天然多糖抑菌活性及機理研究進展

張 彤，趙 蕓，黃 偉，崔宏春

（1.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，武漢 430068；2.杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院，杭州 310015；3.湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院，武漢 430075）

近些年來，傳染性疾成為世界范圍內(nèi)日益嚴重的公共衛(wèi)生問題，每年報告的食源性疾病病例約4 800萬例，東南亞和地中海東部流行率最高。食源性病原體是造成傳染病的主體。盡管如此，食源性疾病并不局限于發(fā)展中國家，美國的食物鏈被認為是世界上最安全的，但每年仍有約128 000人因此住院、3 000人死亡［1，2］。

為了延長保質(zhì)期，在食品中加入食品防腐劑（如亞硝酸鹽和二氧化硫）是較為普遍的做法。然而，大多數(shù)食品防腐劑是通過化學合成開發(fā)的，長期食用合成防腐劑可能會對人體產(chǎn)生不良影響［3］，需要尋找對人體無害的適合用于食品中的天然防腐劑。

高感染率和長期接觸抗生素導致微生物對抗生素產(chǎn)生耐藥性［4］。全球范圍的微生物耐藥性促使人們從海洋、陸地等尋找天然存在的候選藥物、防污劑和食品保鮮劑［5］。因此，新的抗微生物藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)受到廣泛關(guān)注。

多糖的生物活性一直是國內(nèi)外科學領(lǐng)域的研究熱點，近年來，從植物、動物、真菌、海藻等自然資源中分離出的多糖因具有多種藥理活性，如抗腫瘤［6］、免疫調(diào)節(jié)［7］、抗氧化［8］、抗炎［9］等而受到越來越多的關(guān)注。多糖是一種天然高分子聚合物，通常由10多種單糖通過糖鏈或支鏈連接而成，分子質(zhì)量為數(shù)萬Da甚至數(shù)百萬Da，它們廣泛存在于植物、微生物、藻類和動物中［10，11］。與蛋白質(zhì)和多核苷酸類似，多糖是生命活動中必不可少的大分子，它們參與許多生物過程，如細胞間通訊、細胞粘附、細菌或病毒感染以及細胞免疫等過程。因此，多糖與多核苷酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)一起構(gòu)成生命科學中最重要的四大生物大分子［12］。

多種天然多糖對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抗菌活性。研究表明，殼聚糖比殼寡糖具有更高的抗菌活性，對大多數(shù)細菌的生長均有明顯的抑制作用，且殼聚糖對革蘭氏陽性菌的殺菌作用一般強于革蘭氏陰性菌。由于殼聚糖可溶于大多數(shù)pH低于6的有機酸，因此研究的上限pH為5.9，在這個范圍內(nèi)，殼聚糖的抗菌活性受pH影響，pH越低，其抗菌活性越強［13］。同時，不同DD（脫乙酰度）的殼聚糖水溶液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果也不同，隨著殼聚糖DD的增加，抑菌效果也增強［14］。

天然k-卡拉膠不具備抗菌活性，經(jīng)氧化處理后對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和單核細胞增生李斯特菌表現(xiàn)出抑菌效果，并且氧化型k-卡拉膠對以上4種細菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度隨著氧化水平的升高而逐漸降低。掃描電鏡分析了細菌細胞形態(tài)變化，可知氧化型k-卡拉膠能破壞細菌細胞壁和細胞膜，能有效抑制細菌的生長［15］。

許多種天然多糖對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抗菌活性，來源廣泛，具有生物相容性和明顯無毒性，可作為新型抗菌劑廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、化妝品等行業(yè)，但目前關(guān)于多糖的抑菌機理尚沒有確切的說法，本文從以下幾個方面進行概述。

1 不同種類的抑菌天然多糖

目前，具有抗菌活性的天然多糖已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、環(huán)保、家用及個人護理用品等領(lǐng)域，如殼聚糖、黃原膠、黃芪多糖等。不同種類天然多糖的抑菌效果或機制、劑量及試驗菌種見表1。

表1 具有抑菌作用的天然多糖

2 天然多糖的抑菌機制

2.1 破壞細菌細胞壁和細胞膜

細胞壁在細胞膜外是一個厚而堅韌的微彈性結(jié)構(gòu)，它可以維持細胞形態(tài)，增加細胞的機械強度，還參與一系列生理活動，如物質(zhì)運輸、減少蒸騰、防止水分流失等［25，26］。細胞膜為細胞的生命活動提供了一個相對穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境，同時也起屏障的作用。膜兩側(cè)的物質(zhì)不能自由通過，細胞膜會選擇性地運輸物質(zhì)。細胞與周圍環(huán)境的物質(zhì)交換是通過細胞膜的轉(zhuǎn)運功能來實現(xiàn)的。細胞膜在細胞與外部環(huán)境之間的能量轉(zhuǎn)換和信號轉(zhuǎn)導過程中也發(fā)揮重要作用［27-29］。

2.1.1 增大細胞壁和細胞膜的通透性 Wang等［17］采用堿性磷酸酶（AKP）、β-半乳糖苷酶2個指標觀測多糖對細胞壁和細胞膜通透性的破壞，AKP存在于細胞壁和細胞膜之間，β-半乳糖苷酶位于細胞膜內(nèi)。試驗結(jié)果表明，空白對照組和添加了黃原膠低聚糖的試驗組培養(yǎng)基中AKP活性在2～6 h基本維持不變，這說明金黃色葡萄球菌的細胞壁是完整的；對照組的β-半乳糖苷酶活性基本不變，而試驗組的β-半乳糖苷酶活性顯著增加。說明黃原膠低聚糖能提高金黃色葡萄球菌的細胞膜通透性，但對細胞壁幾乎沒有影響。

Zhou等［16］使用NPN探針的熒光強度作為指標來探測細胞外膜通透性的改變，以O(shè)NPG作為指標測定β-半乳糖苷酶濃度來觀察內(nèi)膜是否受損，結(jié)果表明綠茶多糖（gTPC）可提高大腸桿菌的外膜通透性，但對大腸桿菌細胞內(nèi)膜通透性無顯著影響。總的來說，gTPC增強了大腸桿菌外膜的通透性，破壞了大腸桿菌細胞膜的完整性。

Meng等［30］使用抑菌圈法測定了核桃分心木多糖對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌的抗菌活性，結(jié)果表明核桃分心木多糖對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有顯著的抗菌活性，其抗菌活性隨濃度的增加而增加。多糖可以增大大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞壁和細胞膜的通透性，這種變化導致細胞內(nèi)水溶性蛋白質(zhì)迅速增加，從而阻止營養(yǎng)物質(zhì)的輸入。He等［21］的試驗結(jié)果也表明多糖提高了金黃色葡萄球菌細胞質(zhì)膜的通透性。

以上說明多種天然多糖能夠提高細菌細胞膜的通透性，導致細胞內(nèi)水溶性蛋白滲漏，營養(yǎng)物質(zhì)無法輸入，從而達到抑菌效果。

2.1.2 破壞細胞壁和細胞膜的完整性 Chen等［24］探究了三葉青多糖對大腸桿菌的抑菌機制，SEM結(jié)果表明，與未添加多糖的空白組相比，添加了三葉青多糖的試驗組的細菌發(fā)生了細胞破裂，有的細菌表面有空洞，這表明多糖破壞了細胞壁和細胞膜的完整性。

He等［21］從弗吉尼亞鏈霉菌H03發(fā)酵液中分離得到一種新的多糖，并對金黃色葡萄球菌進行抑菌試驗。TEM結(jié)果表明，經(jīng)多糖處理過的金黃色葡萄球菌細胞壁總是破碎、變厚并出現(xiàn)一些溶解現(xiàn)象，這表明抗菌多糖對細胞壁有嚴重的影響。此外，金黃色葡萄球菌的形態(tài)發(fā)生了很大改變，細胞變得不規(guī)則、皺縮和相互粘附，同時金黃色葡萄球菌上清液水溶性蛋白含量迅速增加，這表明金黃色葡萄球菌的細胞可能被多糖破壞，導致蛋白溶解、必需分子滲漏和細胞死亡。

Khemakhem等［20］也發(fā)現(xiàn)橄欖葉多糖對腸道沙門菌和藤黃微球菌有較強的抑菌作用，多糖的這種最高抗菌活性可能是由細菌的細胞壁和細胞膜破裂引起的。Zhou等［16］通過掃描電鏡和透射電鏡觀察經(jīng)綠茶多糖（gTPC）處理后的大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，部分細胞壁變模糊，細胞質(zhì)內(nèi)容物滲漏，細胞膜表面粗糙、不規(guī)則，并且通過流式細胞儀進一步證實gTPC破壞了大腸桿菌細胞膜的完整性。

由此可見，天然多糖的加入能夠破壞細菌細胞壁和細胞膜的完整性，細胞壁破碎變厚溶解，細胞內(nèi)容物流出，菌體形態(tài)也變得不規(guī)則、皺縮，必需分子滲漏從而達到抑菌的效果。

2.2 阻礙細菌代謝

代謝是細菌最基本的特征之一，包括細胞內(nèi)所有的化學和物理反應(yīng)。細菌的代謝包括合成代謝和分解代謝。分解代謝為合成代謝提供能量和原料，而合成代謝是分解代謝的基礎(chǔ)。

根據(jù)Kochanowski等［31］的研究，大腸桿菌生長與FBP（1，6-二磷酸果糖）濃度有關(guān)，大腸桿菌增殖速度越快，F(xiàn)BP濃度越高。果糖-6-磷酸（F6P）通過6-磷酸果糖激酶-1（6-PFK-1）的催化作用轉(zhuǎn)化為FBP，是糖酵解的重要過程。

Chen等［24］研究表明，三葉青多糖的加入抑制了6-PFK-1酶活性，即抑制了F6P的二次磷酸化，從而阻礙了大腸桿菌的糖酵解和糖異生過程，使大腸桿菌不能獲得足夠的能量物質(zhì)，如三磷酸腺苷（ATP）或還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH+），從而導致大腸桿菌的生長受到抑制。

2.3 抑制細菌生物膜的形成

細菌生物膜（Bacterial bioflim，BBF）也稱生物膜，是生活在細胞外聚合物基質(zhì)中的微生物聚集體，它們通過細胞外聚合物分子粘附在生物和非生物表面，除非迅速清洗，否則無法去除，是與游走態(tài)細胞相對應(yīng)的另一種存在方式［32］。微生物生物膜是否會在無生命或固體表面形成，是一種胞外多糖基質(zhì)形成的結(jié)果，它為生物膜中微生物的相互作用提供了強度［33］。細菌在生物膜狀態(tài)下比游走狀態(tài)更加難以應(yīng)付，生物膜的形成是導致抗菌治療失敗的重要原因［34］。因此，控制生物膜的形成或者消除成熟的生物膜是抗菌的防治策略之一。

Wang等［17］采用結(jié)晶紫染色法測定了黃原膠低聚糖對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響。結(jié)果表明，空白對照組隨著時間的增加，595 nm處的吸光度也不斷增加，而添加了最低抑菌濃度的黃原膠低聚糖的試驗組，隨著時間的增加吸光度始終維持在較低水平，這表明多糖抑制了金黃色葡萄球菌生物膜的形成。

2.4 抑制酶活性與提高細胞內(nèi)離子水平

鈣離子是所有細胞中各種細胞過程的重要調(diào)節(jié)因子，是細胞質(zhì)功能的核心因子［35］。鈣離子在細胞質(zhì)中的積累導致細胞內(nèi)活性氧水平的增加，從而導致細胞質(zhì)功能障礙和細胞凋亡［36］。

Ca2+-Mg2+-ATP酶是細胞膜上的一種鈣泵，它能水解ATP，將細胞內(nèi)鈣離子泵送到細胞外，維持細胞內(nèi)鈣離子濃度相對較低，從而保持細胞的穩(wěn)定性并確保細胞的正常功能。

Wang等［17］研究表明，未添加多糖的空白對照組Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性基本維持不變，而添加了黃原膠低聚糖的試驗組的酶活性明顯下降，同時細胞質(zhì)中鈣離子濃度顯著線性增加。這表明黃原膠低聚糖抑制了金黃色葡萄球菌細胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，從而導致細胞內(nèi)鈣離子不能及時轉(zhuǎn)移至細胞外，細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子累積，從而對金黃色葡萄球菌的生長起到了抑制作用。

Wang等［18］發(fā)現(xiàn)GCP作用于金黃色葡萄球菌細胞膜的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性0～8 h明顯下降，這說明GCP能有效抑制Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。同時，GCP處理的金黃色葡萄球菌細胞質(zhì)中鈣離子的相對水平在0～8 h呈線性增加，表明Ca2+-Mg2+-ATP酶活性受GCP的限制，細胞質(zhì)中鈣離子的積累會導致細胞內(nèi)活性氧含量增加和細胞質(zhì)功能紊亂，從而導致細胞凋亡，達到抑菌效果。

2.5 降低基因轉(zhuǎn)錄水平

Wang等［17］測定了與金黃色葡萄球菌生物膜形成相關(guān)的基因，未添加黃原膠低聚糖的對照組中，金黃色葡萄球菌的fnbA、fnbB和clfB3個基因的相對轉(zhuǎn)錄（RT）水平均在1.0左右，最低抑菌濃度的黃原膠低聚糖干預(yù)4 h后，金黃色葡萄球菌這3個基因的RT水平明顯降低。結(jié)果表明，黃原膠低聚糖對金黃色葡萄球菌生物膜形成相關(guān)基因具有抑制作用。

2.6 降解質(zhì)粒DNA

He等［21］發(fā)現(xiàn)多糖可以與質(zhì)粒DNA結(jié)合，然后分解成小塊。多糖對質(zhì)粒DNA有顯著的降解作用，因此，DNA可能是多糖抑菌的作用靶點。

2.7 耗散細胞膜電位

Wang等［18］使用產(chǎn)自球毛殼菌的多糖（GCP）對金黃色葡萄球菌進行抑菌試驗，研究了GCP對膜電位的影響，發(fā)現(xiàn)GCP能耗散膜電位，引起金黃色葡萄球菌細胞膜去極化。細胞膜去極化將通過細胞質(zhì)膜電壓門控鈣離子通道（Cch1/Mid1復(fù)合物）和其他未知轉(zhuǎn)運通道誘導攝取鈣離子［36］，從而誘導細胞凋亡和程序性細胞死亡。

2.8 多糖的高鐵螯合作用

由于鐵是細菌生長的必需元素，因此通過清除環(huán)境中的鐵來抑制細菌對鐵的吸收是多糖可能的抗菌機理，具有高鐵（III）親和力的螯合劑已被證明具有抗菌活性［37，38］。

Shao等［39］研究表明，滸苔羧甲基化降解多糖（CDPE）通過羧基和羥基與鐵結(jié)合，具有較低的鐵（Ⅲ）結(jié)合親和力，而滸苔異羥肟酸化降解多糖（HCDPE）能以相對高的親和力結(jié)合鐵（Ⅲ）。與CDPE相比，HCDPE對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌和銅綠假單胞菌表現(xiàn)出更強的抗菌活性，也具有更低的最小抑菌濃度值。

3 影響多糖抑菌效果的因素

雖然具有抗菌活性的天然多糖已被廣泛發(fā)現(xiàn)，但仍有大部分的天然多糖被證實不具有或具有微弱的抗菌活性，天然多糖的結(jié)構(gòu)與其生物活性緊密相關(guān)。通過改變原有結(jié)構(gòu)，能夠使部分多糖呈現(xiàn)出較強的抗菌活性，因此探究抗菌多糖的構(gòu)效關(guān)系，揭示多糖的抗菌活性和其結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，成為當下的一大研究熱點。

3.1 分子質(zhì)量對抗菌活性的影響

Fleita等［23］從紅藻中提取了高分子質(zhì)量的S1組分多糖和低分子質(zhì)量的S2組分多糖，并對金黃色葡萄球菌進行抑菌試驗。結(jié)果顯示，S1部分組分比標準抗生素顯示出更高的抑菌活性，而S2組分沒有顯示任何抗菌作用。

Han等［22］采用濾紙片瓊脂擴散法進行了構(gòu)樹果實多糖（BPPs）對4種細菌的抑菌試驗。結(jié)果表明，在3種多糖組分中，相對小分子質(zhì)量的BPP-3對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性最好，且BPP-3的MIC（最低抑菌濃度）值低于其他2個組分。

3.2 聚合度對抗菌活性的影響

Ho等［40］使用木糖多糖和木糖寡糖測定人體糞便細菌對其體外的發(fā)酵能力，發(fā)現(xiàn)低聚合度的木糖寡糖比高聚合度的木糖多糖更易于被有益細菌吸收利用。

3.3 多糖改性對抗菌活性的影響

通過硫酸化、乙?；?、硒化、羧甲基化等化學修飾方法改變多糖的取代基，能夠使部分多糖表現(xiàn)出較強的抑菌活性。Li等［19］對杏鮑菇多糖（PEPS）和嗜熱鏈球菌胞外多糖（ST1275 EPS）進行硫酸化處理，并測定硫酸化多糖和粗多糖的抗菌活性。結(jié)果表明，硫酸化PEPS的抗菌活性強于PEPS，硫酸化ST1275-EPS的抗菌活性強于ST1275-EPS，這表明磺化是提高多糖生物活性的一種有效的改性方法，通過在多糖中引入硫酸基，可以提高PEPS和ST1275 EPS對細菌細胞壁和細胞膜的破壞能力，從而使硫酸化PEPS和ST1275 EPS具有更強的抗菌活性。

Moratti等［41］總結(jié)了殼聚糖化學改性的幾種方法，發(fā)現(xiàn)殼聚糖的季銨鹽化，如N，N，N-三甲基殼聚糖碘化物，對幾種細菌的MIC值較未改性殼聚糖低；殼聚糖的羧甲基化則提高了殼聚糖的溶解度，O-羧甲基化殼聚糖（OCMC）比殼聚糖更能抑制細菌的生長。

4 結(jié)論及展望

具有抗菌活性的天然多糖種類很多，但其作用機制并無顯著差別，主要通過破壞細菌的細胞壁和細胞膜、調(diào)控細菌內(nèi)酶活性和離子水平、調(diào)控能量代謝、影響基因等方面，達到抑菌效果，并且其抗菌活性與分子大小、聚合度、取代基等構(gòu)效關(guān)系密切相關(guān)。

目前，天然多糖抗菌方面的研究主要集中在抗菌活性及作用機制上，對多糖的構(gòu)效關(guān)系研究較少，研究中尚存在一些問題亟待解決，因此開展多糖構(gòu)效關(guān)系研究對抗菌功能性食品的研發(fā)具有重要意義。