郭仁波 ,李 萍 ,于翰宗 ,姜 山 ,程 斐 ,孫朝輝
(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,山東 青島 266109;2.青島市城陽區(qū)上馬街道辦事處,山東 青島 266112)
大白菜(Brassica campestrisL.ssp. pekinensis,染色體組AA,2n=2x=20)是十字花科蕓薹屬蕓薹種大白菜亞種,是目前我國播種面積最大的蔬菜作物之一。隨著人們對大白菜品質(zhì)的要求越來越高,品質(zhì)育種亦受到大白菜育種者的普遍重視。大白菜品質(zhì)性狀包括商品、風(fēng)味、營養(yǎng)品質(zhì),其中,營養(yǎng)品質(zhì)由葉球內(nèi)含有的營養(yǎng)物質(zhì)決定,大白菜葉球顏色與營養(yǎng)品質(zhì)、商品品質(zhì)有著密切關(guān)系。彩色大白菜品種選育成為大白菜品質(zhì)育種的重要方向之一。大白菜葉球的內(nèi)葉顏色主要有黃色、橘紅色、白色、紫色,中間過渡類型有橘黃色、淡黃色、金黃色等。近年來,我國的育種工作者利用引進(jìn)的黃心和橘紅心大白菜資源,通過種質(zhì)改造與創(chuàng)新,陸續(xù)培育出了一系列黃心和橘紅心大白菜新品種。
類胡蘿卜素是植物體中一類重要的呈色組分和有益活性物質(zhì),大多為黃、橙或紅色等,是植物葉、花和果實呈色的主要成分之一,只能在植物或微生物中合成,是人體必需的營養(yǎng)成分之一。類胡蘿卜素在植物中擔(dān)當(dāng)葉綠體光合作用的輔助色素并保護(hù)葉綠素免受強(qiáng)光破壞,同時也是合成ABA的前體;在動物體中,具有清除自由基、預(yù)防腫瘤、預(yù)防夜盲癥等功能[1-2]。類胡蘿卜素的種類和含量是評估水果和蔬菜品質(zhì)的重要參數(shù)[3]。研究大白菜類胡蘿卜素種類與積累特點,對今后通過栽培或育種手段提高其類胡蘿卜素含量、改善營養(yǎng)品質(zhì)、保障人民健康具有重要意義。
目前,已發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素有700 余種,類胡蘿卜素根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同將其分為兩類,一類是胡蘿卜素(只含碳、氫2 種元素,不含氧元素),另一類是葉黃素(有羥基、酮基、羧基、甲氧基等含氧官能團(tuán))。由于生物基質(zhì)的復(fù)雜性,一個完整的類胡蘿卜素分析方法包括3 個步驟,分別是磨樣、提取和檢測。使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)可精確的對物質(zhì)進(jìn)行定量分析。類胡蘿卜素屬于次級代謝物質(zhì),LC-MS/MS 能夠準(zhǔn)確進(jìn)行類胡蘿卜素的定性和定量分析。
以異戊烯焦磷酸為前體,經(jīng)過異戊二烯焦磷酸構(gòu)酶(IPPI)、櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合酶(GGPS)、八氫番茄紅素合酶(PSY)、八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)、ζ-胡蘿卜素脫氫酶(ZDS)、番茄紅素β-環(huán)化酶(LycB)、番茄紅素ε-環(huán)化酶(LycE)等催化,產(chǎn)生各類類胡蘿卜素。前期研究發(fā)現(xiàn),大白菜葉球內(nèi)葉黃色、橘紅色是由于類胡蘿卜素的積累造成[4],大白菜葉球內(nèi)主要呈色類胡蘿卜素為番茄紅素呈橙紅色,α-胡蘿卜素呈橙黃色,β-胡蘿卜素呈橙黃色,葉黃素呈黃色,新黃質(zhì)呈黃色,紫黃質(zhì)呈黃色。類胡蘿卜素種類的不同及含量的差異是造成大白菜葉球呈現(xiàn)不同顏色差異的主要原因[5]。
本研究以不同色澤的大白菜球葉為材料,基于高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜平臺,通過不同色澤球葉中類胡蘿卜素物質(zhì)的差異分析,初步揭示不同色澤品種之間的組分差異,旨在為大白菜優(yōu)質(zhì)資源的篩選和新品種選育提供參考。
供試材料為6 份成熟期內(nèi)3 種球葉顏色的大白菜,其中,黃色品種(系)為11-2-266、喜諾傳祺;橘紅色品種(系)為桔紅65 號、ZC22-1;白色品種(系)為青雜三號、128-2-264,均來源于青島國際種苗有限公司。
甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、甲酸、甲基叔丁基醚、2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)、正己烷,均為色譜純;氯化鈉、氫氧化鉀,標(biāo)準(zhǔn)品(BOC/Sigma-Aldrich 公司)均為分析純。
離心機(jī)(5424R 型號,Eppendorf 公司)、LCMS/MS(QTRAP-6500+型號,SCIEX 公司)、電子天平(AS 60/220.R2 型號,RADWAG 公司)、球磨儀(MM400 型號,Retsch 公司)、離心濃縮儀(CentriVap 型號,LABCONCO 公司)、多管渦旋振蕩器(MIX-200 型號,上海凈信公司)、超聲清洗儀(KQ5200E 型號,昆山舒美公司)。
1.3.1 樣品提取 按照大白菜發(fā)育周期,于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)上馬實驗基地取成熟期球葉內(nèi)葉,-80 ℃保存,取樣時間均在傍晚并于30 min 內(nèi)完成,每個品種(系)從3 個成熟度一致的不同單株中取樣作為生物學(xué)重復(fù)[6]。
取出低溫保存的凍干大白菜球葉樣本,用球磨儀研磨(30 Hz,1 min)至粉末狀。稱取50 mg 研磨后的樣本,用含0.01% BHT(g/mL)的正己烷/丙酮/乙醇混合溶液(體積比1∶1∶2)進(jìn)行4 ℃過夜提取。室溫下渦旋20 min,重復(fù)提取一次后離心合并上清液,將得到的提取液經(jīng)離子濃縮儀濃縮后用甲醇/甲基叔丁基醚混合溶液(體積比3∶1)復(fù)溶[7],過0.22 μm 濾膜后,保存于棕色進(jìn)樣瓶中,用于超高效液相色譜(UPLC)和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)分析。
1.3.2 色譜質(zhì)譜分析條件 代謝組分析參考WEI等[8]開發(fā)的廣泛靶向代謝組學(xué)研究方法,進(jìn)行樣品處理、物質(zhì)提取、上機(jī)檢測。經(jīng)超高效液相色譜和串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜分析,其中,液相檢測色譜柱為C30 柱(3.0 μm,100 mm×2.0 mm),流動相:A 相,甲醇/乙腈(色譜純,Merck)(體積比1∶3)加入0.01% BHT 和0.1%甲酸(色譜,Sigma-Aldrich);B相,甲基叔丁基醚加入0.01% BHT。梯度洗脫程序:0 min A/B 為100% A,3 min 為100% A,5 min 為30% A,70% B,9 min 為5% A,95% B,10 min 為100% A,11 min 為100% A;流速0.8 mL/min;柱溫28°C;進(jìn)樣量2 μL。大氣壓化學(xué)離子源(Atmospheric Pressure Chemical Iosziaa-lion,APCI)溫度350 °C?;谶~維代謝自建標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建MWDB(Metware Database)數(shù)據(jù)庫,對質(zhì)譜檢測的數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析。利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式(Multiple Reaction Monitoring,MRM)對代謝物進(jìn)行定量分析[9]。
使用軟件Analyst 1.6.3 對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間與峰型的信息,對每種物質(zhì)在不同樣本中檢測到的質(zhì)譜峰進(jìn)行校正,以確保定性定量的準(zhǔn)確。
代謝物含量數(shù)據(jù)采用極差法進(jìn)行歸一化處理,通過R 軟件(https://www.r-project.org/),對代謝物在不同樣本間的積累模式進(jìn)行聚類分析并使用R 程序腳本繪制聚類熱圖。
2 個黃色品種(系)(11-2-266、喜諾傳祺)、2 個橘紅色品種(系)(桔紅65 號、ZC22-1)、2 個白色品種(系)(青雜三號、128-2-264)的球葉色澤如圖1所示。6 個不同材料的球葉中共鑒定出44 種類胡蘿卜素物質(zhì),主要包括葉黃素(xanthophylls)14 種、胡蘿卜素(carotenes)7 種、胡蘿卜素酯(carotenoid esters)23 種。
圖1 不同顏色的大白菜球葉Fig.1 Bulb leaves of different colors of Chinese cabbage
由表1 可知,黃色球葉材料中,11-2-266 含有類胡蘿卜素物質(zhì)24 種,喜諾傳祺含有類胡蘿卜素物質(zhì)25 種。橘紅色球葉材料中,桔紅65 號含有類胡蘿卜素物質(zhì)22 種,ZC22-1 含有類胡蘿卜素物質(zhì)24 種。白色球葉材料中,青雜三號含有類胡蘿卜素物質(zhì)21 種,128-2-264 含有類胡蘿卜素物質(zhì)24 種。檢測結(jié)果表明,黃色球葉材料中類胡蘿卜素種類多于橘紅色和白色球葉材料。將檢測到的所有樣本的積分峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程進(jìn)行計算,進(jìn)一步帶入公式計算后,最終得到實際樣本中該物質(zhì)的絕對含量數(shù)據(jù)(表1)。檢測結(jié)果表明,黃色球葉材料中類胡蘿卜素總含量顯著多于橘紅色和白色球葉材料。
表1 不同材料中類胡蘿卜素物質(zhì)統(tǒng)計Tab.1 Statistics of carotenoids in different materials
根據(jù)定量分析結(jié)果,將類胡蘿卜素分為4 類:(1)在黃色球葉中大量積累的;(2)在橘紅色球葉中大量積累的;(3)在白色球葉中大量積累的;(4)在材料間無顯著積累差異。結(jié)果表明,在黃色球葉中優(yōu)勢積累的類胡蘿卜素有14 種,包括葉黃素2 種、胡蘿卜素3 種、胡蘿卜素酯9 種;在橘紅色球葉中優(yōu)勢積累的類胡蘿卜素有12 種,包括葉黃素2 種、胡蘿卜素4 種、胡蘿卜素酯6 種;在白色球葉中優(yōu)勢積累的類胡蘿卜素有7 種,包括葉黃素2 種、胡蘿卜素2 種、胡蘿卜素酯3 種;另外,9 種類胡蘿卜素在材料間無顯著積累差異(圖2)。差異組分的統(tǒng)計結(jié)果同樣表明,在黃色球葉中優(yōu)勢積累的類胡蘿卜組分要多于橘紅色球葉和白色球葉。
圖2 樣品總體聚類Fig.2 Sample clustering diagram
為進(jìn)一步解釋黃色、橘紅色、白色球葉中類胡蘿卜素代謝差異,初步分析了差異類胡蘿卜素物質(zhì)之間的代謝關(guān)聯(lián)。首先,整體上數(shù)量和含量的優(yōu)勢表明,黃色球葉中類胡蘿卜素物質(zhì)的積累要優(yōu)于橘紅色和白色球葉。黃色球葉中高量積累的為葉黃素(Lutein)、葉黃素酯類物質(zhì),是類胡蘿卜素代謝通路的中下游產(chǎn)物;而橘紅色球葉中高量積累的為八氫番茄紅素、番茄紅素、β-胡蘿卜素,是類胡蘿卜素代謝的上中游產(chǎn)物;白色球葉中較多積累的為α-隱黃質(zhì)、葉黃素、新黃質(zhì)、紫黃質(zhì),是類胡蘿卜素代謝的中下游產(chǎn)物。對比白心和黃心的代謝產(chǎn)物,本研究發(fā)現(xiàn),黃心球葉中,葉黃素的大量積累是導(dǎo)致球葉呈現(xiàn)黃色的主要原因,隨著黃色程度的加深,對應(yīng)葉黃素(Lutein)的絕對質(zhì)量也隨之增加;雖然白色球葉材料中含有的類胡蘿卜素種類相較于黃心材料更為豐富,但含量上的缺乏導(dǎo)致該球葉并不能呈現(xiàn)肉眼可見的色澤。由此可見,不同類胡蘿卜素種類和含量的積累差異造成不同的大白菜球葉顏色差異,其中,番茄紅素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素、新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)等物質(zhì)提供了橙紅色和黃色組分,盡管類胡蘿卜素物質(zhì)的呈色與細(xì)胞內(nèi)pH值、外界環(huán)境刺激等因素有關(guān)聯(lián),但總體而言,數(shù)量和含量上的優(yōu)勢讓黃色球葉比橘紅色和白色球葉擁有更優(yōu)秀的品質(zhì)性狀。從單個代謝產(chǎn)物含量上對比分析,橘紅色球葉中番茄紅素和八氫番茄紅素的含量都很低,但呈現(xiàn)的橘紅色卻很明顯,白心和黃心中沒有發(fā)現(xiàn)番茄紅素和八氫番茄紅素,由此可以推斷,橘紅心大白菜球葉中的主要呈色物質(zhì)是番茄紅素和八氫番茄紅素。
研究人員通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫把代謝物含量、表達(dá)信息以及基因納入整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。KEGG 提供的主要公共數(shù)據(jù)庫整合代謝途徑(pathway)查詢,不僅全面注解催化各步反應(yīng)的酶,同時提供所有代謝途徑,包含有PDB 庫的鏈接、核苷、氨基酸序列、有機(jī)物的生物降解及碳水化合物等,是強(qiáng)有力工具進(jìn)行生物體內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)研究、代謝分析。
利用KEGG 數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進(jìn)行注釋并展示,部分結(jié)果如圖3 所示。統(tǒng)計篩選出的差異顯著的代謝物中KEGG 數(shù)據(jù)庫的注釋情況,部分結(jié)果如表2 所示。
圖3 差異代謝物KEGG 通路Fig.3 Differential metabolite KEGG pathway map
表2 差異代謝物KEGG 注釋Tab.2 Differential metabolite KEGG annotation
由圖3、表2 可知,青雜三號(白心)相對于11-2-266(黃心),黃色球葉品種中花藥黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、葉黃素的含量均出現(xiàn)大幅提高,尤其是葉黃素的絕對含量和差異倍數(shù)均大幅提高。在本試驗中明確了大白菜黃色主要是由于球葉積累葉黃素造成的;除此之外,黃色球葉材料還積累較多的花藥黃質(zhì)、紫黃質(zhì)等。
胡蘿卜素類在植物中以游離態(tài)存在[10]。葉黃素類在植物中會與不同脂肪酸結(jié)合形成類胡蘿卜素酯類物質(zhì),因此,在植物中既有游離形態(tài),也有酯化形態(tài)。因此,本試驗建立了2 種類胡蘿卜素檢測方法,分別是常規(guī)類胡蘿卜素檢測和水解類胡蘿卜素酯的皂化類胡蘿卜素檢測。FENG 等[11]研究認(rèn)為,大白菜球葉呈橘紅色由番茄紅素和β-胡蘿卜素積累造成。SEOHEE 等[12]研究認(rèn)為,前番茄紅素的積累導(dǎo)致大白菜球葉呈現(xiàn)橘紅色。本試驗中采用LC-MS/MS 法,能夠很好地把歸屬于植物體中次級代謝物的類胡蘿卜素進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量。在大白菜中分離鑒定了44 種類胡蘿卜素成分,多于張寧[13]測定的類胡蘿卜素組分。李佩榮等[14]在試驗中僅在橘紅心材料中檢測到微量的葉黃素,而本試驗黃心和橘紅心大白菜內(nèi)葉中都檢測到了較多的葉黃素,這或許與新品種中類胡蘿卜素ε-羥化酶(CHYE)[15]不斷得到加強(qiáng)及本試驗采取了全新的水解類胡蘿卜素酯的皂化類胡蘿卜素檢測方法有關(guān)。
本試驗明確了大白菜黃色球葉主要是由β-胡蘿卜素和葉黃素的大量積累造成的,而且根據(jù)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院十字花科課題組前期積累發(fā)現(xiàn),球葉顏色黃色越深,β-胡蘿卜素和葉黃素含量越高;大白菜橘紅色球葉主要是由于內(nèi)葉積累番茄紅素造成的,橘紅心材料還積累較多的β-胡蘿卜素、少量的葉黃素和紫黃質(zhì)等。同時研究發(fā)現(xiàn),橘紅心球葉在切開見光后短時間內(nèi)(5 min)即可由黃色變?yōu)殚偌t色,隨著時間推移,橘紅色逐漸加深,這個可能是由于光異構(gòu)作用,使得黃色的前番茄紅素異構(gòu)為紅色的番茄紅素。由于光不能直接和順式胡蘿卜素前體發(fā)生異構(gòu)作用,這是否是影響PSⅡ中光捕獲色素蛋白復(fù)合體[16-17]的結(jié)構(gòu),還有待進(jìn)一步研究。
本研究在部分引進(jìn)日韓的大白菜黃心品種中檢測到了少量番茄紅素和八氫番茄紅素,由于極少量的番茄紅素和八氫番茄紅素就可在呈色初期呈現(xiàn)黃色,這或許是吉錦品種等日韓及國內(nèi)晉白菜7 號[18]優(yōu)秀高抗黃心新品種短時間選育出來的可行性方法。同時,從市場商品品種分析,雖然在大白菜球葉顏色育種已經(jīng)培育出了顏色多樣的品種,目前大白菜品種的球色也僅有黃色、紫色、橘紅色等5 種類型,仍然不能滿足顧客多樣化的市場消費需求,期待蔬菜育種家培育出更多球葉顏色的大白菜優(yōu)質(zhì)品種。同時值得注意的是,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的黃玫瑰形狀白菜[19]在特殊節(jié)日中影響較大。繼續(xù)深入研究,尤其是加強(qiáng)大白菜球葉中類胡蘿卜素的KEGG 通路等球葉顏色形成機(jī)制的研究,可為彩色大白菜育種奠定基礎(chǔ)。