屎腸球菌QH06能減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的結(jié)腸黏膜損傷

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種慢性復(fù)發(fā)性炎癥性腸道疾病，病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確。目前認(rèn)為，遺傳易感個(gè)體中腸道菌群的異常免疫應(yīng)答可能在UC的發(fā)病機(jī)理中起主要作用。由于UC發(fā)病過(guò)程中腸黏膜屏障的破壞和免疫系統(tǒng)的異常激活均與腸道菌群失衡有關(guān)，因此在治療過(guò)程中應(yīng)用微生態(tài)調(diào)節(jié)劑來(lái)調(diào)節(jié)腸道菌群失衡尤為重要。益生菌是可定植于腸道并在宿主體內(nèi)發(fā)揮有益作用的一類(lèi)活性細(xì)菌，大多數(shù)人的益生菌屬于乳酸菌屬和雙歧桿菌屬，主要通過(guò)調(diào)節(jié)腸道免疫功能和腸道菌群來(lái)發(fā)揮作用。

通過(guò)將最危險(xiǎn)剖面Ⅱ-Ⅱ?qū)隡IDAS/GTS中，并根據(jù)表1數(shù)據(jù)對(duì)各種材料屬性進(jìn)行定義.模型為二維數(shù)值分析模型，尺寸大小為170 m×80 m，共劃分為8 864個(gè)單元，15 623個(gè)節(jié)點(diǎn).分別設(shè)置樁界面接觸與錨索界面接觸來(lái)模擬抗滑樁與土體、預(yù)應(yīng)力錨索與土體的相互作用.同時(shí)將教學(xué)樓與幼兒園等建筑荷載等效為均布荷載作用在坡體上.最危險(xiǎn)Ⅱ-Ⅱ剖面有限元網(wǎng)格模型如圖3所示.

屎腸球菌（）屬腸球菌屬，是人及動(dòng)物腸道中正常菌群的一部分。其一直被認(rèn)為是醫(yī)院獲得性感染的主要原因，但近期研究發(fā)現(xiàn)部分屎腸球菌菌株具有益生作用。研究顯示，屎腸球菌定植可改善宿主腸道上皮防御能力，定期攝入屎腸球菌CRL183可減輕DSS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎損傷。在飼料中添加屎腸球菌NCIMB11181可以提高飼料轉(zhuǎn)化效率，減少沙門(mén)氏菌在宿主腸道中的定植。從發(fā)酵飲料中分離得到的屎腸球菌OV3-6也具有良好的益生菌潛力。此外，屎腸球菌在不同動(dòng)物體內(nèi)顯示出不同的益生作用，其可通過(guò)黏附腸道表面形成保護(hù)屏障、降低腸道pH、維持菌群平衡，可用于幼畜的腸道保健和動(dòng)物腸道菌群失調(diào)的防治。

研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體（TLRs）通過(guò)對(duì)入侵機(jī)體的病原體產(chǎn)生免疫應(yīng)答來(lái)維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，某些常駐腸道細(xì)菌亞群通過(guò)TLR2信號(hào)通路誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性免疫反應(yīng)。因此益生菌治療UC過(guò)程中腸道菌群和TLR2蛋白表達(dá)的變化以及兩者之間的相關(guān)性關(guān)系的檢測(cè)，為UC發(fā)病機(jī)制和藥物治療機(jī)制的明確提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

由上可知，部分屎腸球菌菌株具有腸道保護(hù)作用，但屎腸球菌QH06對(duì)腸道損傷是否具有修復(fù)作用未見(jiàn)報(bào)道?；诖耍狙芯恐型ㄟ^(guò)TNBS/乙醇灌腸法建立大鼠UC模型，用屎腸球菌QH06進(jìn)行灌胃干預(yù)，檢測(cè)結(jié)腸組織中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10的mRNA和蛋白表達(dá)水平及Toll樣受體2（TLR2）的蛋白表達(dá)水平，利用Illumina Miseq 測(cè)序技術(shù)對(duì)大鼠結(jié)腸組織的腸道菌群進(jìn)行測(cè)序并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。探討屎腸球菌對(duì)Wistar大鼠UC的干預(yù)效果及其相關(guān)分子機(jī)制，為尋找治療UC的新方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 鼠齡6～8 周的SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量200±20 g（新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，保持室內(nèi)溫度25±3 ℃，相對(duì)濕度60%～80%，12 h明暗交替，自由飲食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（許可證號(hào)：IACUC20180814-15）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 屎腸球菌QH06凍干粉購(gòu)于山東中科嘉億生物工程有限公司，產(chǎn)品規(guī)格：活性屎腸球菌含量≥1×10cfu/g，水分＜6%。

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1.2.2 分組及給藥 36只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（12只）和模型組（24只），模型組大鼠用TNBS/乙醇灌腸法構(gòu)建大鼠UC模型，模型成功后將模型組大鼠隨機(jī)分成UC組和屎腸球菌組（組）；屎腸球菌組用屎腸球菌QH06灌胃干預(yù)，劑量為0.21 g/kg；為了消除灌胃器械造成的實(shí)驗(yàn)差異，正常對(duì)照組和UC組灌胃等量的蒸餾水，灌胃14 d，2次/d。

1.1.2 主要儀器與試劑 TNBS（Sigma）、乙醇（分析純，國(guó)產(chǎn)）、武漢基因美ELISA 試劑盒（貨號(hào)：IFN-γ JYM0654Ra、IL-4 JYM0647Ra、IL-10 JYM0654Ra、IL-12 JYM1006Ra）、TLR2抗體（BIOSS,bs1019R）、Trizol RNA 提取試劑（Invitrogen）；引物（上海生工基因）、Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Therom Scientific）、SYBRGreen Real-time PCR試劑盒（TaKaRa）、PCR儀（BIO-RAD）、全能型凝膠成像分析儀（BIO RAD-XR），分光光度計(jì)（NaNo DroP）、熒光定量PCR 儀（ABI 7500，QuantStudioTM Real-Time PCR System）、熒光倒置顯微鏡（萊卡）、Illumina高通量測(cè)序儀（上海美吉生物）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.8 免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織中TLR2的蛋白表達(dá)水平 免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟：制作石蠟切片→烤片1.5 h→二甲苯脫蠟→用梯度酒精進(jìn)行脫水→自來(lái)水沖洗→蒸餾水沖洗→滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑→PBS沖洗3次→檸檬酸修復(fù)液來(lái)抗原修復(fù)→蒸餾水沖洗2次→PBS沖洗2次→封閉→滴加一抗4 ℃過(guò)夜→PBS沖洗3次→滴加二抗37 ℃孵育30 min→顯色→蘇木素復(fù)染→脫水→透明→封片→干燥→閱片并使用Image-Pro Plus 6.0對(duì)相對(duì)光密度（IOD）進(jìn)行量化。

思維地圖類(lèi)型眾多的特點(diǎn)決定了它能應(yīng)對(duì)多種教學(xué)場(chǎng)合，也適合學(xué)生用于復(fù)習(xí)鞏固。使用思維地圖構(gòu)建相關(guān)知識(shí)的聯(lián)系，這本來(lái)便是思維發(fā)散和訓(xùn)練的過(guò)程，能讓學(xué)生對(duì)該學(xué)科有一個(gè)更清晰完整的系統(tǒng)認(rèn)知，在應(yīng)對(duì)問(wèn)題時(shí)能快速抓住關(guān)鍵信息，準(zhǔn)確找到合理的解決方法，真正達(dá)到融會(huì)貫通的目標(biāo)。■

1.2.3 大鼠一般情況及體質(zhì)量變化 每天觀察大鼠的活動(dòng)力、精神狀況、毛色、糞便形狀，干預(yù)前和干預(yù)結(jié)束時(shí)測(cè)定大鼠體質(zhì)量，進(jìn)行組間比較。

以小學(xué)語(yǔ)文四年級(jí)課程《頤和園》為例，課文描述了頤和園的宏偉壯麗，雕梁畫(huà)棟，色彩斑斕，集多國(guó)風(fēng)情于一體，氣勢(shì)恢宏，屬于園林建筑中的經(jīng)典，不僅讓學(xué)生了解了各國(guó)的文化，了解了我國(guó)相關(guān)時(shí)期的歷史和建筑造詣，更使學(xué)生了解到了“落后就要挨打”的硬道理。經(jīng)典毀于戰(zhàn)火，是我們不夠強(qiáng)大，因此，要?jiǎng)?lì)精圖治，自強(qiáng)不息。在對(duì)這一課程學(xué)習(xí)時(shí)，使用合作學(xué)習(xí)模式，可以分為多個(gè)小組，教師讓每個(gè)小組對(duì)于這篇課文進(jìn)行研讀，然后每個(gè)學(xué)生寫(xiě)出讀后感，每個(gè)小組寫(xiě)出讀后感，在全體同學(xué)面前進(jìn)行閱讀，并由全體同學(xué)進(jìn)行品評(píng)，主要的品評(píng)依據(jù)為文字表達(dá)能力、理解能力、朗讀能力等，并對(duì)學(xué)生進(jìn)行適當(dāng)指導(dǎo)和獎(jiǎng)勵(lì)，使學(xué)生增強(qiáng)學(xué)習(xí)的興趣和自信心。

1.2.4 標(biāo)本采集 禁食24 h的大鼠麻醉后取整段結(jié)腸組織并分3部分：（1）高通量測(cè)序部分：用無(wú)菌眼科剪刀及眼科鑷剪取1 cm左右大小的結(jié)腸組織，將其裝入2 mL無(wú)菌凍存管后迅速置于液氮中凍存并用干冰送檢；（2）組織病理學(xué)部分：剪取一部分結(jié)腸組織置于4%的多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色；（3）分子實(shí)驗(yàn)部分：剪取一部分分裝于滅菌EP管中，放入-80 ℃的冰箱保存，以上操作均為縱向剖開(kāi)結(jié)腸組織后進(jìn)行。

1.2.5 組織病理學(xué)檢測(cè) 用4%的多聚甲醛固定的結(jié)腸組織進(jìn)行脫水、包埋，取4 μm組織切片，進(jìn)行HE染色，參照文獻(xiàn)［14］的組織學(xué)評(píng)分標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)，由病理科專(zhuān)業(yè)人員盲法閱片，評(píng)分為4個(gè)等級(jí)，評(píng)分越高，表明黏膜損傷及炎癥程度越高（表1）。

1.2.6 RT-qPCR 法檢測(cè)結(jié)腸組織中相關(guān)炎癥因子的mRNA表達(dá)水平 用勻漿機(jī)充分研磨大鼠結(jié)腸組織，加入1 mL TRIzol，采用氯仿異丙醇法提取結(jié)腸組織總RNA，用NanoDrop超微分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品濃度和純度，并經(jīng)凝膠成像儀鑒定后參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明取1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢大鼠IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10等mRNA序列，利用IDT 引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物（表2）。在ABI 7500（QuantStudioTM Real-Time PCR System）系統(tǒng)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.7 ELISA法檢測(cè)結(jié)腸組織中炎癥因子和TLR2的蛋白表達(dá)水平 將冷凍的結(jié)腸組織樣品中加入PBS（pH 7.4）后勻漿。樣品應(yīng)在4 ℃下操作。在2000～3000 r/min離心20 min后，收集上清液。分裝上清液用于ELISA分析。操作步驟按ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，大致如下：（1）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋?zhuān)唬?）微孔板中加樣；（3）加入HRP結(jié)合試劑（空白對(duì)照孔除外）；（4）溫育；（5）配液；（6）洗滌；（7）顯色；（8）終止；（9）450 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度；（10）用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果。

1.2.1 TNBS/乙醇灌腸法建立大鼠UC 模型 參照文獻(xiàn)［12,13］建立大鼠UC模型，5%的TNBS溶入等體積50%的無(wú)水乙醇中，用液體石蠟潤(rùn)滑的內(nèi)徑1.5 mm的硅膠灌緩慢注入保持仰臥姿勢(shì)的大鼠結(jié)腸內(nèi)（離肛門(mén)約8 cm處），注入完成后，輕輕拔出硅膠管并立即捏緊大鼠肛門(mén)使大鼠呈倒立姿勢(shì)保持1 min左右，TNBS/乙醇混合液能充分吸收后將大鼠放入干凈的清潔籠內(nèi)，正常對(duì)照組大鼠注入相應(yīng)體積的0.9%氯化鈉溶液灌腸，待大鼠自行清醒，自由飲水。造模第3天開(kāi)始用普通鼠飼料飼養(yǎng)。

1.2.9 結(jié)腸組織標(biāo)本16S rRNA多樣性測(cè)序 具體流程如下：提取結(jié)腸組織總DNA后，對(duì)結(jié)腸組織總DNA的濃度和純度進(jìn)行測(cè)定。提取的DNA為模板，對(duì)16SrRNA V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物為338F：ACTCCT ACGGGAGGCAGCAG，806R：GGACTACHVGGGT WTCTAAT；使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 對(duì)PCR產(chǎn)物純化，使用NEXTFLEXRapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫(kù)，利用Illumina公司的MiseqPE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0（IBM SPSS Statistics）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，多組間比較采用單因素方差分析，計(jì)量資料服從正態(tài)性和方差齊性時(shí)采用LSD-方法檢驗(yàn)，方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

我在口袋中尋找到車(chē)鑰匙，并把我的手機(jī)悄悄放到桌子上——瑞安事先非常清楚地表明，不要帶上手機(jī)，也不要寫(xiě)下地堡的位置。當(dāng)我悄悄走向出口時(shí)，沒(méi)人注意到我。我在途中還一把抓起那只裝滿藥物的行李箱?？雌饋?lái)，現(xiàn)在不太可能有其他人會(huì)需要它。

2 結(jié)果

2.1 屎腸球菌對(duì)UC大鼠體質(zhì)量的影響

與正常對(duì)照相比，造模組大鼠造模后第2天起出現(xiàn)食欲減退、精神萎靡，活動(dòng)量減少等現(xiàn)象，大部分大鼠出現(xiàn)稀便、粘液膿血便。造模第2天在正常對(duì)照組和UC組中，各隨機(jī)選擇2只大鼠，處理后對(duì)其結(jié)腸組織進(jìn)行肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，UC組大鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)充血、水腫和潰瘍等情況。根據(jù)一般特征和結(jié)腸組織觀察結(jié)果確定為UC模型造模成功。干預(yù)后，隨著屎腸球菌干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸出現(xiàn)大鼠增重、活動(dòng)量增多、大便成形等現(xiàn)象。干預(yù)結(jié)束后測(cè)定的體質(zhì)量結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，UC組大鼠體質(zhì)量明顯降低（＜0.01）；與UC組相比，屎腸球菌組大鼠體質(zhì)量有顯著升高（＜0.05，圖1）。

2.2 屎腸球菌減輕UC大鼠結(jié)腸組織損傷

與正常對(duì)照組相比，UC組大鼠結(jié)腸組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，腺體損傷嚴(yán)重，不同程度的腺體結(jié)構(gòu)消失，潰瘍深達(dá)肌層，表層可見(jiàn)纖維素樣滲出物并夾雜著壞死組織。與UC組相比，屎腸球菌組大多數(shù)大鼠結(jié)腸組織潰瘍面積縮小，見(jiàn)少許糜爛，但黏膜和黏膜下層仍有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分上皮細(xì)胞增生和肉芽組織形成，可能是潰瘍處于恢復(fù)狀態(tài)，3例大鼠潰瘍無(wú)明顯好轉(zhuǎn)（圖2）。

而真實(shí)的情況是——有得必有失。Tina夫婦都是看重事業(yè)的人，追求更高職位的同時(shí)，也犧牲了夫妻甜蜜相處的時(shí)光。上司的一個(gè)電話就可能破壞了兩個(gè)人的清閑周末，一次刻不容緩的業(yè)務(wù)談判就推遲了早早制定好的出游計(jì)劃。

2.3 屎腸球菌對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織中炎癥因子表達(dá)的影響

采用Simpson、Shannon、Ace、Chao指數(shù)比較各組大鼠腸道菌群多樣性。Simpson和Shannon反映微生物群落多樣性，Ace和chao指數(shù)反映微生物群落豐富度。與正常對(duì)照組相比，UC組Shannon、Ace和Chao指數(shù)均降低（＜0.05 或0.01），而Simpson 指數(shù)升高（＜0.05）；與UC組相比，屎腸球菌組Shannon、Ace和Chao 指數(shù)均升高（＜0.05），而Simpson 指數(shù)降低（＜0.05）。說(shuō)明UC組和正常對(duì)照組的腸道菌群多樣性存在差異，UC組大鼠腸道所含的物種種類(lèi)低于正常對(duì)照組。屎腸球菌QH06能夠提高腸道菌群豐富度（表4）。

2.4 屎腸球菌對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織炎癥因子mRNA表達(dá)水平的影響

與正常對(duì)照組相比，UC組中IL-12、IFN-γ和IL-10的mRNA 表達(dá)水平均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.05）；與UC 組相比，屎腸球菌組大鼠結(jié)腸組織IFN-γ和IL-12 的mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，表3）。

2.5 屎腸球菌對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織中TLR2表達(dá)的影響

各組大鼠腸道菌群在科水平上進(jìn)行組間差異檢驗(yàn)，結(jié)果顯示（圖8A），相對(duì)豐度前15的菌中，，，，和有組間差異；進(jìn)一步使用LEfSe分析軟件對(duì)3組樣本進(jìn)行多級(jí)物種差異判別分析（LDA），找到與豐度有顯著性差異的類(lèi)群，本次分析中選擇LDA 閾值為4 的物種。研究結(jié)果顯示（圖8B），,,和等菌在正常對(duì)照組中顯著富集。，，在UC組中顯著富集；，，，，和在屎腸球菌組中顯著富集。

2.1.1 病情觀察。在護(hù)理過(guò)程中護(hù)士必須了解患者的既往病史和基礎(chǔ)病用藥情況，以便進(jìn)行重點(diǎn)而有針對(duì)性的觀察和護(hù)理，觀察患者神志是否清楚，口唇甲床顏色，生命體征變化，出入量平衡情況，痰液色、量、性質(zhì)，大便顏色等并作好記錄，發(fā)現(xiàn)變化及時(shí)告知醫(yī)生。2.2.2 體溫監(jiān)測(cè)。對(duì)于發(fā)熱的患者做好日常的生活護(hù)理，密切觀察患者體溫變化情況，按醫(yī)囑采取有效降溫措施，如冰袋降溫，溫水擦浴。

2.6 屎腸球菌提高UC大鼠腸道菌群多樣性

采用Rank-abundance曲線解釋物種豐富度和均勻度。從圖5A可知，隨著樣本量的增加，曲線逐漸趨于平緩，說(shuō)明隨著樣本量的增加基本不能增加新OTU 數(shù)目。UC組曲線寬度小于正常對(duì)照組，說(shuō)明UC組腸道菌群多樣性較低。屎腸球菌組曲線寬度大于UC組，說(shuō)明干預(yù)后UC大鼠的腸道菌群多樣性升高。Pan和Core分析結(jié)果（圖5B、C）顯示，隨著樣本量的增加，總OTU和核心OTU的增加趨勢(shì)逐漸趨于平緩，說(shuō)明各組樣本量滿足評(píng)估物種所需的總物種和核心物種數(shù)的要求。Rarefaction Curve（圖5D）和Shannon Curve（圖5E）結(jié)果顯示，本次所測(cè)序的數(shù)據(jù)量合理。

2.7 各組大鼠腸道菌群Alpha 多樣性分析

與正常對(duì)照組相比，UC組IL-12和IFN-γ的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），IL-4和IL-10蛋白表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＞0.05）；與UC組相比，屎腸球菌組大鼠結(jié)腸組織IL-12、IFN-γ蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01或＜0.05），而IL-4蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（＜0.05，圖3）。

2.8 各組大鼠腸道物種組成分析

根據(jù)Venn圖譜分析發(fā)現(xiàn)，3組共有832種共有物種，其中正常對(duì)照組和UC組共有1031種，正常對(duì)照組和屎腸球菌組共有978種，UC組和屎腸球菌組共有893種；其中每組特有的物種有：正常對(duì)照組312種、UC組92種、屎腸球菌組181種（圖6A）；在門(mén)水平上，3組共有的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)（）、變形菌門(mén)（）和擬桿菌門(mén)（）（圖6B），結(jié)果顯示，UC組中變形菌門(mén)豐度明顯高于正常對(duì)照組，屎腸球菌干預(yù)后其豐度明顯下降；同時(shí)UC組中厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)豐度明顯低于正常對(duì)照組，屎腸球菌干預(yù)后其豐度升高；在科水平上，正常對(duì)照組中豐度大于1%的菌有11 種，UC 組中9 種，屎腸球菌組中11 種；Bar 圖（圖6C）結(jié)果顯示，UC 組中豐度最高的菌為，屎腸球菌組中豐度最高的為；在屬水平上，UC組中大腸埃希菌.志賀菌屬（）和克雷伯氏菌屬（）等條件致病菌的豐度明顯升高，屎腸球菌干預(yù)后其豐度下降，尤其的豐度下降尤為明顯（圖6D）。

2.9 與UC發(fā)生相關(guān)菌群在各組中的差異分析（屬水平）

雙歧桿菌（）和擬桿菌（）作為腸道中的優(yōu)勢(shì)菌，在營(yíng)養(yǎng)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而阿克曼氏菌可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，并且具有益生元效應(yīng)。本研究中，以上3種菌屬豐度在UC組中均下降，而屎腸球菌QH06干預(yù)后豐度升高，其中雙歧桿菌組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.01）。的出現(xiàn)通常與癌癥的發(fā)生有關(guān)，而是最典型的致病菌。本研究UC 組大鼠中和豐度均明顯升高，屎腸球菌干預(yù)后2者豐度明顯下降，但在同組不同樣本間的組內(nèi)差異較大，最終導(dǎo)致組間無(wú)顯著差異（圖7）。

2.10 物種差異分析（科水平）

TLR2蛋白主要表達(dá)在結(jié)腸組織黏膜層、黏膜下層的胞質(zhì)及胞膜中，為彌漫性黃色顆粒。正常對(duì)照組TLR2蛋白弱表達(dá)；UC組陽(yáng)性區(qū)域較明顯，染色深、分布密集。屎腸球菌組TLR2蛋白有不同程度的陽(yáng)性表達(dá)（圖4A～C）。ELISA法檢測(cè)3組大鼠結(jié)腸組織中TLR2蛋白表達(dá)情況結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，UC組TLR2表達(dá)顯著上調(diào)（＜0.01）。與UC組相比，屎腸球菌組TLR2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.01，圖4D）。

2.11 腸道菌群與炎癥因子、TLR2相關(guān)性分析

通過(guò)Spearman相關(guān)系數(shù)分析各組大鼠腸道菌群與細(xì)胞因子、TLR2 指標(biāo)相關(guān)性。相關(guān)性結(jié)果顯示（圖9），IFN-γ與呈正相關(guān)、而與、、、呈負(fù)相關(guān)；IL-10 與呈負(fù)相關(guān)；IL-4 和IL-12 與、呈負(fù)相關(guān)；TLR2 與、和呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

UC發(fā)病過(guò)程中免疫系統(tǒng)的異常激活與腸道菌群失衡有關(guān)，因此除調(diào)節(jié)腸道免疫外，輔助應(yīng)用益生菌、益生元和合生元等微生態(tài)調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)腸道菌群失衡在UC的治療中也尤為重要，其中益生菌通過(guò)調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)的腸道菌群、作用于腸道屏障、調(diào)節(jié)免疫等途徑維持宿主腸道的健康。大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的益生菌屬于乳酸菌屬和雙歧桿菌屬，而關(guān)于屎腸球菌作為益生菌的有效性的信息較少。本研究用屎腸球菌QH06干預(yù)TNBS/乙醇誘導(dǎo)的大鼠UC觀察結(jié)腸組織中相關(guān)細(xì)胞因子、TLRs以及腸道菌群的變化。

IL-12和IFN-γ作為T(mén)細(xì)胞介質(zhì)和UC相關(guān)的重要炎性細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)CD4T細(xì)胞往Th1細(xì)胞的方向分化。本研究發(fā)現(xiàn)，UC 大鼠結(jié)腸組織中IL-12 和IFN-γ的mRNA和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，說(shuō)明UC組大鼠結(jié)腸組織中Th1細(xì)胞活化，釋放IL-12和IFN-γ，使促炎因子釋放量增多，加速UC的發(fā)生發(fā)展。CD4T細(xì)胞可以被IL-4誘導(dǎo)分化為T(mén)h2細(xì)胞，Th2細(xì)胞分泌IL-4和IL-13介導(dǎo)體液免疫和超敏反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)UC組大鼠結(jié)腸組織中IL-4的mRNA和蛋白表達(dá)量均無(wú)顯著變化，說(shuō)明UC組大鼠結(jié)腸組織中促炎因子表達(dá)量高于抗炎因子，從而導(dǎo)致細(xì)胞因子平衡紊亂，促進(jìn)UC的失衡性發(fā)展。益生菌具有調(diào)節(jié)腸道微生物群、抑制病原菌粘附、增強(qiáng)胃腸道屏障功能、誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子和抑制促炎細(xì)胞因子等作用。本研究中，屎腸球菌QH06干預(yù)后大鼠結(jié)腸組織中IL-12和IFN-γ等促炎因子的mRNA和蛋白表達(dá)量均降低，抗炎因子IL-4的蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，說(shuō)明屎腸球菌QH06具有抑制促炎因子的表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子表達(dá)的功能。

通過(guò)對(duì)蘭科植物分布信息進(jìn)行研究分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)葉美冠蘭Eulophia zollingeri (Rchb. f.) J. J. Smith、大花無(wú)柱蘭Amitostigma pinguicula (Rchb. f. et S. Moore) Schltr.、長(zhǎng)葉山蘭Oreorchis fargesii Finet、廣東盆距蘭Gastrochilus guangtungensis Z. H. Tsi、芳線柱蘭Zeuxine nervosa (Lindl. ) Trimen、紫花鶴頂蘭Phaius mishmensis (Lindl.et Paxt.) Rchb. f.為貴州蘭科植物新分布。

細(xì)胞因子間的平衡可能與TLRs有關(guān)，TLRs作為先天免疫的主要模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別各種病原體相關(guān)的分子，被認(rèn)為是先天免疫和后天免疫之間的橋梁，當(dāng)腸道菌群紊亂引起條件致病菌大量繁殖時(shí)，病原體識(shí)別表達(dá)于腸道黏膜多種細(xì)胞中的TLRs，通過(guò)TLRs介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，觸發(fā)和調(diào)節(jié)先天免疫并誘導(dǎo)獲得性免疫，進(jìn)而激活腸黏膜的炎癥反應(yīng)造成UC的病情發(fā)展。因此腸道菌群、免疫和TLRs相關(guān)性研究有利于進(jìn)一步闡明UC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。TLR2作為T(mén)LR家族的主要成員，識(shí)別與革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的病原相關(guān)分子模式，它的激活可能使固有單層的腸單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺仔孕?yīng)細(xì)胞。研究報(bào)道顯示，在DSS誘發(fā)的IBD小鼠在患病期間，TLR2明顯上調(diào)，說(shuō)明TLR2表達(dá)的變化和隨后的先天免疫應(yīng)答的改變是IBD發(fā)病的原因。本研究結(jié)果顯示，UC大鼠結(jié)腸組織中TLR2表達(dá)量明顯上調(diào)，表達(dá)部位主要集中于黏膜層和黏膜下層，而屎腸球菌干預(yù)后UC大鼠結(jié)腸組織中TLR2表達(dá)量下調(diào)。研究報(bào)道顯示，屎腸球菌干預(yù)后的健康狗結(jié)腸組織活檢中TLR2和TNF-a的表達(dá)量減少，提示屎腸球菌對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織黏膜損傷的修復(fù)作用可能與TLR2介導(dǎo)的信號(hào)通路的抑制有關(guān)。

腸道菌群紊亂是UC發(fā)生的主要原因已被大量的實(shí)驗(yàn)證明。目前的理論認(rèn)為，腸道微生物組的改變會(huì)觸發(fā)異常的黏膜免疫反應(yīng)并導(dǎo)致慢性腸道炎性疾病的發(fā)展。本研究通過(guò)高通量測(cè)序分析了屎腸球菌干預(yù)后的UC大鼠腸道菌群的變化。本研究Rank-abundance曲線和α多樣性指數(shù)結(jié)果顯示，UC組大鼠的腸道菌群多樣性和豐富度下降，UC狀態(tài)下大鼠腸道抵御環(huán)境變化的能力減弱，腸道菌群發(fā)生紊亂。屎腸球菌組Rankabundance曲線和α多樣性指數(shù)結(jié)果均明顯高于UC組，屎腸球菌QH06干預(yù)后UC大鼠腸道菌群變得更為豐富，這有利于功能相近的物種及時(shí)代償另一種功能缺陷的物種。

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和微電子技術(shù)的發(fā)展，電機(jī)作為自動(dòng)化控制的執(zhí)行單元，越來(lái)越多地運(yùn)用在各種領(lǐng)域中，許多控制領(lǐng)域需要對(duì)多臺(tái)電機(jī)進(jìn)行同步協(xié)調(diào)控制，如軍事、航空、機(jī)器人控制。特別是近年來(lái)，隨著嵌入式技術(shù)和集成化的發(fā)展，其應(yīng)用范圍逐步擴(kuò)大，逐漸擴(kuò)展到普通民用行業(yè)，如小型雕刻機(jī)、運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)臺(tái)等[1]。在應(yīng)用中，對(duì)速度、位置的精度控制尤為重要，所以對(duì)于電機(jī)的控制要具有實(shí)時(shí)性。隨著電機(jī)控制技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)單個(gè)電機(jī)的控制已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。但對(duì)于多路電機(jī)系統(tǒng)，設(shè)計(jì)一種高性能低成本的控制系統(tǒng)很有必要。針對(duì)這種需求，本文設(shè)計(jì)了一種基于LM3S811的多路電機(jī)控制系統(tǒng)。

厚壁菌門(mén)會(huì)促進(jìn)食物中的熱量和各種營(yíng)養(yǎng)元素的吸收。常駐胃腸道細(xì)菌擬桿菌負(fù)責(zé)維持黏膜穩(wěn)態(tài)并為黏膜屏障提供保護(hù)，而變形菌門(mén)為UC組大鼠腸道中主要的優(yōu)勢(shì)菌。本研究中UC組大鼠結(jié)腸組織中厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)豐度明顯下降，同時(shí)變形菌門(mén)豐度明顯升高。UC組大鼠中厚壁菌、擬桿菌等優(yōu)勢(shì)菌的多樣性及數(shù)量的減少和變形菌的增多可能給機(jī)會(huì)性微生物提供優(yōu)勢(shì)，引起侵略性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致UC的惡性發(fā)展。屬水平研究結(jié)果顯示，UC 組大鼠中Klebsiella 和Escherichia-Shigella 等條件致病菌豐度明顯升高，而雙歧桿菌、阿克曼氏菌等益生菌或短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的豐度下降。在屎腸球菌QH06干預(yù)后，此趨勢(shì)逆轉(zhuǎn),說(shuō)明屎腸球菌QH06 對(duì)部分條件致病菌的生長(zhǎng)具有抑制作用?？扑缴线M(jìn)行的差異物種結(jié)果顯示，腸桿菌科（Enterobacteriaceae），普氏菌科（Prevotellaceae），消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae），Rikenellaceae 和Burkholderiaceae等物種3組間有差異。其中，UC組腸桿菌科豐度顯著高于正常對(duì)照組，而腸桿菌科豐度與促炎因子IFN-γ表達(dá)量呈正相關(guān)。許多研究報(bào)道顯示，在IBD患者中，潛在有害的變形菌門(mén)，特別是腸桿菌科的比例增加，與本研究結(jié)果一致。本研究中與UC組相比，屎腸球菌干預(yù)后腸桿菌科豐度顯著下降，而且正常對(duì)照組和屎腸球菌組間無(wú)顯著差異。其說(shuō)明屎腸球菌QH06通過(guò)抑制腸桿菌的生長(zhǎng)影響IFN-γ的表達(dá)，抑制異常免疫炎癥反應(yīng)的放大，有利于潰瘍的愈合。研究發(fā)現(xiàn)，在IBD 患者中Rikenellaceae，Christensenellaceae，Ruminococcaceae和Tannerellaceae等丁酸產(chǎn)生菌的豐度減少，其與腸道炎癥的發(fā)生和IBD的惡化有關(guān)。本研究中，屎腸球菌QH06干預(yù)后腸桿菌科豐度下降的同時(shí)，為腸上皮提供能量的Rikenellaceae的豐度顯著升高，說(shuō)明屎腸球菌促進(jìn)腸上皮細(xì)胞獲得能量，對(duì)腸道營(yíng)養(yǎng)吸收等功能的正常發(fā)揮至關(guān)重要，此可能為屎腸球菌組大鼠體重上升的原因之一。普氏菌科是一種短鏈脂肪酸（SCFA）產(chǎn)生菌，可維持腸道屏障的完整性和穩(wěn)定性，促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)。本研究中UC組普氏菌科豐度降低，而屎腸球菌干預(yù)后普氏菌科豐度升高，說(shuō)明屎腸球菌QH06通過(guò)提高普氏菌科的豐度，促進(jìn)SCFA的產(chǎn)生，給予腸上皮細(xì)胞提供能量，促進(jìn)已被破壞的腸道屏障的愈合。Burkholderiaceae豐度在UC大鼠腸道中降低，此結(jié)果與結(jié)腸癌模型大鼠實(shí)驗(yàn)中所獲得的結(jié)果一致。本研究中屎腸球菌干預(yù)后Burkholderiaceae豐度恢復(fù)到正常水平，提示屎腸球菌可能促進(jìn)Burkholderiaceae菌的生長(zhǎng)。

研究報(bào)道顯示，普氏菌主要激活TLR2，進(jìn)而促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的Th1免疫應(yīng)答，與本研究結(jié)果相反。本研究中普氏菌科豐度與TLR2，IFN-γ的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示UC大鼠腸道中普氏菌科豐度的降低，有利于TLR2 的過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致Th1 細(xì)胞的過(guò)度分化，而促進(jìn)IFN-γ等促炎因子的產(chǎn)生。而屎腸球菌通過(guò)促進(jìn)普氏菌的產(chǎn)生，抑制TLR2過(guò)表達(dá)和IFN-γ的過(guò)量產(chǎn)生，有利于潰瘍的愈合。然而，普氏菌科在炎癥的產(chǎn)生過(guò)程中到底扮演什么樣的角色需要進(jìn)一步研究。

本次研究中屎腸球菌QH06對(duì)TNBS誘導(dǎo)的大鼠UC有一定的治療效果，其對(duì)UC的干預(yù)作用機(jī)制可能與促炎細(xì)胞因子和TLR2蛋白表達(dá)的抑制有關(guān)。

在下塘電站巖體附近施測(cè)的5線綜合物探剖面較明顯地反映出F2、F3斷層和已知銀鉛鋅礦體的存在(圖4、6)，礦體產(chǎn)于高、低阻急劇變化的F3斷裂帶上，CSAMT剖面較清晰地顯示出深部高阻隱伏巖體和低阻隱爆角礫巖的空間形態(tài)，隱伏巖體主體埋深均在-300m標(biāo)高以下，隱爆角礫巖呈陡產(chǎn)狀產(chǎn)于F2和F3斷裂之間。