基于生物信息學(xué)分析膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中RUNX1基因的表達(dá)及臨床意義*

陳亞倫，宋 彥

(南陽市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 南陽 473012)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)也稱為多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，其生長迅速、侵襲性強(qiáng)，是成人最常見的惡性腦腫瘤。與其他固體腫瘤不同，GBM能夠廣泛地侵犯周圍腦組織而很少發(fā)生轉(zhuǎn)移[1]。目前，GBM的標(biāo)準(zhǔn)治療包括外科手術(shù)切除和替莫唑胺聯(lián)合放射治療。但是，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)治療的腫瘤患者，病情仍然會進(jìn)一步發(fā)展，導(dǎo)致患者的中位生存期和無疾病進(jìn)展期明顯縮短，分別僅為16、7個月，其5年生存率不超過9.8%[2-4]。另外，GBM發(fā)生的分子機(jī)制仍然不是很清楚。因此，深入研究GBM惡性生長與侵襲的分子機(jī)制，對于研發(fā)新的治療方法和藥物，以及改善GBM患者的生存預(yù)后具有重要意義。

本研究通過對GBM相關(guān)的三組基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵的促癌基因 Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(RUNX1)。RUNX1是RUNX轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，主要參與細(xì)胞的增殖和分化等過程[5]。已有研究表明，RUNX1在多種人類腫瘤中異常表達(dá)，比如乳腺癌、前列腺癌和肺癌等，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[6-8]。但是，RUNX1在GBM中的作用仍少有報道，因此，本研究通過生物信息數(shù)據(jù)庫挖掘的方法，尋找GBM的潛在預(yù)后指標(biāo)或分子標(biāo)志物，并初步分析了RUNX1的表達(dá)與GBM發(fā)生的關(guān)系及作用機(jī)制，以期能夠?yàn)镚BM的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料來源 檢索GEO數(shù)據(jù)庫中GBM基因芯片。通過GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行檢索和篩選[9]，得到GBM相關(guān)的基因芯片GSE50161、GSE108476和GSE15824。它們均來源于相同的平臺GPL570 ([HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)。GSE50161含34例腫瘤組織和13例正常組織。GSE108476含221例腫瘤組織和28例正常組織。GSE15824含12例腫瘤組織和2例正常組織。三組芯片共含有GBM組織樣本267例和正常對照組織樣本43例。

1.2方法

1.2.1篩選差異表達(dá)的基因和繪制文恩圖 使用GEO數(shù)據(jù)庫中的GEO2R工具進(jìn)行分析，分為GBM組和正常對照組進(jìn)行比較。下載并整理GEO2R的所有結(jié)果數(shù)據(jù)。兩組間基因表達(dá)差異2倍以上(logFC>2或logFC<-2)且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，認(rèn)為是基因差異表達(dá)顯著。使用文恩圖在線分析軟件(Venny2.1.0)分析三組芯片的上調(diào)和下調(diào)差異基因，同時取交集，篩選出共同的差異表達(dá)基因。

1.2.2GBM和正常組織中差異基因的表達(dá)及生存預(yù)后分析 通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析工具：GEPIA在線工具分析差異基因在GBM和正常組織中的表達(dá)、生存預(yù)后及相關(guān)性表達(dá)?；虮磉_(dá)譜交互分析(GEPIA)數(shù)據(jù)庫是整合了TCGA 癌癥大數(shù)據(jù)與 GTEx 正常組織大數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)技術(shù)深入挖掘相關(guān)數(shù)據(jù)，并對基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行動態(tài)分析的TCGA可視化工具[10]。通過檢索目的差異基因，選擇GBM組織進(jìn)行分析，可獲得目的基因的表達(dá)情況、生存預(yù)后及基因相關(guān)性分析。

1.2.3目的基因的轉(zhuǎn)錄因子分析 JASPAR數(shù)據(jù)庫(http://jaspar.genereg.net/)是一種高質(zhì)量，非冗余轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫，涵蓋了源于已經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的真核生物轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等信息[11]。通過分析RUNX1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的序列特征及補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子I(CFⅠ)基因的啟動子序列特征，檢測RUNX1與CFⅠ之間是否存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系。

1.2.4單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)分析 腫瘤免疫單細(xì)胞中心(TISCH)是一個專注于腫瘤微環(huán)境(TME)的scRNA-seq數(shù)據(jù)庫(http://tisch.comp-genomics.org/home/)，其對單細(xì)胞水平提供了詳細(xì)的細(xì)胞類型注釋，使不同癌癥類型的TME得以探索[12]。通過TISCH數(shù)據(jù)庫，選擇GBM進(jìn)行分析，在單細(xì)胞層面檢測RUNX1在GBM微環(huán)境中的表達(dá)情況。

1.2.5蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 GeneMANIA (http://genemania.org/)是構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)工具Cytoscape中的插件，具有預(yù)測基因的功能和構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)的功能[13]。輸入RUNX1基因，獲得RUNX1的相互作用蛋白，并選擇KEGG pathway輸出其參與的信號通路。

1.2.6細(xì)胞培養(yǎng) GBMU87MG細(xì)胞株采用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基(DMEM)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱的條件為溫度37℃、5%濃度CO2。于細(xì)胞增殖對數(shù)期進(jìn)行換液處理。

1.2.7熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)(RT-qPCR) 根據(jù)說明書，使用Trizol試劑提取細(xì)胞的總RNA，分光光度計檢測RNA的純度和濃度，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，反轉(zhuǎn)RNA為cDNA。然后進(jìn)行實(shí)時RT-PCR擴(kuò)增。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。計算反應(yīng)c(t)值及目的基因的相對表達(dá)量。每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。引物序列如下：GAPDH上游5′-TGC CAC TCA GAA GAC TGT GG-3′，下游5′- TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT；CTNNB1上游5′-GAA AAT GGT TGC CTT GCT-3′，下游5′-GAT GAG CTT GCT TTC TTG G-3′；MYC上游5′-GCC AGA GGA GGA ACG AG-3′，下游5′-GCT TGG ACG GAC AGG AT-3′；CD44上游5′- CAA GCC ACT CCA GGA CAA GG -3′，下游5′- ATC CAA GTG AGG GAC TAC AAC AG -3′。GAPDH為內(nèi)參。

1.2.8siRNA轉(zhuǎn)染干擾RUNX1的表達(dá) 在細(xì)胞生長匯合度達(dá)到40%左右時，進(jìn)行siRNA的轉(zhuǎn)染操作。使用無血清培養(yǎng)基分別預(yù)混siRNA和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，然后將siRNA和Lipofectamine 2000進(jìn)行混勻，室溫靜置5 min后，加入細(xì)胞培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染細(xì)胞，8 h后更換新鮮培養(yǎng)基，24 h后進(jìn)行細(xì)胞RNA的提取和干擾效率檢測。RUNX1 siRNA序列為：5′-CCA GGU UGC AAG AUU UAA UTT-3′。

1.2.9細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 收集處理后的細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為每100微升500個細(xì)胞，每組細(xì)胞樣品每天設(shè)置3個重復(fù)，96孔板中加入100 μL的細(xì)胞懸液，放于細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。每天固定時間點(diǎn)進(jìn)行檢測，加入10 μL的CCK-8試劑，于細(xì)胞孵育箱中孵育2 h。于酶標(biāo)儀中測量450 nm處的吸光度值(A)，連續(xù)測量5 d并繪制細(xì)胞增殖曲線。

2 結(jié) 果

2.1分析并篩選GBM和正常腦組織中的差異基因 分析GEO數(shù)據(jù)庫中GSE50161、GSE108476和GSE15824三組GBM相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)，并下載相關(guān)的表達(dá)數(shù)據(jù)。選取差異倍數(shù)2倍以上，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的基因?yàn)椴町惢颉Ｍㄟ^GEO2R的在線分析工具，篩選得到三組基因芯片的差異基因。在GSE50161芯片中篩選得到差異基因共2 117個，上調(diào)的差異基因有876個，下調(diào)的有1 241個；在GSE108476芯片中共得到差異基因1 393個，上調(diào)的差異基因有445個，下調(diào)的有948個；在GSE15824芯片中發(fā)現(xiàn)差異基因共1 152個，上調(diào)的差異基因有564個，下調(diào)的有588個。通過維恩圖工具(Venn)對三組芯片的差異基因取交集，結(jié)果得到共表達(dá)的差異基因20個，其中8個基因表達(dá)上調(diào)：TMEM39A、PXDN、PRRX1、RUNX1、TGIF2、CFⅠ、AJUBA和LAMA4；12個基因表達(dá)下調(diào)：SLC6A15、CLCN4、CHN2、OR2L1、ENPP2、RGS11、ANKS1B、KIAA1107、PDE1A、SPNS2、ATP8A1和ANKRD29。

2.2TCGA數(shù)據(jù)庫分析差異基因在GBM中的表達(dá) 通過TCGA數(shù)據(jù)分析工具GEPIA，在163例GBM組織和207例正常對照組織中，分析上調(diào)的差異基因表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TMEM39A、PXDN、PRRX1、RUNX1、TGIF2、CFⅠ、AJUBA和LAMA4這8個基因在GBM組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

與正常對照組織比較，aP<0.05。

2.3基因RUNX1和CFⅠ表達(dá)對GBM患者臨床預(yù)后的影響 通過GEPIA數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析這些差異基因的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8個上調(diào)的差異基因中，只有RUNXI和CFⅠ基因?qū)δ[瘤患者的生存預(yù)后有顯著相關(guān)性[相關(guān)系數(shù)(r)=0.6，P<0.05]，即RUNX1和CFⅠ高表達(dá)的腫瘤患者總生存期和無疾病進(jìn)展期比低表達(dá)的患者明顯縮短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。這些結(jié)果提示RUNX1和CFⅠ高表達(dá)預(yù)示GBM患者的臨床預(yù)后較差。

A.GBM患者總生存期(RUNX1基因)；B.GBM患者無疾病進(jìn)展期(RUNX1基因)；C.GBM患者總生存期(CFⅠ基因)；B.GBM患者無疾病進(jìn)展期(CFⅠ基因)。

2.4RUNX1可能在轉(zhuǎn)錄水平上影響CFⅠ基因的表達(dá) 通過JASPAR轉(zhuǎn)錄因子分析數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，CFⅠ基因中具有RUNX1結(jié)合的位點(diǎn)(圖3A)。另外，通過分析TISCH單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)庫，可見RUNX1在免疫細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中均呈高表達(dá)(圖3B)。這些結(jié)果表明，RUNX1可能通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)CFⅠ的表達(dá)進(jìn)而影響免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。

A.轉(zhuǎn)錄因子RUNX1結(jié)合的核苷酸位點(diǎn)，以及JASPAR結(jié)果顯示CFⅠ基因中RUNX1可以結(jié)合的核酸位點(diǎn)；B.GSE131928，GSE141982和GSE84465的單細(xì)胞測序芯片中，RUNX在免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平。

2.5RUNX1參與調(diào)節(jié)的信號通路網(wǎng)絡(luò) 通過GeneMANIA蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫及KEGG pathway進(jìn)一步分析RUNX1參與調(diào)節(jié)的生物學(xué)過程。結(jié)果顯示，RUNX1能夠與細(xì)胞分裂蛋白激酶6(CDK6)、癌基因MYC、癌基因CBFB等20種蛋白存在相互作用，主要參與的生物學(xué)過程有：調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化、DNA綁定、補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞黏附和NOD樣受體信號通路等。

2.6RUNX1調(diào)節(jié)Wnt信號通路促進(jìn)GBM的增殖 鑒于RUNX1參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖，以及上述相互作用網(wǎng)絡(luò)分析得到了其相互作用的蛋白。本研究初步分析了其可能調(diào)控的增殖的相關(guān)信號通路。通過TCGA數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)RUNX1與Wnt信號通路的核心蛋白β-catenin具有明顯的正相關(guān)性(r=0.21，P<0.05)，且RUNX1與Wnt信號的下游靶基因CD44和MYC也具有顯著的正相關(guān)性(r=0.43，P<0.05；r=0.22，P<0.05)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證RUNX1是否參與Wnt信號通路的調(diào)節(jié)，本研究在GBM細(xì)胞中敲低RUNX1，RT-qPCR結(jié)果顯示RUNX1被干擾后，Wnt通路的下游分子β-catenin(基因名CTNNB1)及下游靶基因MYC和CD44 的mRNA水平也明顯下調(diào)(圖4A)。另外，通過CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RUNX1下調(diào)明顯抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖(圖4B)。這些結(jié)果表明，RUNX1可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號促進(jìn)GBM的進(jìn)展。

A.敲低RUNX1對CTNNB1、MYC和CD44的mRNA表達(dá)影響；B.CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測敲低RUNX1對細(xì)胞增殖的影響；與正常對照組比較，aP<0.05。

3 討 論

GBM是膠質(zhì)瘤中惡性程度最高的類型，盡管GBM的發(fā)病率約為3.19/10萬人，但是由于其復(fù)雜的生物學(xué)特征和有限的治療方法，致使其臨床預(yù)后極差[14]。即使經(jīng)過手術(shù)或者放射治療，這種腫瘤仍會侵犯周圍正常的腦組織，導(dǎo)致病情的進(jìn)展或復(fù)發(fā)[15]。因此，亟須深入研究GBM的發(fā)病機(jī)制，這對于制定有效的治療策略和改善患者預(yù)后具有非常重要的臨床意義。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，基因表達(dá)上調(diào)發(fā)揮著促進(jìn)腫瘤的作用，因此在臨床上更有利于檢測和診斷腫瘤。鑒于此，本研究主要分析GBM中上調(diào)的差異表達(dá)基因。

近年來，基因組分析和高通量測序技術(shù)的進(jìn)展，使得學(xué)者們能夠更全面和深入地理解GBM的發(fā)病機(jī)制，并鑒定潛在的GBM預(yù)后和治療的新靶點(diǎn)。本研究通過對三組GBM基因芯片(包含267例腫瘤組織和43例正常腦組織)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在GBM中異常高表達(dá)的基因RUNX1和CFⅠ。RUNX1是一種十分重要的轉(zhuǎn)錄因子，其在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和造血細(xì)胞的形成中具有重要的調(diào)控作用。其最早是在髓系白血病中被發(fā)現(xiàn)，發(fā)揮抑癌的作用[16]。但是，新的研究發(fā)現(xiàn)RUNX1也具有促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖的作用[17]。由此可見，RUNX1在不同類型的血液系統(tǒng)腫瘤中具有不同的功能。在不同的實(shí)體腫瘤中，RUNX1也表現(xiàn)出功能的組織異質(zhì)性。例如，RUNX1在肝癌中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，且肝癌組織中RUNX1存在較高的突變，這提示RUNX1在肝癌的發(fā)生過程中起著抑癌的作用[18]。而在非小細(xì)胞肺癌中，有研究發(fā)現(xiàn)RUNX1在肺癌組織中呈高表達(dá)，且能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化療耐藥[19]。另一基因CFⅠ是補(bǔ)體系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子，主要通過絲氨酸蛋白酶的功能裂解C4b和C3b，從而調(diào)劑補(bǔ)體系統(tǒng)的激活。當(dāng)補(bǔ)體激活后，具有生物活性的肽C5a和C3a可誘導(dǎo)多種促炎癥效應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展[20]。已有研究表明，CFⅠ在多種人類腫瘤中具有重要作用，比如皮膚鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、胃癌和乳腺癌等[21-23]。在乳腺癌的研究中，發(fā)現(xiàn)CFⅠ在乳腺癌組織中顯著高表達(dá)，且CFⅠ在腫瘤細(xì)胞、浸潤的免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中均有表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CFⅠ的高表達(dá)與腫瘤的大小和病理分級具有顯著相關(guān)性，且其高表達(dá)與乳腺癌患者生存期和無疾病進(jìn)展期的縮短呈正相關(guān)[24]。

CFⅠ基因編碼的蛋白為補(bǔ)體因子Ⅰ，主要參與補(bǔ)體系統(tǒng)的級聯(lián)反應(yīng)和免疫反應(yīng)[25]。而RUNX1是RUNX轉(zhuǎn)錄因子家族中非常重要的成員，其能夠與許多增強(qiáng)子或啟動子的核心元素結(jié)合，從而調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[26]。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)RUNX1和CFⅠ在GBM中的表達(dá)均異常升高，且它們的高表達(dá)預(yù)示著GBM患者的不良預(yù)后。那么RUNX1作為轉(zhuǎn)錄因子是否可能調(diào)控CFⅠ的表達(dá)？考慮到RUNX1是一重要的轉(zhuǎn)錄因子，且RUNX1與CFⅠ的表達(dá)具有顯著的相關(guān)性。通過轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，RUNX1能夠與CFⅠ的啟動子區(qū)域結(jié)合，表明RUNX1可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控CFⅠ的表達(dá)。另外，結(jié)合最新的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)RUNX1在腫瘤細(xì)胞及免疫細(xì)胞中均呈高表達(dá)。據(jù)此，可以推測RUNX1在腫瘤細(xì)胞及免疫細(xì)胞中均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用?？紤]到CFⅠ主要參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，而RUNX1又能夠調(diào)節(jié)CFⅠ的表達(dá)。由這些證據(jù)可以推測，RUNX1在免疫細(xì)胞中可能通過轉(zhuǎn)錄上調(diào)CFⅠ的表達(dá)，抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的激活和免疫反應(yīng)，從而有助于GBM的進(jìn)展。而在腫瘤細(xì)胞中的具體作用機(jī)制，通過蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及KEGG Pathway分析，初步揭示了RUNX1調(diào)節(jié)GBM增殖的潛在分子機(jī)制。癌基因MYC是一種涉及細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵因子，受到Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，RUNX1可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號，上調(diào)β-catenin的表達(dá)及促進(jìn)癌基因MYC和CD44的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。Wnt/β-catenin信號在調(diào)節(jié)干細(xì)胞的多能性、器官發(fā)生及腫瘤發(fā)生過程中具有重要的作用。當(dāng)Wnt信號激活時，升高的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞核內(nèi)T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(LEF/TCF)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)下游靶基因c-MYC、CD44、MMP7等的表達(dá)，從而參與細(xì)胞增殖、侵襲和腫瘤進(jìn)程的調(diào)節(jié)[28-29]。

綜上所述，本研究通過挖掘高通量的生物信息數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了GBM中具有潛在臨床預(yù)后價值的標(biāo)志物RUNX1和CFⅠ，并初步探索了RUNX1發(fā)揮作用的可能機(jī)制，即RUNX1在免疫細(xì)胞中可能通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)上調(diào)CFⅠ的表達(dá)，抑制補(bǔ)體反應(yīng)，從而使腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視；另一方面，RUNX1在腫瘤細(xì)胞中可能通過激活Wnt/β-catenin信號促進(jìn)腫瘤的惡性增殖和侵襲。這些研究結(jié)果為深入理解GBM的發(fā)生機(jī)制提供了更全面的認(rèn)識，也為GBM的治療措施提供新的理論參考。但本研究也存在一定的不足，比如細(xì)胞及動物實(shí)驗(yàn)方面的證據(jù)不夠充足。在后續(xù)的研究中，應(yīng)進(jìn)一步深入基礎(chǔ)和臨床的研究，以充分闡明RUNX1在GBM中的作用和分子機(jī)制。