黍稷EST-SSR 標(biāo)記的開發(fā)

商春悅 ，王 蓉 ，王海崗 ，陳 凌 ，Santra Dipak K ，喬治軍 ，王瑞云 ，

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因資源研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030031；3.內(nèi)布拉斯加大學(xué)林肯分校農(nóng)藝系小宗糧豆研究與推廣中心，美國內(nèi)布拉斯加州69361）

黍稷（Panicum miliaceumL.）又稱黍、稷、穄和糜，屬于禾本科黍?qū)俚? 年生草本植物，是歷史最悠久的農(nóng)作物之一[1-2]，早在新石器時(shí)代就種植黍稷作為糧食作物[3]。我國是黍稷的起源中心[4]，現(xiàn)主要集中在長(zhǎng)城沿線地區(qū)。與谷子、高粱和小麥等農(nóng)作物相比，黍稷具有較強(qiáng)的物質(zhì)分配能力和水分調(diào)節(jié)能力，可以在缺水的土壤中生長(zhǎng)，且生育期短，約為60 d，為干旱半干旱地區(qū)和邊緣地區(qū)人們提供了糧食保障[5]。黍稷的栽培技術(shù)要求不高，且抗逆性強(qiáng)，被廣泛種植于亞洲、非洲、歐洲等世界各地[6-14]。其中，糜子含有亞油酸、多種礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，且多數(shù)蛋白質(zhì)與氨基酸高于小麥、玉米及水稻[15]，在亞洲及非 洲主要用來 食用[5-6，10，16-17]；而在美國和加拿大主要用于飼鳥；此外，糜子還可以作青貯飼料，品質(zhì)優(yōu)于燕麥[18-19]。

黍稷的遺傳多樣性是遺傳改良的基礎(chǔ)，黍稷是異源四倍體（2n=4x=36），基因組復(fù)雜，分子標(biāo)記是遺傳相關(guān)性評(píng)估、親緣關(guān)系鑒定和群體結(jié)構(gòu)分析的有效工具，其中，SSR 標(biāo)記（Simple Sequence Repeat）是一種共顯性標(biāo)記，因其具有數(shù)量多、多態(tài)性豐富、分布均衡且呈中性、等位位點(diǎn)多、重復(fù)性好和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[19-20]，在遺傳多樣性評(píng)估中最具有優(yōu)勢(shì)。HU 等[20]首先利用其他物種中的SSR 標(biāo)記分析中國糜子的遺傳多樣性，RAJPUT 等[21-22]利用柳枝稷、水稻、小麥、大麥和燕麥的983 個(gè)SSR 進(jìn)行篩選，選擇出46 個(gè)條帶清楚，多態(tài)性好的標(biāo)記。雖然得到的遺傳多樣性的水平高，但由于標(biāo)記來源于其他物種，其通用性差、多態(tài)性率低。之后CHO等[23]通過構(gòu)建黍稷基因組DNA 的SSR 文庫，對(duì)125 對(duì)不同基元的引物進(jìn)行篩選，最終得到25 對(duì)多態(tài)性標(biāo)記，多態(tài)率17.5%，多態(tài)性仍然較低。一些研究者[24-27]利用EST-SSR 分子標(biāo)記分析了黍稷的遺傳多樣性，相比SSR 標(biāo)記結(jié)果較好，但是數(shù)目較少。EST-SSR 標(biāo)記是基于表達(dá)序列標(biāo)簽開發(fā)微衛(wèi)星的分子標(biāo)記，多態(tài)性好、特異性強(qiáng)且易于檢測(cè)，在水稻、小麥、大豆、玉米等植物的標(biāo)記開發(fā)和遺傳研究中得到了廣泛應(yīng)用[24-25]。

黍稷是一種小宗作物，現(xiàn)階段對(duì)黍稷基因組的研究不足，多態(tài)性標(biāo)記開發(fā)效率低，可有效利用的EST-SSR 標(biāo)記少，難以用分子標(biāo)記對(duì)其種質(zhì)資源親緣關(guān)系和遺傳差異進(jìn)行更準(zhǔn)確的研究。本研究基于黍稷轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)開發(fā)EST-SSR 引物，通過引物分辨程度、堿基重復(fù)分布狀況和遺傳參數(shù)高低等評(píng)價(jià)，旨在開發(fā)可用于黍稷遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建的EST-SSR 標(biāo)記。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)采用6份地理來源差異較大的黍稷材料（表1），幼苗長(zhǎng)至三葉期時(shí)取葉片，并于-80 ℃低溫保存。

表1 黍稷材料Tab.1 Detail of broomcorn millet materials

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 基于黃黍稷（00005272）與鎮(zhèn)原大黍稷轉(zhuǎn)錄測(cè)序結(jié)果，獲得2 301 個(gè)Unigenes，從1 000對(duì)三核苷酸重復(fù)的SSR 序列中隨機(jī)挑選114個(gè)EST-SSR 標(biāo)記，利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物， 引物序列信息如表2 所示。

表2 多態(tài)性SSR 引物的序列及退火溫度Tab.2 Sequence of polymorphism SSR primers and annealing temperature

續(xù)表2 多態(tài)性SSR 引物的序列及退火溫度Tab.2（Continued） Sequence of polymorphism SSR primers and annealing temperature

續(xù)表2 多態(tài)性SSR 引物的序列及退火溫度Tab.2（Continued） Sequence of polymorphism SSR primers and annealing temperature

1.2.2 多態(tài)性引物篩選 采用改良CTAB 法提取黍稷材料的DNA，用NanodropND-1000 核酸濃度檢測(cè)儀檢測(cè)DNA 濃度，根據(jù)A260/A280和A260/A230值分別檢測(cè)各DNA 純度：A260/A280范圍在1.7～1.9，A260/A230＞2.0。利用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 是否完整，得到完整性好、純度高的DNA 后稀釋至30～80 ng/μL 備用。PCR 擴(kuò)增體系（20 μL）：2×MasterMix 10 μL、上下游引物（0.4 μmoL/L）各0.8 μL、DNA 模板1 μL 和ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)熱4 min；94 ℃變性40 s，Tm 退火40 s，36 個(gè)循環(huán)；72 ℃產(chǎn)物延伸8 min。用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，在200 V 恒壓下，等條帶移動(dòng)至底部時(shí)，關(guān)閉電源。0.1% AgNO3溶液染色10 min，倒入0.2% NaOH 溶液和4～6 mL 甲醛，在通風(fēng)櫥里輕輕搖晃10～15 min 直至顯色，ddH2O清洗2 次，在LED 燈膠片觀片臺(tái)上灑上蒸餾水，拍照記錄保存結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠結(jié)果，判斷有無多態(tài)性，并讀取多態(tài)性條帶，有多態(tài)性記為“1”，無多態(tài)性記為“0”。利用公式Rp=∑Ib 計(jì)算標(biāo)記的分辨率[26]，其中Rp 表示標(biāo)記分辨率，Ib 表示等位基因信息量，Ib=1-（2×︱0.5-p︱)；p 表示等位基因出現(xiàn)的次數(shù)。利用軟件PowerMarker 3.25[27]和PopGen 1.32計(jì)算SSR 遺傳多樣性參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的開發(fā)及篩選

RYW187 引物對(duì)6 份黍子材料的聚丙烯凝膠電泳結(jié)果如圖1 所示。

圖1 RYW187 引物對(duì)6 份黍子材料的聚丙烯凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Polypropylene gel electrophoresis results of RYW187 primer on 6 broomcrn millet materials

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，在114 對(duì)引物中有43 對(duì)（RYW170-RYW212）可擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，其中RYW187 引物對(duì)6 份黍稷材料的多態(tài)性如圖1所示。

2.2 43 對(duì)EST-SSR 標(biāo)記的重復(fù)類型分析

43 對(duì)多態(tài)性的引物（多態(tài)率為37.7%）有24 種堿基重復(fù)類型，依次為GCG（5）、CTC（3）、GCC（3）、TGG（3）、GGC（2）、CGT（2）、CGC（2）、CCA（2）、CGA（2）、GAC（2）、CCG（2）、CGG（2）、AGC（1）、GCT（1）、CAC（1）、TCA（1）、GCA（1）、GAG（1）、TTA（1）、GGA（1）、CCT（1）、ATC（2）、TGA（1）、GTG（1），其中，GCG 數(shù)量最多，占43 對(duì)多態(tài)性引物堿基重復(fù)的12%（圖2）。

圖2 多態(tài)性引物比例及三堿基重復(fù)SSR 類型分布Fig.2 Proportion of polymorphic primers and distribution of trinucleotide repeat SSR types

2.3 43 對(duì)引物基元的Rp 值分析

從表3 可以看出，三堿基重復(fù)引物的等位基因大 小 為50～500 bp，條 帶 數(shù) 為5（RYW206）～20（RYW174）條。RYW174 的等位基因條帶最多（20 條），位點(diǎn)范圍為50～500 bp；RYW206 的等位基因條帶最少（5 條），位點(diǎn)范圍為100～250 bp，Rp值為1.00（RYW199 和RYW205）～3.00（RYW176、RYW178 和RYW179），平 均 為2.09；-----Rp 值為0.33（RYW205）～1.00（RYW176、RYW178和RYW179），平 均 為0.74，其 中RYW205 的Rp 值 與-----Rp 值 均最低。

表3 多態(tài)性SSR 引物分辨率Tab.3 Primer resolving power of polymorphic SSR

43 個(gè)SSR 標(biāo)記的分布頻次中，可以看出Rp 值在0～1.0、1.0～1.5、1.5～2.0、2.0～2.5 和2.5～3.0時(shí)，分別包含2（4.65%）、6（13.95%）、11（25.58%）、15（34.88%）和9（20.93%）個(gè)標(biāo)記，其中在2.0～2.5 標(biāo)記頻次最多，在0～1.0 標(biāo)記頻次最少。

續(xù)表3 多態(tài)性SSR 引物分辨率Tab.3（Continued） Primer resolving power of polymorphic SSR

2.4 EST-SSR 標(biāo)記的遺傳參數(shù)分析

從表4 可以看出，43 對(duì)引物的觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）為2～3 個(gè)（平均2.744 2 個(gè)），其中11 個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生了2 個(gè)變異，32 個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生了3 個(gè)變異；有效等位基因數(shù)（Ne）為1.851 9～2.941 2（平均2.401 1）。43對(duì)引物的多樣性指數(shù)（I）為0.562 3～1.098 6（平均0.916 0），觀測(cè)雜合度（Ho）為0.166 7～1.000 0（平均0.549 2），期望雜合度（He）為0.428 6～0.750 0（平均0.632 1），Nei′s 期望雜合度（Nei）為0.375 0～0.666 7（平均0.566 5），多態(tài)性信息含量（PIC）為0.239 2～0.810 2（平均0.625 2）。可以看出，RYW176 的遺傳多態(tài)性最豐富，RYW199 和RYW206 遺傳多態(tài)性最低。

表4 三核苷酸重復(fù)多態(tài)性SSR 的遺傳參數(shù)Tab.4 Genetic parameters of trinucleotide repeat polymorphism SSR

續(xù)表4 三核苷酸重復(fù)多態(tài)性SSR 的遺傳參數(shù)Tab.4（Continued） Genetic parameters of trinucleotide repeat polymorphism SSR

3 討論

3.1 EST-SSR 標(biāo)記的通用性

SSR 分子標(biāo)記是以擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度變異作為多態(tài)性的共顯性分子標(biāo)記，而EST-SSR 標(biāo)記是由于微衛(wèi)星序列重復(fù)的長(zhǎng)度及數(shù)目變化極其豐富，較SSR 標(biāo)記的多態(tài)性好、特異性強(qiáng)且易于檢測(cè)，已廣泛應(yīng)用于植物各水平遺傳多樣性、分子系統(tǒng)學(xué)、品種和純度鑒定、基因定位、遺傳圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)等方面研究[5]。本研究基于黍稷的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)了114 對(duì)EST-SSR 引物，具有多態(tài)性的引物為43對(duì)，即多態(tài)率為37.7%，高于王銀月[28]、JIANG[26]開發(fā)的EST-SSR 引物多態(tài)性（分別為6.7% 和12.5%），但略低于何杰麗等[27]研究的EST-SSR 引物多態(tài)性（40%），其原因可能與本研究選取的標(biāo)記均為三核苷酸重復(fù)標(biāo)記，以及黍稷材料的來源與前人研究不同有關(guān)。但整體來看，所篩選的多態(tài)性EST-SSR 引物是基于黍稷的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，且多態(tài)性達(dá)37.7%，可以用于研究黍稷材料的多樣性分析。

3.2 EST-SSR 標(biāo)記的多態(tài)性

SSR 標(biāo)記的分辨率Rp 值可以反映引物對(duì)有效等位基因的分辨力，即衡量遺傳多樣性。Rp 值越高，表明遺傳多樣性越豐富。本研究發(fā)現(xiàn)Rp 值介于1.00～3.00，平均為2.09，與RAJPUT 等[22]、薛延桃等[29]和王璐琳等[30]研究發(fā)現(xiàn)，黍稷引物Rp 值分別為0.25～14.75（平均為2.71）、0.334～4.002（平均為1.51）和0.333～2.333（平均為1.059）研究結(jié)果基本一致。王璐琳等[30]、劉笑瑜等[31]、連帥等[32]、薛延桃等[29]和寇淑君等[33]的研究發(fā)現(xiàn)，基因多樣性指數(shù)（I）分 別 為0.490 2、0.627 5、0.628 4、0.770 8 和0.847 8；PIC 值 分 別 為0.432 1、0.472 3、0.485 5、0.554 4和0.587 4。本研究結(jié)果多樣性指數(shù)（0.916 0）及PIC 值（0.625 2）均高于上述研究，一方面可能由于本試驗(yàn)供試材料選擇的有關(guān)引物多態(tài)性高，同時(shí)參試材料種類少，遺傳多樣性可能不夠豐富；另一方面可能由于所用的檢測(cè)方法分辨率更高，準(zhǔn)確性更好。這也表明對(duì)已開發(fā)的黍稷EST-SSR 標(biāo)記進(jìn)行進(jìn)一步篩選的必要性，應(yīng)篩選高多態(tài)性引物用于黍稷遺傳多樣性研究和DNA 指紋圖譜的構(gòu)建。此外，建立高分辨率且成本較低的分子標(biāo)記檢測(cè)方法，對(duì)于促進(jìn)黍稷遺傳多樣性研究也具有非常重要的意義。

4 結(jié)論

本研究從黍稷轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的SSR 序列中設(shè)計(jì)了114 對(duì)三堿基重復(fù)引物，利用6 份地理來源差異較大的黍稷材料進(jìn)行多態(tài)性篩選，114 對(duì)引物中擴(kuò)增出43 對(duì)多態(tài)性引物，多態(tài)率為37.7%，Rp 值介于1.00～3.00（平均2.09），多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息含量的均值分別為0.916 0 和0.625 2，說明43 對(duì)引物為高度多態(tài)性引物，可以用于栽培黍稷的指紋圖譜構(gòu)建和種質(zhì)遺傳多樣性分析。