乙肝病毒DNA檢測2種不同核酸提取方法的性能驗證情況分析

董 劍，許小華

（聯(lián)勤保障部隊第909醫(yī)院檢驗科，廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院檢驗科，福建漳州 363000）

0 引言

乙型肝炎也被稱為乙肝，是目前世界上最常見的一類傳染病，據(jù)不完全統(tǒng)計[1]，在全世界范圍每年至少有100萬以上的患者死于乙肝。慢性乙肝攜帶者大約占世界總?cè)丝诘?0%以上，而超過20%的急性乙肝患者會轉(zhuǎn)為慢性乙肝，隨著病情進(jìn)展逐漸發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，因此早期準(zhǔn)確判別乙肝對患者的預(yù)后尤為重要[2]。實時熒光定量PCR檢測乙肝病毒DNA（HBV-DNA）是一種能夠早期診斷乙肝、能夠獲得準(zhǔn)確性較高的檢測結(jié)果并可進(jìn)行量化的檢測方法。在利用熒光定量PCR儀檢測HBV-DNA前，往往需要對臨床標(biāo)本提取樣本DNA。目前，實驗室較常用的提取樣本DNA的方法為手工提取（煮沸法）和核酸全自動提取儀提?。ù胖榉ǎ?。本研究在相同的檢測試劑和核酸擴(kuò)增儀的實驗條件下利用手工法和核酸全自動提取儀法分別提取樣本DNA，并進(jìn)行性能驗證得出實驗數(shù)據(jù)，從而選擇更合適HBVDNA的核酸提取系統(tǒng)，達(dá)到優(yōu)化HBV-DNA檢測流程的目的。

1 資料與方法

1.1 研究資料

選擇2018年1—9月在我院檢驗科分子生物實驗室檢測的臨床樣本血清。所有臨床標(biāo)本均在空腹?fàn)顟B(tài)抽取靜脈血3～5 ml于真空采血管中，3 000 r/min離心10 min分離血清，4～8℃放置12 h待測。

1.2 儀器試劑

實時熒光定量PCR檢測采用美國ABI7500型實時熒光定量PCR儀（Thermo Fisher Scientific公司），檢測試劑用乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法，中山達(dá)安基因）。全自動核酸提取儀采用中山達(dá)安基因公司生產(chǎn)的smart 32型全自動核酸提取儀。手工法提取核酸試劑采用中山達(dá)安公司的DNA提取液；全自動核酸提取儀法提取核酸試劑采用中山達(dá)安公司的核酸提取或純化試劑盒。

1.3 熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)

（1）反應(yīng)體系：50 μl。

（2）ABI7500核酸擴(kuò)增儀上反應(yīng)參數(shù)：93℃2min；93 ℃45 s，55 ℃60 s，10個循環(huán)；93℃ 30 s，55℃ 45 s，30個循環(huán)。

2 實驗設(shè)計

對收集的臨床樣本同時采用手工法和核酸全自動提取儀法提取樣本DNA，依據(jù)《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》，對采用以上2種方法提取的HBVDNA分別進(jìn)行批內(nèi)精密度、批間精密度、正確度、線性范圍驗證。對2種方法的性能驗證結(jié)果進(jìn)行比較。本文中所有實驗操作均依照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進(jìn)行[3]。

2.1 批內(nèi)精密度

收集臨床濃度為2.43×106copies/ml的高值血清樣本和濃度為2.81×103copies/ml的低值血清樣本。高值血清、低值血清樣本由同一操作人員分別利用手工法和核酸全自動提取儀法各提取樣本DNA 10份（共計40份），上機(jī)檢測，結(jié)果取對數(shù)，分別計算高值血清和低值血清利用手工法和核酸全自動提取儀法的批內(nèi)精密度，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.2 批間精密度

采用本實驗室購買的達(dá)安公司生產(chǎn)的高值（強(qiáng)陽性）質(zhì)控血清，濃度為 2.21×106copies/ml，批號為2017006，每個工作日分別用手工法和核酸全自動提取儀法提取DNA后，上機(jī)檢測，檢測結(jié)果取對數(shù)值。采用2018年9月1—30日的質(zhì)控數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計（共計21個質(zhì)控數(shù)據(jù)）。對檢測結(jié)果取對數(shù)值，然后進(jìn)行t檢驗分析。

2.3 正確度

分別利用手工法和核酸全自動提取儀法檢測可溯源的標(biāo)準(zhǔn)品4份（中山達(dá)安，批號20180404），每份標(biāo)準(zhǔn)品分別用不同的核酸提取方法提取3次DNA，然后上機(jī)檢測，結(jié)果取均值。分別計算偏倚：偏倚%=（測量值-理論值）/理論值×100%[4]。偏倚小于±7.5%，表示滿足臨床需求，可以接受[5]。對檢測結(jié)果取對數(shù)值，然后進(jìn)行t檢驗。

2.4 線性范圍

取一份高值血清，濃度為2.43×108copies/ml，將此樣本的濃度當(dāng)作100%。再用正常人血清（乙肝陰性）分別按不同濃度稀釋為 2.43×107、2.43×106、2.43×105、2.43×104、2.43×103、2.43×102copies/ml，每份血清提取HBV-DNA后重復(fù)測定3次，取均值。將實際測量均值的對數(shù)值設(shè)為X，稀釋血清濃度預(yù)測值的對數(shù)值設(shè)為Y，作線性回歸分析[6]。得出回歸方程Y=bX+a，相關(guān)系數(shù)為R2。相關(guān)系數(shù)R2越接近1，說明相關(guān)性越好。

2.5 臨床樣本結(jié)果比對

選取40個樣本（需覆蓋分析測量范圍），分別用手工法和核酸全自動提取儀法提取DNA，然后上機(jī)檢測HBV-DNA濃度，結(jié)果取對數(shù)，計算偏倚，并進(jìn)行直線回歸分析。其偏倚應(yīng)＜±7.5%。

2.6 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 15.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 批內(nèi)精密度

分別比較核酸全自動提取儀法和手工法的臨床樣本高值和低值血清，核酸全自動提取儀法批內(nèi)精密度較手工法變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）更小，其批內(nèi)精密度更好。對以上2種方法提取高、低值血清HBV-DNA進(jìn)行檢測的批內(nèi)精密度結(jié)果分別進(jìn)行t檢驗，P＜0.001，說明2種方法批內(nèi)精密度的差別有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果見表1。

表1 手工法和核酸全自動提取儀法批內(nèi)精密度驗證結(jié)果（n=40）

3.2 批間精密度

手工法和核酸全自動提取儀法的CV值分別為3.29%、2.84%，P＜0.001，2種方法批間精密度的差別有統(tǒng)計學(xué)意義。從測定結(jié)果可以看出全自動核酸提取儀法較手工法CV值更小，其批間精密度更好。具體結(jié)果見表2。

表2 手工法和核酸全自動提取儀法高值質(zhì)控品批間精密度驗證結(jié)果（n=21）

3.3 正確度

手工法和核酸全自動提取儀法檢測結(jié)果取對數(shù)值后偏倚均小于±7.5%，其中核酸全自動提取儀法偏倚比手工法更小，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。具體結(jié)果見表3。

表3 手工法和核酸全自動提取儀法正確度驗證結(jié)果

3.4 線性范圍

全自動核酸提取儀法回歸方程為Y=1.048X-0.281 7，R2=0.985 8；手工法回歸方程為Y=1.020X-0.043 4，R2=0.966 0，對2種方法的相關(guān)系數(shù)分別做t檢驗，P均＜0.01，說明兩者在濃度為 2.43×102～2.43×108copies/ml的范圍內(nèi)線性較好，能滿足臨床需求。具體結(jié)果如圖1、2所示。

圖2 手工法線性分析圖

3.5 臨床樣本結(jié)果比對

分別用手工法和全自動核酸提取儀法檢測40份臨床樣本（覆蓋分析測量范圍），其偏倚均小于±7.5%，相關(guān)性好，回歸方程為Y=1.019 9X+0.045 7，R2=0.912 7。對2種方法檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)進(jìn)行t檢驗，P＜0.01，說明2種方法檢測結(jié)果有顯著的相關(guān)性。具體結(jié)果如圖3所示。

圖3 全自動核酸提取儀法和手工法檢測40份臨床樣本相關(guān)線性分析

4 討論

從本研究的結(jié)果可以看出，全自動核酸提取儀法高值和低值血清的批內(nèi)精密度（CV）分別為1.78%和2.44%，手工法高值和低值血清的批內(nèi)精密度（CV）分別為2.18%和3.76%；用高值質(zhì)控品分別做全自動核酸提取儀法和手工法的批間精密度（CV），結(jié)果分別為2.84%和3.29%；分別用2.0×103、2.0×104、2.0×105、2.0×106copies/ml的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行2種方法的正確度驗證，全自動核酸提取儀法的偏倚分別為-2.37%、-0.95%、0.74%、-1.33%，手工法的偏倚分別為-4.88%、-2.51%、-2.46%、-2.12%。全自動核酸提取儀法的批內(nèi)和批間精密度與手工法相比，CV值更小，其正確度平均偏倚也均小于手工法。其原因可能是由于不同的實驗人員操作習(xí)慣和熟練程度的不同，導(dǎo)致提取DNA的效率也不同。全自動核酸提取儀法提取DNA中途無需人工操作，可以避免由于人員的操作而帶來的結(jié)果的偏差。對2種方法的線性范圍分析和臨床比對實驗可以看出，全自動核酸提取儀法和手工法在較寬的線性范圍內(nèi)均有良好的線性，能夠滿足臨床實驗的要求，二者實驗結(jié)果具有較好的相關(guān)性。

全自動核酸提取儀法提取DNA的原理是磁珠法，其利用磁性硅膠對DNA進(jìn)行特異性吸附，在磁場的作用下分離并獲取DNA，實驗中無需離心和有機(jī)溶劑的使用。手工法提取DNA需要先用沉淀的方法去除蛋白質(zhì)，然后利用高速離心、加熱裂解等方法提取DNA，其實驗步驟較多，實驗過程也難以做到標(biāo)準(zhǔn)化。綜合以上實驗結(jié)果，可以看出采用全自動核酸提取儀法提取DNA，其批內(nèi)精密度和批間精密度均較手工法更好，其重復(fù)性更好。

全自動核酸提取儀法提取核酸需要使用全自動核酸提取儀以及相應(yīng)的提取試劑和配套耗材，而手工法提取核酸無需特殊儀器，耗材的成本也低于全自動核酸提取儀法，全自動核酸提取儀法提取核酸成本要高于手工法提取核酸。但手工法提取核酸每一步加樣本血清和試劑均需手工加入，增加了操作過程中樣本間交叉污染的可能性。本實驗中所使用的smart 32型全自動核酸提取儀提取核酸中途無需手工操作，對于各樣本均有獨立的一次性耗材，從而可以避免操作過程中人為錯誤以及樣本間交叉污染的問題。該型全自動核酸提取儀一次可以提取48份血清樣本，提取時間約30 min，可以很好地滿足小、中型實驗室的需求；而手工法提取48份血清樣本，耗時約50 min?？傮w來說，本實驗中全自動核酸提取儀法提取DNA成本比手工法成本高1～2倍，平均耗時節(jié)約20 min左右，同時可以很好地節(jié)約實驗室的人力資源。

總體來說，從檢測可重復(fù)性、靈敏度、提取效率等方面考慮，全自動核酸提取儀法提取HBV-DNA要優(yōu)于手工法。HBV-DNA檢測相較于其他的乙肝相關(guān)性檢測有窗口期短、特異性好等特點，其動態(tài)變化又可作為抗病毒療效檢測以及抗藥性是否形成的重要指標(biāo)[7]。本實驗中所使用的smart 32型全自動核酸提取儀為國產(chǎn)儀器，相較于進(jìn)口儀器來說，其具有降低醫(yī)院運營成本和推動分級診療的優(yōu)勢[8]。醫(yī)療設(shè)備目前正向著小型化、便攜化的方向發(fā)展[9]，與生化和免疫實驗室相比，分子生物實驗室自動化程度較落后，全自動核酸提取儀法提取HBV-DNA有利于簡化DNA提取流程，有利于分子生物實驗室實現(xiàn)自動化提取核酸。