HMGB1下調(diào)的作用：通過抑制神經(jīng)元細(xì)胞自噬和凋亡減輕大鼠腦出血后的神經(jīng)元損傷

腦出血為神經(jīng)外科急癥，其特點(diǎn)是高死亡率和高發(fā)病率。雖然近年來在腦出血的診斷和外科手術(shù)治療等方面取得了很大的進(jìn)步，但是其預(yù)后仍較差，其致死率在過去的20年里沒有明顯降低。因此，了解腦出血的潛在作用機(jī)制和識(shí)別新的治療靶點(diǎn)來提高腦出血患者生存率刻不容緩。腦出血后的腦損傷機(jī)制與神經(jīng)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡激活和氧化應(yīng)激密切有關(guān)，這些會(huì)導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)元死亡。近年來，對(duì)腦出血模型的研究表明，自噬途徑在腦出血后損傷中也起著重要作用，自噬的調(diào)節(jié)可能成為腦出血治療的新靶點(diǎn)。高遷移率族蛋白1（HMGB1）是損傷相關(guān)分子模式的一部分，其廣泛表達(dá)于大多數(shù)真核細(xì)胞，包括神經(jīng)細(xì)胞。研究表明，HMGB1與細(xì)胞自噬、凋亡有關(guān)。缺血肝研究證實(shí)，抑制HMGBI釋放可同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡和自噬。HMGB1也能通過與Beclin 1相互作用以增強(qiáng)自噬，導(dǎo)致急性胰腺炎惡化。然而，HMGB1與腦出血后神經(jīng)元自噬和凋亡相關(guān)的機(jī)制目前仍沒有相關(guān)報(bào)道。本研究探討了HMGB1對(duì)腦出血大鼠紋狀體神經(jīng)元細(xì)胞自噬和凋亡的作用機(jī)制。

開展示范區(qū)及周邊的農(nóng)作物病蟲監(jiān)測(cè)與統(tǒng)一防治、土壤環(huán)境監(jiān)測(cè)工作，制定合理使用農(nóng)藥、化肥制度，加強(qiáng)技術(shù)指導(dǎo)和培訓(xùn)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠（四川成都達(dá)碩生物有限公司），20 只，體質(zhì)量250～300 g，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（川）2019-189。所有實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》執(zhí)行。

1.2 試劑與儀器

RIPA 裂解緩沖液、Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、膠原酶Ⅳ、RapidStep?ECL 試劑（中國(guó)成都里來生物科技有限公司）；Anti-Beclin 1 antibody（1∶1000）、Anti-Bcl-2 antibody（中國(guó)成都睿琪生物科技有限公司，1∶1000）；Anti-HMGB1 antibody（1∶2000）、Anti-Bax antibody（1∶2000）、Anti-Cleaved Caspase-3 antibody（中國(guó)成都旭海潤(rùn)東生物科技有限公司，1∶5000）；Anti-LC3-I/II Antibody（1∶1000）、HMGB1酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒（中國(guó)成都妍恩生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 造模 根據(jù)文獻(xiàn)［12］，建立膠原酶Ⅳ誘導(dǎo)的腦出血大鼠模型。用1%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，將其置于俯臥位，固定頭部。根據(jù)無菌操作的原理，沿經(jīng)度切開皮膚，露出顱骨，鈍性剝離骨膜，暴露前囟，選擇前囟前0.2 mm，矢狀縫右3.0 mm，顱骨下紋狀體處6.0 mm為注射點(diǎn)。用牙科鉆穿透該部位的顱骨，30號(hào)針頭順著顱骨孔進(jìn)入紋狀體部位約6 mm，將0.2 U/mL膠原酶Ⅳ用微量注射泵以0.5 μL/min的速度給藥，注射時(shí)間為4 min，注射完畢后，留針2 min防止藥物沿針道逆流，退針后用骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合皮膚。20只大鼠作為研究對(duì)象，腹腔注射20 g/L的戊巴比妥麻醉大鼠后處死，取紋狀體組織和血腫周圍腦組織樣本保存于-80 ℃以待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)Zea Longa評(píng)分法對(duì)造模進(jìn)行評(píng)估，1～3分為造模成功，選取造模成功的大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 Western blot檢測(cè)血腫周圍腦組織神經(jīng)元細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 給藥干預(yù)15 d后，處死大鼠，取血腫周圍腦組織樣本，低溫快速研磨成勻漿，通過使用RIPA裂解緩沖液提取蛋白，并通過Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè)。提取的蛋白通過SDSPAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，再用Tris-buffer稀釋的5%的脫脂奶粉封閉2 h，隨后，滴加50 μL的一抗，4 ℃孵育過夜，PBS洗膜，滴加二抗山羊抗兔IgG（HRP）抗體，室溫下與膜孵育1 h。最后，采用RapidStep?ECL試劑顯影目的條帶。β-肌動(dòng)蛋白被用作內(nèi)參。采用image J軟件計(jì)算各組灰度值。

1.3.2 分組 實(shí)驗(yàn)將20只Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，假手術(shù)組（Sham 組）、腦出血組、HMGB1 中和抗體治療（anti-HMGB1）組、control IgG組，5只/組。

1.3.3 給藥 Sham組顱內(nèi)注射2μL生理鹽水，術(shù)后尾靜脈注射PBS，6 h后再次注入等量PBS；腦出血組顱內(nèi)注射0.2 U/mL膠原酶Ⅳ，術(shù)后尾靜脈注射PBS，6 h后再次注入等量PBS；anti-HMGB1組顱內(nèi)注射0.2 U/mL膠原酶Ⅳ，術(shù)后尾靜脈注射1 mg/kg anti-HMGB1單克隆抗體，6 h后再次注入等量抗體；control IgG組顱內(nèi)注射0.2 U/mL膠原酶Ⅳ，尾靜脈注射1 mg/kg anti-IgG單克隆抗體，6 h后再次注入等量抗體。

2016年，Kosynkin等[9]研發(fā)了一種可應(yīng)用于高溫、高鹽度儲(chǔ)層的納米粒子示蹤劑。該技術(shù)的應(yīng)用證明了納米粒子在示蹤地層情況方面具有重要的作用，為油田示蹤劑的研發(fā)提供了新的思路。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

選取我院心臟外科2016年6月～2017年6月留置尿管7天以內(nèi)的患者100例。其中男55例，女45例，年齡21～60歲，先心病30例，瓣膜病40例，冠心病30例，采用隨機(jī)分原則分為觀察組與對(duì)照組，各50例。兩組患者在一般臨床資料比較均無明顯差異；差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

Western blot 檢測(cè)腦出血大鼠血腫周圍腦組織HMGB1蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示（圖1A），與Sham組相比，腦出血組中HMGB1 蛋白表達(dá)增加（＜0.001）。給予anti-HMGB1單克隆抗體后，HMGB1蛋白表達(dá)減少（＜0.01）。Control IgG組中HMGB1蛋白表達(dá)情況與腦出血組一致。ELISA 檢測(cè)腦出血大鼠血清HMGB1含量變化，結(jié)果顯示（圖1B），與Sham組相比，腦出血組中HMGB1 含量增加（＜0.001）。給予anti-HMGB1 單克隆抗體后，HMGB1 含量減少（＜0.01）。Control IgG組中HMGB1水平變化與腦出血組一致。免疫組化腦出血大鼠紋狀體中HMGB1陽性表達(dá)，結(jié)果顯示（圖1C），與Sham組相比，腦出血組中HMGB1陽性表達(dá)增加（＜0.001）。給予anti-HMGB1單克隆抗體后，HMGB1陽性表達(dá)減少（＜0.05）。Control IgG組中HMGB1陽性表達(dá)情況與腦出血組一致。

腦出血損傷后1、3、5、7 d和15 d，mNSS評(píng)分結(jié)果顯示，與Sham組相比，腦出血組mNSS評(píng)分增加，神經(jīng)功能下降（＜0.001，表1）。給予anti-HMGB1單克隆抗體后5 d，mNSS評(píng)分下降，大鼠神經(jīng)功能損傷緩解（＜0.05），到15 d后mNSS評(píng)分下降至4.21±2.01。對(duì)照control IgG組中大鼠神經(jīng)功能損傷變化與腦出血組一致。

用外圓內(nèi)方來概括全新路虎發(fā)現(xiàn)非常恰當(dāng)，而圓與方拋開形似外更有哲學(xué)層面的意義。圓更符合這個(gè)時(shí)代人們對(duì)于傳統(tǒng)汽車外形的共同認(rèn)知，方則體現(xiàn)著路虎并不愿徹底向時(shí)代讓步從而忘卻經(jīng)典本真。從哲學(xué)層面的意義來理解，全新路虎發(fā)現(xiàn)并沒有失去人們?cè)?jīng)喜歡的那種類似工具車的硬派與酷，如今的它只是將曾經(jīng)外露的性格藏在了車內(nèi)。

1.4.4 ELISA 檢測(cè)血清HMGB1 含量 給藥干預(yù)15 d后，取血清，在3000，4 ℃下離心4 min，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法分析HMGB1含量。

1.4.5 免疫組化檢測(cè)紋狀體組織中HMGB1陽性表達(dá)給藥干預(yù)15 d后，處死大鼠，解剖取紋狀體，在10%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，切片后進(jìn)行免疫組化染色分析。紋狀體組織在5 μm處連續(xù)切片，脫蠟水化，抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化氫酶阻斷，非特異性抗原（山羊血清）封閉，吸去封閉液，與anti-HMGB1抗體（1∶1000）在4 ℃下孵育過夜。然后用含有1%BSA 的PBS緩沖液清洗切片，并與二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體）在37 ℃孵育30 min，含有1%BSA 的PBS緩沖液清洗切片，滴加2%DAB溶液顯色5 min，流水沖洗。再用蘇木精對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，流水沖洗，返藍(lán)處理10 min，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，滴加樹脂封片，室溫風(fēng)干。免疫染色結(jié)果由兩名對(duì)實(shí)驗(yàn)不知情的獨(dú)立研究人員進(jìn)行評(píng)估。從每張載玻片中隨機(jī)選擇五個(gè)區(qū)域，并在400倍放大鏡下評(píng)估HMGB1陽性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有的數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間的比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）；方差齊時(shí)，多重比較采用LSD-檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，多重比較采用Dunnett's-檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4.1 腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)價(jià) 腦出血損傷后1、3、5、7 d和15 d，采用改良神經(jīng)損害程度評(píng)分（mNSS）用于評(píng)估神經(jīng)功能和損傷程度。mNSS評(píng)分是對(duì)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)，感覺和反射能力的全面評(píng)估，包括運(yùn)動(dòng)、感覺、反射、平衡共4部分外加肌張力檢查。mNSS總分0～18分，主要包括運(yùn)動(dòng)測(cè)試6分，感覺測(cè)試2分，衡量平衡測(cè)試6分，反射缺失和異常運(yùn)動(dòng)4分，能夠正常完成任務(wù)不計(jì)分，不能完成累計(jì)積分，0分為正常，1～6分為輕度損傷，7～12分為中度損傷，13～18分為重度損傷。

2 結(jié)果

2.1 腦出血大鼠mNSS神經(jīng)功能評(píng)分

1.4.2 TUNNEL法檢測(cè)紋狀體神經(jīng)元凋亡 給藥干預(yù)15 d后，處死大鼠，解剖取紋狀體，制作成石蠟切片，再將脫蠟、水化、Proteinase K工作液處理。洗片，將TUNNEL反應(yīng)混合液滴于玻片上孵育后洗片，加DAPI，脫水、透明、封片，采用imageJ軟件計(jì)算各組凋亡細(xì)胞率。

2.2 檢測(cè)腦出血大鼠HMGB1的水平變化和蛋白表達(dá)情況

無論是自然環(huán)境還是人工干預(yù)，前期都必須對(duì)使用場(chǎng)地的水文地質(zhì)條件、水動(dòng)力流動(dòng)信息、污染羽范圍及去除目標(biāo)進(jìn)行精準(zhǔn)探測(cè)，確保PRB能夠發(fā)揮最大經(jīng)濟(jì)效益.

3.1.2 配合施用生物肥料。生物肥料又稱生物菌肥，是人們利用土壤中有益微生物制成。其性質(zhì)與其它肥料不同，本身不含有大量元素，主要以微生物生命活動(dòng)的產(chǎn)物來改善植物營(yíng)養(yǎng)條件，抑制某種病害發(fā)生，發(fā)揮土壤潛在肥力的作用，從而獲得農(nóng)作物的增產(chǎn)效果。

2.3 HMGB1對(duì)腦出血大鼠紋狀體神經(jīng)元凋亡的影響

TUNEL染色檢測(cè)紋狀體神經(jīng)元凋亡情況結(jié)果顯示（圖2），與Sham組相比，腦出血組大鼠紋狀體神經(jīng)元凋亡率增加（＜0.001）。給予anti-HMGB1單克隆抗體后，大鼠紋狀體神經(jīng)元凋亡率減少（＜0.001）。對(duì)照control IgG組中大鼠紋狀體神經(jīng)元凋亡變化與腦出血組一致。

2.4 HMGB1對(duì)腦出血大鼠血腫周圍腦組織神經(jīng)元細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)的影響

通過Western blot 方法檢測(cè)Beclin1、LC3-II 和LC3-I的表達(dá)，結(jié)果顯示（圖3），與Sham組相比，腦出血組Beclin-1和LC3-II的表達(dá)增加，而LC3-I的表達(dá)減少（＜0.001）。給予anti-HMGB1單克隆抗體后，Beclin-1（＜0.001）和LC3-II（＜0.01）的表達(dá)減少，而LC3-I的表達(dá)增加（＜0.01）。Control IgG 組中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3-II和LC3-I的表達(dá)變化與腦出血組一致。

2.5 HMGB1對(duì)腦出血大鼠血腫周圍腦組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot方法檢測(cè)Bax和cleaved caspase-3和Bcl-2的表達(dá)結(jié)果顯示（圖4），與Sham組相比，腦出血組中促凋亡基因Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)水平增加（＜0.01），而抗凋亡基因Bcl-2 的表達(dá)水平減少（＜0.001）。給予anti-HMGB1單克隆抗體后，Bax（＜0.001）和cleaved caspase-3（＜0.05）的表達(dá)減少，而Bcl-2的的表達(dá)增加（＜0.001）。對(duì)照control IgG組中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3表達(dá)變化與腦出血組一致。

3 討論

隨著對(duì)腦出血損傷機(jī)制研究的深入，提高神經(jīng)細(xì)胞存活率、保持神經(jīng)細(xì)胞功能成為探究腦出血治療方案的重要突破點(diǎn)。向紋狀體內(nèi)注射凝血酶可誘導(dǎo)神經(jīng)元急性壞死和凋亡。本研究通過注射膠原酶Ⅳ誘導(dǎo)腦出血大鼠模型后，大鼠神經(jīng)功能減弱，mNSS評(píng)分增加，神經(jīng)元凋亡蛋白和自噬蛋白表達(dá)增加，但是在腦出血期間給予anti-HMGB1后，腦出血炎性反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡和自噬被抑制，最終緩解腦損傷。

HMGB1是神經(jīng)血管單位內(nèi)的一種早期促炎細(xì)胞因子，在包括神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞中表達(dá)。腦出血后血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞受損，HMGB1可由壞死或凋亡細(xì)胞被動(dòng)釋放，也可由免疫或非免疫細(xì)胞主動(dòng)分泌，成為重要的損傷相關(guān)分子模式。研究顯示，腦出血患者血清HMGB1水平顯著高于正常對(duì)照者，同時(shí)在腦出血小鼠模型亦觀察到同樣的結(jié)果，即血腫周圍組織HMGB1水平顯著升高，并于出血后72 h達(dá)峰值，出血后5 d表達(dá)水平逐漸下降。本研究也發(fā)現(xiàn)腦出血組大鼠HMGB1水平和蛋白表達(dá)和陽性表達(dá)水平顯著高于Sham組，說明有大量細(xì)胞壞死或凋亡。在腦出血晚期，HMGB1有利于神經(jīng)血管再生和組織重塑，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。HMGB1中和抗體已被證明可改善缺血性腦損傷。有學(xué)者利用腦出血小鼠模型進(jìn)行的研究顯示，給予anti-HMGBI 抗體干預(yù)可抑制HMGB1進(jìn)入血腫周圍區(qū)細(xì)胞外間隙，通過保護(hù)血腦屏障完整性，降低血清HMGB1水平，減輕腦水腫抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而改善預(yù)后。本研究也證明了給予anti-HMGB1單克隆抗體后，HMGB1水平和蛋白表達(dá)明顯降低，神經(jīng)功能損傷顯著改善，細(xì)胞凋亡情況減少，腦出血損傷有所緩解。

自噬是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要細(xì)胞內(nèi)自我降解過程。目前已經(jīng)明確自噬在實(shí)驗(yàn)性腦出血、缺血性卒中、蛛網(wǎng)膜下腔出血的神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞中被激活。有研究利用透射電鏡在線粒體內(nèi)觀察到大量雙層膜的自噬小體結(jié)構(gòu)，證實(shí)了在腦出血發(fā)生后自噬的激活。本研究發(fā)現(xiàn)，腦出血大鼠血腫周圍腦組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3-II的表達(dá)顯著增加，而LC3-I的表達(dá)減少，表明自噬的激活。自噬與細(xì)胞凋亡之間存在著復(fù)雜的關(guān)系。一些研究表明，自噬和凋亡是相互拮抗的，自噬的激活減少了與凋亡相關(guān)的細(xì)胞死亡，但也其他研究表明，自噬導(dǎo)致細(xì)胞凋亡并加重細(xì)胞死亡。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在腦出血后，凝血酶能促進(jìn)LC3-I向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)換，并推測(cè)凝血酶可能參與腦出血后的自噬過程；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，給予自噬抑制劑3-MA加劇了細(xì)胞死亡。有研究在膠原酶IV誘導(dǎo)的腦出血小鼠模型中發(fā)現(xiàn)給與自噬的抑制劑3-MA或激活劑雷帕霉素后，抑制自噬減輕了腦出血引起的腦損傷，而上調(diào)自噬加重了腦出血后的腦損傷程度，并且自噬可以通過激活細(xì)胞凋亡通路調(diào)節(jié)腦出血引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷。研究發(fā)現(xiàn)伴隨著腦損傷的加重，神經(jīng)元凋亡的增多，Bax呈過表達(dá)狀態(tài)，而Bcl-2的表達(dá)被抑制。而本研究發(fā)現(xiàn)，腦出血大鼠血腫周圍腦組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)水平明顯增加，Bcl-2的表達(dá)水平明顯減少，表明腦出血后自噬促進(jìn)凋亡的發(fā)生。此外，有研究指出HMGB1能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的發(fā)生，從而影響細(xì)胞的凋亡過程。細(xì)胞漿內(nèi)的HMGB1 主要是通過與自噬因子Beclin1 結(jié)合，推動(dòng)Beclin1與凋亡抑制因子Bcl-2的分離而促進(jìn)Beclin1和Ⅲ型磷酸肌醇3激酶/Vsp34結(jié)合，從而激活自噬。另外還有研究表明HMGB1可激活信號(hào)通路MAPK還促使Bcl-2發(fā)生磷酸化，使得Bcl-2與Beclin1發(fā)生分離，調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生。此外，HMGB1還通過影響B(tài)cl-2和Bcl 2的相互作用，促進(jìn)上皮細(xì)胞的自噬作用，抑制1，3-β-葡聚糖誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥反應(yīng)。在本研究中，給予anti-HMGB1 干預(yù)，顯著減少Beclin1、LC3-II、Bax 和cleaved caspase-3的表達(dá)和顯著增加LC3-I和Bcl-2的表達(dá)，這表明anti-HMGB1可以抑制腦出血大鼠血腫周圍腦組織神經(jīng)元細(xì)胞自噬和凋亡過程。

綜上所述，HMGB1可能通過調(diào)節(jié)腦神經(jīng)細(xì)胞自噬途徑調(diào)控腦出血后神經(jīng)元的凋亡過程，從而發(fā)揮組織損傷和修復(fù)的雙重調(diào)節(jié)作用，因此HMGB1可能是腦出血后神經(jīng)損傷的一個(gè)重要治療靶點(diǎn)。