pallidum Particle Assay，TPPA）是金標(biāo)準(zhǔn)，有著較高的特異性、敏感度，有利于非特異性抗體陰性或潛伏期患者診斷，但是TPPA試驗(yàn)反應(yīng)需要較長(zhǎng)的時(shí)間，而且檢驗(yàn)費(fèi)用相對(duì)較高，不能對(duì)結(jié)果做自動(dòng)化判斷，所以普及推廣受限。ELISA法因?yàn)槠漭^為敏感而作為一種初篩方法被初篩實(shí)驗(yàn)室首先選用，但是兩步法同樣會(huì)延長(zhǎng)檢測(cè)的時(shí)間，工作人員的檢測(cè)效率也會(huì)因此受到不一樣的影響。本中心對(duì)一臺(tái)酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀進(jìn)行引進(jìn)并將它用于HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)中，此儀器能夠廣泛應(yīng)用在加速酶聯(lián)免疫反應(yīng)。其是利用免疫反應(yīng)中抗原、抗體結(jié)合部分形成互補(bǔ),凹腔內(nèi)氨基酸側(cè)鍵的位置有利于產(chǎn)生多種次級(jí)鍵，同時(shí)有序施加的高頻電磁波能促使離子遷移以及偶極子轉(zhuǎn)動(dòng)使得免疫分子振轉(zhuǎn)的原理,進(jìn)而使酶聯(lián)免疫反應(yīng)時(shí)間由原本得幾十分鐘甚至數(shù)小時(shí)縮短至十分鐘內(nèi)完成。為此，選取2019年1月～2019年12月在本中心對(duì)艾滋病自愿咨詢檢測(cè)的521例人員采集靜脈血進(jìn)行研究，將其在使用過(guò)程中的檢測(cè)結(jié)果與影響進(jìn)行分析，具體報(bào)告如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

樣品：①隨機(jī)選取2019年1月～2019年12月在本中心對(duì)艾滋病自愿咨詢檢測(cè)的521例人員為研究對(duì)象，采集每位研究對(duì)象的靜脈血血清樣本進(jìn)行試驗(yàn)，其中男性體檢者353例、女性體檢者168例，年齡18～65歲，平均（42.65±7.52）歲。②質(zhì)控品A和質(zhì)控品B，由英科新創(chuàng)醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司提供。

試劑材料：HIV（1+2）型抗體篩查試劑盒，專(zhuān)門(mén)用作HIV檢測(cè)篩查。

儀器材料：NY/MMJ型酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀用于抗體初篩檢查；HH-6恒溫水浴箱，用于傳統(tǒng)水浴法的抗體初篩檢測(cè)中；KHB科華洗板機(jī)；KC-100凱特酶標(biāo)儀。

1.2 方法

按試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)水浴法進(jìn)行能夠嚴(yán)格操作步驟：①將樣本加入37 C水浴箱后靜置反應(yīng)60min；②將酶標(biāo)抗原加入37 C水浴箱后靜置反應(yīng)30min；③等待37 C水浴箱顯色30min。

酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀（加速儀法）用酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀取代水浴法中的37 C水浴箱，每一步的反應(yīng)時(shí)間都有很大的不同。

用生理鹽水對(duì)質(zhì)控品進(jìn)行呈倍比的稀釋?zhuān)賹?duì)兩種實(shí)驗(yàn)方式進(jìn)行敏感度的對(duì)比。

TPPA檢測(cè)方法：在U型培養(yǎng)板上對(duì)待測(cè)血清作稀釋?zhuān)a(chǎn)生4種稀釋液，比例分別為1:10、1:20、1:40、1:80，在后兩種稀釋血清中加入未致敏和致敏明膠顆粒，放置2h。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：U形孔中顆粒呈大環(huán)，有外周凝集現(xiàn)象，外緣多形粗糙。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究中計(jì)量資料和計(jì)數(shù)資料均通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料表示為±s、計(jì)數(shù)資料表示為n、%，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

檢測(cè)結(jié)果顯示：酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀法的第一、第二、第三步的反應(yīng)時(shí)間分別為30min、20min、30min，沒(méi)有與操作說(shuō)明書(shū)的水浴法有明顯差異，而其余的反應(yīng)時(shí)間較傳統(tǒng)水浴法相比較短；且酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀的檢測(cè)結(jié)果顯示加速儀法的靈敏度比水浴法高。

2.2 兩種方法檢出率比較

結(jié)果顯示加速儀法的檢出率與水浴法完全一致（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1.加速儀法與水浴法對(duì)521份血清樣本檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析(n)

2.3 ELISA法與TPPA法的診斷效能比較

結(jié)果顯示：經(jīng)TPPA檢測(cè)出7例抗HIV（+）、514例抗HIV（-），陽(yáng)性率為1.36%（7/521）。ELISA檢測(cè)出HIV（+）6例、抗HIV（-）515例，陽(yáng)性率為1.16%（6/521）。以TPPA結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，ELISA檢測(cè)的準(zhǔn)確率為98.84%（515/521）、靈敏度為85.71%（6/7）、特異度為99.80%（514/515），見(jiàn)表2。

表2.ELISA法與TPPA法的診斷效能比較(n)

3.討論

艾滋病能夠持續(xù)對(duì)人體的免疫系統(tǒng)造成破壞，最后導(dǎo)致患者的死亡，是一種全球性的重大傳染病，艾滋病有極高的病死率與傳染性。正是由于艾滋病具有病死率高與傳染性強(qiáng)的特點(diǎn)，目前艾滋病已經(jīng)不完全是醫(yī)學(xué)上所要面臨的問(wèn)題，更是對(duì)社會(huì)發(fā)展的危害。艾滋病的持續(xù)傳播與增長(zhǎng)已經(jīng)對(duì)社會(huì)和諧穩(wěn)定造成了威脅，成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題現(xiàn)象，需要各界人群對(duì)艾滋病有一個(gè)詳細(xì)認(rèn)知與高度重視[3]。尤其是在我國(guó)當(dāng)前的發(fā)展階段，由于國(guó)內(nèi)文化與國(guó)外文化的發(fā)展，沖擊傳統(tǒng)觀念，致使人們的性觀念逐漸開(kāi)放，從而使艾滋病更加快速的傳播，艾滋病在日常生活中的影響也越來(lái)越嚴(yán)重[4]。由于艾滋病對(duì)人體免疫系統(tǒng)的破壞，患者會(huì)出現(xiàn)各種罕見(jiàn)的感染性疾病與惡性腫瘤的發(fā)病。目前艾滋病還沒(méi)有完全有效的治療藥物與治療方案，當(dāng)感染上艾滋病以后，醫(yī)護(hù)人員也只能通過(guò)高效抗病毒藥物來(lái)對(duì)艾滋病病情進(jìn)行控制緩解，從而讓患者的生命得到延長(zhǎng)[5]。在這樣的情況下，及時(shí)的預(yù)防與檢測(cè)艾滋病患病情況就顯得尤為重要。

在臨床上早期診斷HIV病毒感染中采取血清抗體檢測(cè)，伴隨近幾年醫(yī)療技術(shù)及生物學(xué)等多學(xué)科持續(xù)深入研究，經(jīng)分子生物學(xué)能夠予以檢驗(yàn)，可見(jiàn)雙抗夾心酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法以及快速金標(biāo)法等。其中酶聯(lián)免疫法和膠體硒法屬于臨床較為多見(jiàn)的檢查方法。酶聯(lián)免疫法則是利用酶催化放大作用來(lái)提供抗原抗體反應(yīng)特異性以及敏感性，其對(duì)于檢驗(yàn)環(huán)境、檢驗(yàn)儀器以及操作人員的技術(shù)水平要求較高，且需要嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)以及操作流程，且需要花費(fèi)較長(zhǎng)的檢查時(shí)間。膠體硒法屬于一種快速檢查方法，該方法是經(jīng)利用膠體硒標(biāo)記和免疫層析相結(jié)合，隨后快速固相免疫分析技術(shù)對(duì)樣本血液中HIV抗體予以檢測(cè)，在此方法中整個(gè)檢查流程不需要使用任何儀器，具有操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，但此種方法的環(huán)境溫度要求較高，需要保持在25 C左右，若溫度較低，則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)較慢，極易產(chǎn)生假陽(yáng)性。

隨著克隆技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，ELISA方法更多的應(yīng)用于臨床診斷與醫(yī)學(xué)研究當(dāng)中，提供了更加準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)用于許多疾病的預(yù)防、診斷、治療過(guò)程中。ELISA法是以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法與雙抗原夾心法為原理，以梅毒免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）M和IgG混合體為檢查對(duì)象，重組梅毒螺旋體，讓其在血清中有較高的純度，所以靈敏度和特異度均較高，可以一次性檢測(cè)多個(gè)樣本，再以酶標(biāo)儀為依據(jù)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷。ELISA的操作對(duì)于臨床試驗(yàn)的比重也越來(lái)越大，增加了許多工作量[6]。所以現(xiàn)在科研人員將目光放在如何將ELISA反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間縮短、使檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性更高等方面，這是目前許多科研人員探討的重點(diǎn)。酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀利用免疫結(jié)合反應(yīng)中的抗原抗體結(jié)合部分作為相互補(bǔ)充，各種次級(jí)鍵能夠在凹腔內(nèi)氨基酸側(cè)鍵位置迅速得到產(chǎn)生，同時(shí)能夠?qū)⑴紭O子轉(zhuǎn)動(dòng)與離子遷移帶起免疫分子震動(dòng)的原理進(jìn)行有效利用，有效的增加反應(yīng)體系內(nèi)抗原抗體分子濃度，解除靜態(tài)條件下的擴(kuò)散受限因素，同時(shí)震動(dòng)可使形成的熱氣流能夠使整個(gè)板孔有均勻的受熱效果，使檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性得到提高[7]。在ELISA的反應(yīng)過(guò)程中，由于反應(yīng)是通過(guò)微量反應(yīng)板的圓柱形小孔中進(jìn)行，試劑能夠擁有的固定面較大且靠近穩(wěn)定的固相面，所以有可能造成液相中的配體分子缺失減少，從而導(dǎo)致整個(gè)抗原抗體不能順利到達(dá)胞核，這就是限制擴(kuò)散的原因；同時(shí)因?yàn)槲⒘糠磻?yīng)板上的反應(yīng)孔是以長(zhǎng)方形排列的順序，表現(xiàn)為四個(gè)角的孔乃至四周比中間的孔顯色深，這就是臨床醫(yī)學(xué)中的邊緣效應(yīng)[8]。

本研究結(jié)果顯示：酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀法在HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)中，第一步反應(yīng)30min，第二步反應(yīng)20min為最好的反應(yīng)時(shí)間，顯色反應(yīng)的30min不能進(jìn)行縮減，這可能是由于在顯色反應(yīng)過(guò)程中，抗原抗體不能進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)行反應(yīng)的只有酶分解底物仍為30min[9]。在抗體初篩檢測(cè)結(jié)果中，兩者的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)水浴法相一致，并且酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀法的靈敏度更高[10]。另外，在本次研究中將TPPA結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)計(jì)算ELISA法結(jié)果準(zhǔn)確率為98.84%、靈敏度為85.71%、特異度為99.80%。充分說(shuō)明，在HIV抗體篩查中ELISA法準(zhǔn)確性較高，而且酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀與水浴法能取得相同水平的試驗(yàn)結(jié)果；但是在操作方面，酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀能縮短ELISA檢測(cè)時(shí)間，提升了工作效率。不過(guò)本次研究中，有1例TPPA抗HIV（+）患者經(jīng)ELISA法檢查為抗HIV（－），1例TPPA抗HIV（－）患者經(jīng)ELISA法檢查為抗HIV（+），經(jīng)過(guò)分析主要是因?yàn)槊范咎禺愋钥贵w具有“顯現(xiàn)早、消失晚”的特點(diǎn)，結(jié)果為陽(yáng)性僅能表明，受檢者受到過(guò)梅毒螺旋體感染或正在感染，不能將其作為最終診斷結(jié)果[11]；比如患者已經(jīng)進(jìn)行了治療，還是會(huì)發(fā)現(xiàn)特異性抗體，所以ELISA檢測(cè)呈陽(yáng)性，這就出現(xiàn)了誤診情況。因此，ELISA法是首選的HIV初步篩查方法，為了明確診斷建議多種診斷方法綜合判斷。

綜上所述，在確定各步反應(yīng)最佳時(shí)間的情況下，酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀代替?zhèn)鹘y(tǒng)水浴法進(jìn)行HIV抗體篩選實(shí)驗(yàn)的ELISA法實(shí)驗(yàn)中，能夠使抗原抗體的靈敏度增加，減少檢測(cè)的時(shí)間，能夠在提高靈敏度的同時(shí)也讓檢測(cè)的時(shí)間縮短，增加檢測(cè)效率，有效的判讀檢測(cè)結(jié)果，讓檢測(cè)的工作效率得到大幅提高。