結(jié)直腸癌組織EGFR、BRAF及NRAS基因突變檢測及臨床意義分析

符青云，歐陽小明，郅 程，何凱寧

（1.江門市五邑中醫(yī)院病理科，廣東 江門 529000；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510260）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率、死亡率在全部惡性腫瘤中均位居第5 位[1]，是威脅國民健康的重大公共衛(wèi)生問題。目前對于CRC 的治療已進入了靶向治療時代，近年來應(yīng)用基因檢測的方法在CRC 患者實施靶向治療的過程中檢測相關(guān)基因的突變，在判斷CRC 預(yù)后及指導(dǎo)基因靶向治療中起到關(guān)鍵的作用[2，3]。表皮生長因子受體（EGFR）是靶向治療藥物作用主要靶點之一，ErbB 受體家族的成員，也是一種Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生長因子受體，大小為170 ku 的跨膜糖蛋白，廣泛存在于不同腫瘤表面，在許多惡性腫瘤的增殖、分化、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[4，5]。有研究表明[6]，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胸膜轉(zhuǎn)移與表皮生長因子受體突變狀態(tài)的存在一定聯(lián)系。致癌同源體B1（carcinogenic homolog B1，BRAF）基因和神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物（neuroblastoma RAS viral oncogene homolog，NRAS）基因同屬RAF 家族中的一種原癌基因，已發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中存在突變[7]。致癌同源體B1 突變導(dǎo)致絲裂原活化蛋白激酶信號通路持續(xù)激活，引起細胞生長增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，從而影響腫瘤的發(fā)展進程[8]，而神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突變的報道相對較少。既往研究表明[9]，致癌同源體B1 基因和神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突變與CRC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)。本研究分析了CRC 組織中表皮生長因子受體、致癌同源體B1 及神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突變類型及其與臨床病理指標的關(guān)系，旨在為臨床實施個體化靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017 年1 月-2018 年12 月江門市五邑中醫(yī)院病理科確診的321 例CRC 患者的臨床資料。其中男125 例，女196 例；年齡40～80 歲，平均年齡（58.91±10.27）歲；年齡＞60 歲148 例，≤60歲173 例。腫瘤部位：結(jié)腸168 例，腫瘤直腸153 例；病理組織學(xué)分級：低分化113 例，中/高分化208 例；檢出淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移196 例，未檢出淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移125 例；TNM 分期：Ⅰ+Ⅱ期102 例，Ⅲ+Ⅳ期219 例?；颊呒凹覍賹Ρ敬窝芯烤橥猓⒑炇鹬橥鈺?。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準 所有患者均經(jīng)過病理組織學(xué)檢查，診斷為CRC，且未接受放化療或免疫治療等。

1.2.2 排除標準 合并潰瘍性結(jié)腸炎、腸道感染性疾病等；合并其他惡性腫瘤病史；合并嚴重的肝腎等臟器功能障礙。

1.3 試劑 石蠟包埋組織樣本DNA 分離試劑盒（DP331）購自北京天根生化科技有限公司；人類表皮生長因子受體、致癌同源體B1 和神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突變檢測試劑盒購自北京雅康博生物科技有限公司；核酸蛋白質(zhì)濃度測量儀B-500 購自上海創(chuàng)萌生物科技有限公司，Mx3000P 實時熒光定量PCR 儀購自美國BIO-RAD公司。

1.4 提取DNA 選取5～10 張4 μm 厚癌組織常規(guī)石蠟切片，利用二甲苯脫蠟，加入裂解液，離心取上清液，使用TIANGEN 石蠟包埋組織樣本DNA 分離試劑盒進行DNA 提取，具體步驟嚴格遵照試劑盒說明書進行。用核酸蛋白質(zhì)濃度測量儀測定所提DNA 的濃度。調(diào)整最適質(zhì)量濃度為20 μg/L，OD260/OD280值1.8～2.0。

1.5 實時熒光定量PCR 檢測基因突變 以調(diào)整合適濃度的DNA 為模板，使用人類表皮生長因子受體、致癌同源體B1 和神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突變檢測試劑盒，在實時熒光定量PCR 儀中進行擴增，檢測表皮生長因子受體基因第18、19、20、21 外顯子、致癌同源體B1 基因15 號外顯子、神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因第2 和第3 外顯子的熱點突變，記錄各樣本表皮生長因子受體、致癌同源體B1、神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物3 個基因突變情況。具體步驟嚴格遵照試劑盒說明書進行。

1.6 隨訪 所有患者治療出院后均進行隨訪，隨訪時間自病理活檢日期起開始經(jīng)門診復(fù)查、電話隨訪及家訪，治療后1 年內(nèi)每3 個月經(jīng)門診復(fù)查1 次，2 年內(nèi)半年復(fù)查1 次，以后至少每年復(fù)查1 次，隨訪截止2021 年6 月。至隨訪截止日記錄患者期間生存時間及隨訪時狀態(tài)（存活、死亡、失訪或其他）等。

1.7 觀察指標 分析CRC 患者組織中表皮生長因子受體、致癌同源體B1 和神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突變情況；比較不同性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期3 種基因突變類型、突變率；Pearson 相關(guān)性分析CRC 中表皮生長因子受體、致癌同源體B1 和神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物表達的關(guān)系，Kaplan-Meier分析3 個基因突變對總生存期（overall survival，OS）和無進展生存期（progression-free survival，PFS）的影響。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料采用（±s）表示。計數(shù)資料采用[n（%）]表示，表皮生長因子受體、致癌同源體B1 和神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突變率在不同年齡段、性別、腫瘤部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期的比較采用χ2檢驗。通過Kaplan-Meier 方法繪制患者的生存曲線，組間差異采用Log-rank 檢驗評估。表皮生長因子受體、致癌同源體B1 和神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因之間的相關(guān)性采用Pearson 分析。當(dāng)P＜0.05 時表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC 患者組織中EGFR、BRAF 和NRAS 基因突變情況 321 例CRC 患者中共檢出陽性突變179例，占總數(shù)的55.76%。總突變率由高至低依次為表皮生長因子受體、致癌同源體B1、神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物。表皮生長因子受體中L858R 突變頻率最高，致癌同源體1 中V600E 突變頻率最高，神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物中G13R 突變頻率最高，各突變類型的突變率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 EGFR、BRAF 和NRAS 常見基因突變類型分析[n（%）]

2.2 EGFR、BRAF 和NRAS 基因突變與臨床特征之間的關(guān)系 在321 例CRC 患者中，表皮生長因子受體基因突變發(fā)生率與性別、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（P＜0.05），而與年齡、腫瘤部位無關(guān)（P＞0.05）；致癌同源體1 基因突變發(fā)生率與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），而與性別、腫瘤部位、分化程度及TNM 分期無關(guān)（P＜0.05）；神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突變發(fā)生率與年齡、性別、腫瘤部位、分化程度及TNM 分期均無關(guān)（P＞0.05），見表2。

表2 EGFR、BRAF 和NRAS 基因突變與臨床特征之間的關(guān)系[n（%）]

2.3 EGFR、BRAF 和NRAS 在CRC 中突變的相關(guān)性CRC 組織中表皮生長因子受體和致癌同源體B1 突變呈正相關(guān)（r=0.468，P＜0.05）；CRC 組織中致癌同源體B1 和神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒基因同源物突變呈正相關(guān)（r=0.457，P＜0.05）；CRC 組織中表皮生長因子受體和神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒基因同源物突變呈正相關(guān)（r=0.357，P＜0.05）。

2.4 EGFR、BRAF 和NRAS 基因突變對總生存期和無進展生存期的影響 截止至隨訪時間結(jié)束，表皮生長因子受體野生型患者3 年OS 為49.00%，高于表皮生長因子受體突變型患者的38.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rankχ2=9.232，P=0.002）；表皮生長因子受體野生型患者3 年P(guān)FS 為31.00%，高于表皮生長因子受體突變型患者的25.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rankχ2=5.419，P=0.019）。致癌同源體B1野生型患者3 年OS 為47.00%，高于致癌同源體B1 突變型患者的40.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rankχ2=7.694，P=0.005）；致癌同源體B1 野生型患者3 年P(guān)FS 為32.00%，高于致癌同源體B1突變型患者的24.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Logrankχ2=7.631，P=0.006）。神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物野生型患者3 年OS 為45.00%，高于神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物突變型患者的42.00%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rankχ2=3.082，P=0.079）；神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物野生型患者3 年P(guān)FS 為33.00%，高于神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物突變型患者的23.00%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rankχ2=1.139，P=0.285），見圖1。

圖1 EGFR、BRAF 和NRAS 基因突變對OS 和PFS 的影響

3 討論

CRC 的發(fā)生發(fā)展涉及多個基因、多個信號通路、多個步驟。其發(fā)展進程不僅與腸上皮細胞的凋亡、增殖速度密切相關(guān)，也涉及多種癌基因的激活、抑癌基因的失活，以及表觀遺傳學(xué)的改變[10-12]。目前表皮生長因子受體基因是臨床上治療CRC 的主要靶點之一，首選靶向藥物為表皮生長因子受體抑制劑西妥昔單抗和帕尼單抗等。作為一種跨膜酪氨酸激酶受體，表皮生長因子受體配體與之結(jié)合后，下游的RAS/RAF/MAPK 和PIK3CA/AKT 信號通路被激活，而這兩條信號通路與細胞的增殖、分化及凋亡、遷移等有密切關(guān)系[13]。神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物和致癌同源體B1 同屬RASRAF-MAPK 信號通路，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14-16]。表皮生長因子受體靶向治療的效果受很多因素的影響，其中表皮生長因子受體、神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物和致癌同源體B1 等基因的突變與表皮生長因子受體靶向治療密切相關(guān)[17]，因此治療靶點的檢測是臨床進行個體化治療的前提。

CRC 中表皮生長因子受體基因突變率在40%～60%，其中L858R 類型的突變頻率最高。本研究發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體基因總突變率為45.79%，并與CRC 組織的性別、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期有關(guān)，表皮生長因子受體基因突變患者的預(yù)后較差，與Afrǎsanie VA 等[18]的研究報道基本一致。表皮生長因子受體泛分布于哺乳動物上皮細胞、成纖維細胞、膠質(zhì)細胞、角質(zhì)細胞等細胞表面，其信號通路由表皮生長因子激活，使其中的蛋白酪氨酸激酶活性增強；受體自身的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，活化下游多種信號通路從而傳遞到細胞核內(nèi)，對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用。表皮生長因子受體過度表達、失調(diào)、突變或自我激活常提示與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可作為預(yù)測CRC 發(fā)展進展、預(yù)后的標志物[19，20]。

本研究發(fā)現(xiàn)致癌同源體B1 基因總突變頻率為7.79%，其中V600E 突變率為4.05%，與相關(guān)報道顯示CRC 中致癌同源體B1 基因突變率在4%～13%，其中V600E 突變率接近50%的結(jié)果基本一致。致癌同源體B1 基因突變與CRC 組織的年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與表皮生長因子受體結(jié)果部分一致，表明致癌同源體B1 基因與表皮生長因子受體基因突變可能互相影響，共同發(fā)揮作用。既往有研究對166 例CRC 患者癌組織進行致癌同源體B1基因分析，本研究結(jié)果在腫瘤分化、病理浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面存在與該研究部分相似的結(jié)果[21]。此外，致癌同源體B1 基因V600E 在CRC 中的突變率為4.0%，與既往文獻報道相似[22]。致癌同源體B1 基因突變生存表明突變型和野生型患者術(shù)后生存率存在差異，隨著生存時間的延長，突變型患者的生存率顯著下降。另有研究也認為致癌同源體B1基因突變的CRC 患者也會發(fā)生靶向藥物抵抗[23]，致癌同源體B1 基因突變是帕尼單抗和西妥昔單抗[24]預(yù)后療效的獨立預(yù)測因素[25-28]。

神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因是RAS 基因家族中的一員，在CRC 中突變率為3%～8%，其突變狀態(tài)對于CRC 靶向藥物的治療效果具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，CRC 組織中神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突變檢出率為2.18%，與Hsu CH 等[29]結(jié)果類似。本研究未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突變與CRC 的性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 病理分期等臨床病理特征存在關(guān)聯(lián)，但45歲以下的患者中未檢出神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物突變，檢出神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物突變的病例最小年齡是48 歲；腫瘤部位在直腸的癌組織中神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突變檢出率較高。因此推測患者年齡、腫瘤部位可能與神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突變有一定關(guān)聯(lián)。然而本研究僅為單中心研究，樣本量有限，需要增加樣本量進行驗證。神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突變生存分析結(jié)果表明突變型和野生型患者術(shù)后生存率無統(tǒng)計學(xué)差異。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，CRC 組織中表皮生長因子受體、致癌同源體B1 和神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物突變兩兩之間存在一定的相關(guān)性。

綜上所述，CRC 患者存在較高的表皮生長因子受體基因突變率，而致癌同源體B1 和神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突變率相對較低。表皮生長因子受體基因突變與性別、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期有關(guān)，且致癌同源體B1 基因突變與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，存在部分交叉。突變患者將不能從抗表皮生長因子受體的靶向治療中獲益，建議CRC 患者在用靶向治療藥物（如西妥昔單抗和帕尼單抗等）之前應(yīng)先對CRC 患者進行表皮生長因子受體、神經(jīng)母細胞瘤RAS 病毒癌基因同源物、致癌同源體B1 等多基因檢測，為CRC 的個體化治療提供更準確的參考依據(jù)。