miR-205對體外膿毒癥心肌細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響

謝 斌 鄧 超 陳栩栩 蘇 醒 王紅梅

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，?？?570203）

膿毒癥主要是指由微生物感染所引起的疾病，其以大量炎癥因子釋放、免疫抑制、細(xì)胞凋亡，最終誘導(dǎo)器官功能衰竭為特征［1］。膿毒癥心肌損傷是膿毒癥致死的重要原因。膿毒癥發(fā)生早期就表現(xiàn)出心肌損傷，包括心肌功能收縮異常、心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變、射血分?jǐn)?shù)降低等等［2］。膿毒癥心肌損傷的發(fā)生機制十分復(fù)雜，與心肌細(xì)胞炎癥因子釋放、氧化損傷、細(xì)胞凋亡等有關(guān)［3］。LPS 是常見的誘導(dǎo)膿毒癥發(fā)生的病原微生物的主要致病成分，其可在體外激活心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，造成心肌損傷［4］。既往研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥心肌損傷中miRNA 的調(diào)控作用十分關(guān)鍵，且miRNA 在心肌細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［5］。miRNA 是一類內(nèi)源性的小分子RNA，可通過調(diào)控下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞和組織器官功能［6］。miR-205 是現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的與腫瘤有關(guān)的調(diào)節(jié)因子，在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、凋亡中發(fā)揮作用［7］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miR-205還與膿毒癥有關(guān)，其在膿毒癥患者的血清中低表達(dá)，且miR-205表達(dá)越低，患者的預(yù)后情況越差［8］。在外界因素刺激引起的心肌損傷中發(fā)現(xiàn)miR-205 降低PM2.5 誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡［9］。NF-κB 信號通路是一個在膿毒癥心肌損傷中具有促進(jìn)作用的誘導(dǎo)因素，其激活可加劇膿毒癥導(dǎo)致的器官功能損傷［10］。目前對于miR-205在膿毒癥心肌細(xì)胞損傷中的作用尚不清楚。本實驗以LPS誘導(dǎo)構(gòu)建體外膿毒癥心肌細(xì)胞損傷模型，研究miR-205 在膿毒癥心肌細(xì)胞凋亡、炎癥因子釋放、氧化損傷中的作用和可能機制，為靶向基因治療膿毒癥提供可能參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SD 雄性大鼠，體質(zhì)量260～280 g，購自海南省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，按照12 h光照以及12 h 黑暗環(huán)境進(jìn)行飼養(yǎng)，不限制飲水以及采食。

1.1.2 細(xì)胞與試劑 大鼠心肌細(xì)胞H9c2購自通派（上海）生物科技有限公司；LDH 檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒、SOD 檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；miRNA 第一鏈cDNA 合成試劑盒購自賽爾瑞成（北京）生命科學(xué)技術(shù)有限公司；SYBR Premix Ex Taq miRNA kit 購自武漢科昊佳生物科技有限公司；TNF-α 檢測試劑盒、IL-6 檢測試劑盒購自深圳子科生物科技有限公司；mimics control、miR-205 mimics 由百奧邁科生物技術(shù)有限公司構(gòu)建合成；C-Caspase-3、NF-κBp65、GAPDH 抗體、二抗購自美國Abcam；GSH-Px 檢測試劑盒購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 膿毒癥大鼠模型構(gòu)建 參照文獻(xiàn)［11］構(gòu)建膿毒癥大鼠模型，步驟簡述為：以10%水合氯醛對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，將大鼠固定在操作臺上，沿腹中線位置在下腹部切開3 cm 的切口，將肌肉分離，找出盲腸，在靠近盲腸末端5 cm 處用絲線結(jié)扎，用9號針頭貫穿盲腸2次，小心擠壓腸管促進(jìn)糞便從穿刺點溢出，將盲腸放回腹腔，關(guān)閉腹腔。手術(shù)結(jié)束以后，皮下注射生理鹽水（劑量為30 ml/kg）補充體液。手術(shù)結(jié)束以后，大鼠禁食，不限制飲水。將構(gòu)建成功的膿毒癥大鼠模型記為膿毒癥組，同時設(shè)置正常組，正常組大鼠只進(jìn)行盲腸探查術(shù)，不進(jìn)行結(jié)扎。淘汰造模過程中死亡的大鼠，膿毒癥大鼠模型10 只中死亡1 只（死亡率為10%），將正常組的10 只大鼠中隨機淘汰1 只，兩組大鼠各剩余9 只。造模后12 h，取大鼠心肌組織用于后續(xù)實驗。

1.2.2 qRT-PCR 方法分析miR-205 表達(dá) 分別用Trizol 試劑提取心肌組織中的總RNA，然后在RNA內(nèi)添加無RNA 酶水溶解RNA，RNA 置于-20 ℃條件下備用。本次實驗采用miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系包括：1μl Stem-loop primer、4 μl miRNA、10 μl 2×miRNA L-RT Solution mix、1.5μl miRNA L-RT Enzyme mix，然后用RNasefree water 補充總體積至20 μl，均勻混合后置于16 ℃條件下溫浴30 min，然后以37 ℃條件溫浴30 min，在85 ℃條件下反應(yīng)5 min，將合成的cDNA置于-20 ℃?zhèn)溆谩０凑誗YBR Premix Ex Taq miRNA kit進(jìn)行PCR 反應(yīng)，PCR 反應(yīng)的體系包括：1 μl Reverse Primer、1μl cDNA、12.5μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、1 μl Forward Primer，然后用ddH2O 補充至25 μl，PCR 儀反應(yīng)的程序設(shè)置如下：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，55 ℃30 s，一共進(jìn)行45 個循環(huán)，把U6 設(shè)置成內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分別計算miR-205 的表達(dá)變化。本次PCR 使用的引物序列為：U6 正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACCCTTCACGAATTTGCGT-3'；miR-205 正向引物5'-GCCGTCCTTCATTCCACCG-3'，反向引物5'-TGCAGGGTCCGAGGTAT-3'。

1.2.3 TNF-α、IL-6 水平檢測 收集心肌組織，ELISA法檢測TNF-α、IL-6水平，步驟分別按照TNF-α檢測試劑盒和IL-6檢測試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.2.4 TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡 將心肌組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)方法制備5μm 厚的切片，用二甲苯洗滌2 次，在梯度乙醇中浸泡1 次，分別滴加Proteinase K 溶液繼續(xù)孵育20 min，加入50μl TUNEL 溶液，置于暗濕盒中反應(yīng)1 h。最后添加50 μl converter-POD，放在暗濕盒內(nèi)反應(yīng)30 min。以DAB 染色，以蘇木素復(fù)染之后計數(shù)細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及分組 大鼠心肌細(xì)胞H9c2分為Control 組、LPS 組、miR-NC+LPS 組和miR-205+LPS 組，其中LPS、miR-NC+LPS、miR-205+LPS 組細(xì)胞分別在實驗開始時培養(yǎng)在含有1 mg/L LPS的細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)，miR-NC+LPS、miR-205+LPS 組心肌細(xì)胞在LPS 培養(yǎng)之前，需轉(zhuǎn)染mimics control、miR-205 mimics，Control 組細(xì)胞不做處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法和具體操作步驟按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000說明書進(jìn)行。培養(yǎng)24 h 后，收集各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液上清，按照1.2.3方法檢測TNF-α、IL-6水平。

1.2.6 CCK-8 方法檢測細(xì)胞凋亡 將各組心肌細(xì)胞分別接種至96 孔板，接種濃度約3×104個/ml，將細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后取出培養(yǎng)板，分別在每孔內(nèi)添加10μl的CCK-8溶液，將細(xì)胞板置于孔板振蕩儀內(nèi)充分混合1 min，再把細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。取出培養(yǎng)板后用酶標(biāo)儀檢測每孔的OD 值，計算存活率：存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組培養(yǎng)24 h 后的心肌細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，配制成濃度為5×105個/ml的細(xì)胞懸液。用移液槍分別吸取1 ml的細(xì)胞懸浮液于離心管內(nèi)，800 g 離心10 min，繼續(xù)在細(xì)胞沉淀中添加200 μl 的結(jié)合緩沖溶液，再吸取5μl的Annexin V-FITC 以及5μl的PI染色液至細(xì)胞中，混合溶液避光在室溫下結(jié)合10 min。然后再次添加300μl 的結(jié)合緩沖溶液，利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.8 Western blot 分析C-Caspase-3、NF-κBp65 蛋白表達(dá) 收集各組培養(yǎng)24 h 后的心肌細(xì)胞，PBS 潤洗2次，添加RIPA裂解試劑，放在冰上充分裂解反應(yīng)20 min。取蛋白樣品，根據(jù)BCA方法測定濃度后，在蛋白內(nèi)緩緩加入與蛋白溶液等體積的2×Loading Buffer，100 ℃煮沸5 min，促進(jìn)蛋白變性。然后按照常規(guī)方法配制SDS-PAGE 凝膠（分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%），分別吸取40 μg 的蛋白添加到點樣孔中，打開電源，首先按照80 V 的條件在濃縮膠中電泳，在溴酚藍(lán)即將要到達(dá)分離膠時，更換為120 V 的電壓繼續(xù)電泳，在溴酚藍(lán)染料已經(jīng)到達(dá)底部以后，關(guān)閉電源。將凝膠取出，然后和裁剪以后的NC膜放在轉(zhuǎn)移緩沖液內(nèi)備用。設(shè)置250 mA的恒流進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜操作需要在冰上進(jìn)行。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC 膜置于封閉液（5%牛血清白蛋白）中，放在室溫下結(jié)合1 h。NC 膜放在抗體孵育袋內(nèi)，一抗C-Caspase-3、NF-κBp65 抗體按照1∶500、1∶800 進(jìn)行稀釋，4 ℃過夜孵育，再用二抗用封閉液按照1∶2 000進(jìn)行稀釋，孵育1 h，然后按照ECL 方法進(jìn)行顯色。利用軟件分析各條帶的灰度值，并將GAPDH 作為參照，分析目的蛋白的表達(dá)水平。

1.2.9 LDH、MDA、SOD、GSH-Px 水平檢測 收集各組培養(yǎng)24 h 后的培養(yǎng)液上清和心肌細(xì)胞，檢測培養(yǎng)液上清中LDH 水平，檢測細(xì)胞中MDA、SOD、GSH-Px 水平，操作步驟分別按照LDH 檢測試劑盒（二硝基苯肼法）、MDA 檢測試劑盒（硫代巴比妥酸法）、SOD 檢測試劑盒（黃嘌呤法）、GSH-Px檢測試劑盒說明書進(jìn)行（比色法）。

1.2.10 NF-κB 信號激活劑對miR-205 的作用檢測 經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-205 mimics 的心肌細(xì)胞用1 mg/L LPS和1μmol/L的NF-κB信號激活劑PMA的培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為miR-205+PMA+LPS 組，設(shè)置miR-205+LPS組為參照，按照上述相關(guān)方法檢測細(xì)胞增殖、凋亡和C-Caspase-3、NF-κBp65蛋白表達(dá)和LDH、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS21.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用±s表示，兩組數(shù)據(jù)間比較用t檢驗，多組差異比較用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-205 在膿毒癥大鼠心肌組織中低表達(dá)與正常組相比，膿毒癥大鼠模型心肌組織中miR-205 表達(dá)水平降低，心肌組織中TNF-α、IL-6 水平升高，細(xì)胞凋亡指數(shù)升高。見表1。提示膿毒癥大鼠心肌組織中炎癥因子水平增加，細(xì)胞凋亡增多，miR-205在膿毒癥大鼠心肌組織中低表達(dá)。

表1 膿毒癥大鼠心肌組織中miR-205 表達(dá)水平、炎癥因子和細(xì)胞凋亡指數(shù)（±s，n=10）Tab.1 Expression level of miR-205，inflammatory fac?tors and apoptosis index in myocardial tissue of sepsis rats（±s，n=10）

表1 膿毒癥大鼠心肌組織中miR-205 表達(dá)水平、炎癥因子和細(xì)胞凋亡指數(shù)（±s，n=10）Tab.1 Expression level of miR-205，inflammatory fac?tors and apoptosis index in myocardial tissue of sepsis rats（±s，n=10）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05.

Apoptosis index/%5.18±0.26 39.56±4.251）24.223<0.001 Groups Normal Sepsis tP miR-205 1.00±0.11 0.56±0.061）10.535<0.001 TNF-α/（pg·g-1）90.65±75.16 226.14±12.941）5.330<0.001 IL-6/（pg·g-1）156.27±13.84 497.22±17.231）46.282<0.001

2.2 miR-205 mimics 對LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖和凋亡影響 與Control 組相比，LPS 組心肌細(xì)胞中miR-205 水平降低，細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中C-Caspase-3 蛋白表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與miR-NC+LPS 組相比，miR-205+LPS 組心肌細(xì)胞中miR-205 水平升高，細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞中C-Caspase-3 蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1和表2。提示miR-205 mimics 提高LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖活性，抑制細(xì)胞凋亡。

表2 miR-205 mimics轉(zhuǎn)染后LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活率、凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平（±s，n=9）Tab.2 Effects of miR-205 mimics on LPS-induced cardiomyocyte survival rate，apoptosis rate and C-Caspase-3 protein level（±s，n=9）

表2 miR-205 mimics轉(zhuǎn)染后LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活率、凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平（±s，n=9）Tab.2 Effects of miR-205 mimics on LPS-induced cardiomyocyte survival rate，apoptosis rate and C-Caspase-3 protein level（±s，n=9）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with miR-NC+LPS group，2）P<0.05.

miR-205 1.00±0.09 0.53±0.041）0.52±0.06 1.15±0.122）135.942<0.001 Groups Control LPS miR-NC+LPS miR-205+LPS FP Survival rate/%100.00±10.23 52.03±6.411）53.18±5.59 75.20±6.332）84.742<0.001 Apoptosis rate/%5.69±0.41 34.15±2.691）35.17±2.74 15.36±1.252）458.731<0.001 C-Caspase-3 protein 0.26±0.03 0.85±0.081）0.86±0.07 0.46±0.052）216.338<0.001

圖1 miR-205 mimics 轉(zhuǎn)染后LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡變化Fig. 1 Changes of cardiomyocyte apoptosis induced by LPS after miR-205 mimics transfection

2.3 miR-205 mimics 對LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷影響 與Control 組相比，LPS 組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH 水平升高，細(xì)胞中MDA 水平升高，SOD、GSH-Px 水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與miR-NC+LPS 組相比，miR-205+LPS 組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH 水平降低，細(xì)胞中MDA水平降低，SOD、GSH-Px 水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。提示miR-205 mimics 減弱LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷。

表3 miR-205 mimics 對LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞LDH、MDA、SOD、GSH-Px 水平的影響（±s，n=9）Tab.3 Effects of miR-205 mimics on LPS-induced levels of LDH，MDA，SOD and GSH-Px in cardiomyocytes（±s，n=9）

表3 miR-205 mimics 對LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞LDH、MDA、SOD、GSH-Px 水平的影響（±s，n=9）Tab.3 Effects of miR-205 mimics on LPS-induced levels of LDH，MDA，SOD and GSH-Px in cardiomyocytes（±s，n=9）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with miR-NC+LPS group，2）P<0.05.

GSH-Px/（U·g-1）569.37±41.02 227.48±13.501）224.91±14.02 334.17±28.142）330.340<0.001 Groups Control LPS miR-NC+LPS miR-205+LPS FP LDH/（U·L-1）4.77±0.41 32.01±2.561）31.40±3.69 13.84±1.122）301.819<0.001 MDA/（μmol·g-1）9.86±0.78 26.32±2.211）25.78±2.30 16.74±1.312）178.941<0.001 SOD/（U·g-1）185.22±15.32 102.30±8.461）101.20±10.27 159.64±13.322）108.426<0.001

2.4 miR-205 mimics 對LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞分泌炎癥因子影響 與Control 組相比，LPS 組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6 水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與miR-NC+LPS 組相比，miR-205+LPS組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4。提示miR-205 mimics減弱LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥因子釋放。

表4 miR-205 mimics 轉(zhuǎn)染后LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6水平（±s，n=9）Tab.4 Levels of TNF-α and IL-6 in culture supernatant of cardiomyocytes induced by LPS after miR-205 mimics transfection（±s，n=9）

表4 miR-205 mimics 轉(zhuǎn)染后LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6水平（±s，n=9）Tab.4 Levels of TNF-α and IL-6 in culture supernatant of cardiomyocytes induced by LPS after miR-205 mimics transfection（±s，n=9）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with miRNC+LPS group，2）P<0.05.

IL-6/（ng·L-1）512.02±43.26 1 684.20±126.021）1 689.14±152.78 1 034.63±65.792）256.464<0.001 Groups Control LPS miR-NC+LPS miR-205+LPS tP TNF-α/（ng·L-1）85.99±7.16 190.86±13.691）191.77±16.48 113.03±10.542）169.836<0.001

2.5 miR-205對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中NF-κB信號通路的影響 與Control 組相比，LPS 組心肌細(xì)胞中NF-κBp65 蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與miR-NC+LPS組相比，miR-205+LPS組心肌細(xì)胞中NF-κBp65蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2 和表5。提示miR-205 mimics減弱LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中NF-κB信號。

圖2 Western blot法分析miR-205 mimics轉(zhuǎn)染后LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中NF-κBp65蛋白表達(dá)水平Fig.2 Western blot analysis of NF-κBp65 protein expres?sion in cardiomyocytes induced by LPS after miR-205 mimics transfection

表5 miR-205 mimics 轉(zhuǎn)染后LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中NFκBp65蛋白水平（±s，n=9）Tab.5 NF-κBp65 protein level in cardiomyocytes induced by LPS after miR-205 mimics transfection（±s，n=9）

表5 miR-205 mimics 轉(zhuǎn)染后LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中NFκBp65蛋白水平（±s，n=9）Tab.5 NF-κBp65 protein level in cardiomyocytes induced by LPS after miR-205 mimics transfection（±s，n=9）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with miRNC+LPS group，2）P<0.05.

NF-κBp65 protein 0.26±0.03 0.77±0.091）0.80±0.06 0.39±0.042）186.338<0.001 Groups Control LPS miR-NC+LPS miR-205+LPS FP

2.6 NF-κB信號通路激活劑對miR-205調(diào)控的LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、氧化損傷及炎癥因子釋放的影響 與miR-205+LPS 組相比，miR-205+PMA+LPS組心肌細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高，細(xì)胞中C-Cas?pase-3、NF-κBp65蛋白水平升高，上清中LDH、TNF-α、IL-6水平升高，細(xì)胞中MDA 水平升高，SOD、GSH-Px水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表6 和圖3。提示NF-κB 信號通路激活劑逆轉(zhuǎn)miR-205 調(diào)控的LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、氧化損傷以及炎癥因子釋放作用。

圖3 NF-κB 信號激活劑對上調(diào)miR-205 影響LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用Fig.3 Effect of NF-κB signal activator on up-regulation of miR-205 and LPS-induced cardiomyocyte apoptosis

表6 miR-205 mimics 轉(zhuǎn)染以后LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活率、凋亡率和C-Caspase-3、NF-κBp65 蛋白水平以及LDH、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6水平（±s，n=9）Tab.6 LPS-induced cardiomyocyte survival rate，apoptosis rate，C-Caspase-3，NF-κBp65 protein levels and LDH，MDA，SOD，GSH-Px，TNF-α，IL-6 levels after miR-205 mimics transfection level（±s，n=9）

表6 miR-205 mimics 轉(zhuǎn)染以后LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活率、凋亡率和C-Caspase-3、NF-κBp65 蛋白水平以及LDH、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6水平（±s，n=9）Tab.6 LPS-induced cardiomyocyte survival rate，apoptosis rate，C-Caspase-3，NF-κBp65 protein levels and LDH，MDA，SOD，GSH-Px，TNF-α，IL-6 levels after miR-205 mimics transfection level（±s，n=9）

Note：Compared with miR-205+LPS group，1）P<0.05.

Groups LDH/（U·L-1）MDA/（μmol·g-1）SOD/（U·g-1）GSH-Px/（U·g-1）TNF-α/（ng·L-1）IL-6/（ng·L-1）Survival rate/%Apoptosis rate/%C-Caspase-3 protein NF-κBp65 protein miR-205+LPS miR-205+PMA+LPS 100.00±9.56 14.87±1.39 0.45±0.04 0.36±0.03 12.47±1.23 15.84±1.66 160.84±15.58 320.62±20.99 110.86±9.96 1 010.22±114.50 63.25±5.201）28.45±2.261）0.73±0.071）0.78±0.051）26.14±2.311）20.10±1.201）120.84±10.641）240.16±16.731）188.74±15.231）1 472.30±124.861）tP 12.131<0.001 15.355<0.001 10.419<0.001 21.609<0.001 15.670<0.001 6.239<0.001 6.360<0.001 8.993<0.001 12.839<0.001 8.138<0.001

3 討論

miRNA 有多種作用，在機體疾病發(fā)生、正常胚胎發(fā)育等過程中均有調(diào)控功能。miRNA 沒有開放閱讀框，長度在20 nt 左右，其在多種生物體內(nèi)普遍表達(dá)［12］。miRNA 和人類疾病的關(guān)系已經(jīng)有很多研究報道，例如，miRNA 通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲、生長、凋亡影響腫瘤進(jìn)程，miRNA 還與動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、關(guān)節(jié)炎等有關(guān)［13］。近些年來，很多研究證明在膿毒癥心肌損傷中同樣存在miRNA 的異常表達(dá)，且miRNA 還可能是膿毒癥治療的靶點［5］。miR-205 是一個參與調(diào)控腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)因子，與腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡等有關(guān)［7］。后續(xù)研究證明，miR-205 還和膿毒癥有關(guān)，其在膿毒癥患者中低表達(dá)與其預(yù)后不良具有相關(guān)性［8］。在PM2.5誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中發(fā)現(xiàn)miR-205 表達(dá)下調(diào)，而上調(diào)miR-205抑制心肌細(xì)胞凋亡［9］。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥大鼠心肌組織中miR-205 表達(dá)下調(diào)，而且miR-205 在LPS 誘導(dǎo)的體外膿毒癥心肌細(xì)胞損傷模型中也表達(dá)下調(diào)，LPS 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖抑制和促進(jìn)凋亡，而上調(diào)miR-205能夠提高心肌細(xì)胞增殖活性，減少細(xì)胞凋亡，這說明miR-205 在膿毒癥心肌損傷中可能發(fā)揮保護(hù)作用。

膿毒癥的發(fā)生是一個極為復(fù)雜的過程，其造成的心肌損傷與細(xì)胞凋亡、炎癥因子釋放、氧化損傷等具有密切關(guān)系［14］。研究顯示，膿毒癥條件下，大量的TNF-α、IL-6 等炎癥因子能夠誘導(dǎo)機體內(nèi)產(chǎn)生過多的氧自由基，加上抗氧化酶如SOD、GSH-Px 的活性下降，這些氧自由基并不能被及時清除，進(jìn)而聚集在細(xì)胞內(nèi)［15］。過量的氧自由基不僅會造成氧化損傷，還會激活細(xì)胞凋亡，首先，氧自由基能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)發(fā)生過氧化，產(chǎn)生MDA，同時脂質(zhì)是細(xì)胞膜的主要成分，這就導(dǎo)致了細(xì)胞膜被破壞，原本存在于細(xì)胞內(nèi)的LDH 被釋放至細(xì)胞外，因此，檢測MDA 和LDH 水平的變化能夠間接反映細(xì)胞氧化損傷程度［16］。其次，氧自由基還可以激活細(xì)胞內(nèi)的Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［17］。Caspase-3 是Caspase 蛋白家族成員之一，其活化形成剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，CCaspase-3）后可以不可逆地催化細(xì)胞凋亡發(fā)生［18］。本實驗表明，miR-205 能夠抑制LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中C-Caspase-3 的表達(dá)，減少TNF-α、IL-6 釋放，降低MDA 和LDH 水平，提高SOD、GSH-Px 水平，提示miR-205 具有抑制LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、氧化損傷和炎癥因子釋放的作用。

NF-κB 信號通路是炎癥反應(yīng)的經(jīng)典信號通路，其被激活后可以誘導(dǎo)下游一系列炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎癥損傷［19］。另外，NF-κB 信號還參與細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激過程。NF-κBp65 是NF-κB 信號的關(guān)鍵亞單位，也是其激活水平的標(biāo)志［20-21］。既往研究已經(jīng)證明，NF-κB 信號活化促進(jìn)膿毒癥損傷，而抑制NF-κB信號活化可改善膿毒癥多器官損傷［22-23］。本研究表明，miR-205 降低LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中NF-κBp65蛋白表達(dá)水平，而NF-κB 信號激活劑逆轉(zhuǎn)miR-205對LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、氧化損傷和炎癥因子釋放作用，提示miR-205 作用機制可能與NF-κB有關(guān)。

綜上，miR-205 在膿毒癥心肌組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-205 可能通過作用于NF-κB 信號通路抑制LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、氧化損傷和炎癥因子釋放，目前對miR-205 是通過何種機制影響NF-κB 信號通路進(jìn)而調(diào)控心肌損傷的機制還不清楚，課題組在以后實驗中會進(jìn)行詳細(xì)探討。本實驗結(jié)果為研究miR-205 在膿毒癥心肌損傷中的作用提供了參考，為靶向基因治療膿毒癥心肌損傷提供了資料。