血管抑制素-2通過調(diào)控上皮細(xì)胞間質(zhì)化促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移

宮頸癌是全球女性發(fā)病率和死亡率第4位的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性生命和健康。研究證實(shí)，腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸癌患者最重要的獨(dú)立預(yù)后因素，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者5年生存率明顯降低，但目前缺乏淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有效分子治療手段和敏感特異的分子標(biāo)志物，無法為患者選擇個體化的治療方案，導(dǎo)致同時接受根治性手術(shù)和放療的不良反應(yīng)疊加。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，脂筏蛋白flotillin-1參與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的調(diào)控，其機(jī)制可能與上皮細(xì)胞間質(zhì)化（EMT）過程有關(guān)，但其下游關(guān)鍵的中介分子尚不明確。我們通過在外源性過表達(dá)和干擾內(nèi)源性flotillin-1表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞株中運(yùn)用RNA-seq 分析改變flotillin-1表達(dá)水平后宮頸癌細(xì)胞中的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)血管抑制素-2（VASH2）的表達(dá)與flotillin-1 呈正相關(guān)。VASH2是血管抑制素家族蛋白成員，通過與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）家族蛋白相互作用，參與新生血管形成和EMT途徑的調(diào)控。研究表明，VASH2與多種人類腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)。VASH2能通過激活TGF-β信號通路，參與EMT過程的調(diào)控進(jìn)而增強(qiáng)卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，但其在宮頸癌中的作用和分子機(jī)制尚未見報道。

因此，本研究通過公共數(shù)據(jù)庫挖掘分析差異表達(dá)基，發(fā)現(xiàn)VASH2在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中呈顯著高表達(dá)，結(jié)合其與flotillin-1表達(dá)水平的相關(guān)性，推測其可能在作為flotillin-1蛋白的關(guān)鍵下游靶分子，在宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。本研究進(jìn)一步檢測了VASH2在宮頸癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)情況，并通過體外實(shí)驗(yàn)檢測了VASH2對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和淋巴管形成能力的影響，最后初步探索了其可能的分子機(jī)制，為證實(shí)VASH2可能作為宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在分子治療靶點(diǎn)和診斷分子標(biāo)志物提供了初步依據(jù)。

“茶產(chǎn)品分析與檢驗(yàn)”是一門技術(shù)性、應(yīng)用性、實(shí)踐性較強(qiáng)的綜合課程。通過學(xué)習(xí)該課程，學(xué)生可以逐步獲得獨(dú)立進(jìn)行茶產(chǎn)品理化檢驗(yàn)、有害物分析的工作能力，養(yǎng)成嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的科學(xué)態(tài)度，同時提高獲取信息、團(tuán)結(jié)協(xié)作、語言表達(dá)、開拓創(chuàng)新等綜合素質(zhì)。作為地方高校，教學(xué)中始終堅持以應(yīng)用能力為導(dǎo)向，靈活運(yùn)用多種教學(xué)方法和教學(xué)手段，強(qiáng)化教學(xué)效果。

回眸2013年，青龍管業(yè)在國家政策的大力支持下，在水利發(fā)展的大好機(jī)遇中，鍥而不舍，奮發(fā)圖強(qiáng)，特別是在舉世聞名的南水北調(diào)工程中一絲不茍地踐行著建設(shè)者的使命與責(zé)任，獲得了承建方的一致認(rèn)可與嘉獎。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本和細(xì)胞

于2020年10～12月從昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院采集宮頸癌組織標(biāo)本。本研究經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者在采集標(biāo)本前均已簽署知情同意書。采集標(biāo)本前患者未接受過化療、放療或免疫治療。將手術(shù)中獲得的新鮮組織標(biāo)本切塊后分別立即在-80 ℃中冷凍，用于隨后的蛋白質(zhì)提?。辉?80 ℃RNAlater液中凍存，用于后續(xù)提取RNA；在福爾馬林中固定，用于石蠟包埋。人宮頸正常上皮細(xì)胞（HcerEpic）（通泰生物科技有限公司）；人宮頸癌細(xì)胞（C-33A、HeLa、SiHa、Ca Ski、MS751）（武漢普諾賽Procell生命科技有限公司）；人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（HLEC）（北納生物科技有限公司），由昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室保存培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

1.3.5 RT-qPCR檢測各組細(xì)胞和組織中的mRNA表達(dá)水平 Trizol 試劑法分別提取各組細(xì)胞和宮頸癌組織的總RNA，取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，運(yùn)用RT-qPCR檢測VASH2、TGF-β和GAPDH的mRNA表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參。按照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。使用2法對目標(biāo)mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行測定，ΔΔCt=（Ct，目標(biāo)-Ct，內(nèi)參照）干預(yù)組（-Ct，目標(biāo)-Ct，內(nèi)參照）對照組。引物序列（表1），研究中各細(xì)胞系干擾序列（表2）。

墻體的切屑過程中，如果墻體的深度小于二十米抗壓能力在1MPa時，依據(jù)二期槽的要求切割一期槽時要在二期槽內(nèi)部做好鋸齒連接的工作；根據(jù)具體墻體深度、槽部的斜率計劃合理的切削長度。墻體深度如果突破了40米，一般就會采用到接頭管的方法。在發(fā)生意外斷裂事故之前，做好縫隙之間的連接工作。用沖擊鉆采用回轉(zhuǎn)的形式使得槽孔周邊的槽樁聯(lián)系在一起，增強(qiáng)其連接性。

1.3 方法

1.3.1 公共數(shù)據(jù)庫挖掘 首先利用外源性過表達(dá)和抑制內(nèi)源性flotillin-1 表達(dá)的宮頸癌SiHa 和HeLa 細(xì)胞的RNA-seq測序結(jié)果分析得到的差異基因，通過GEO2R工具驗(yàn)證這些差異基因在GEO 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)集GSE26511（包含N+和N0的宮頸癌組織樣本）的差異表達(dá)情況，篩選條件：＜0.05，|log fold-change(FC)| ＞1。對TCGA數(shù)據(jù)中的宮頸癌患者數(shù)據(jù)，根據(jù)是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行分組，驗(yàn)證RNA-seq測序的差異基因在兩組間的表達(dá)情況，篩選條件：＜0.05，|log fold-change(FC)|＞1。最終得到flotillin-1下游可能參與調(diào)控宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的基因VASH2。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 正常宮頸上皮細(xì)胞HcerEpic和宮頸癌細(xì)胞SiHa、HeLa用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%FBS、1% 氨芐青霉素、卡那鏈霉素），MS751 和C-33A 用MEM培養(yǎng)基（含10%FBS、1%氨芐青霉素、卡那鏈霉素），Ca ski和HLEC細(xì)胞用1640培養(yǎng)基（含15%FBS、1%氨芐青霉素、卡那鏈霉素）在37 ℃、50 mL/L CO的孵箱中靜置培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶的85%～90%，用胰酶消化傳代。

1.3.7 免疫組織化學(xué)（IHC）檢測組織中VASH2的蛋白表達(dá)水平 石蠟包埋的宮頸癌組織切片常規(guī)脫蠟，逐層乙醇和蒸餾水水化，檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）處理后微波修復(fù)抗原，5%羊血清25 ℃1 h封閉處理，一抗4 ℃孵育過夜（15 h），二抗和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、封片。晾干的切片置于光鏡（×200）下觀察。免疫反應(yīng)（IRS）評分：由2位病理學(xué)專家評分；染色強(qiáng)度0～3分：依次為陰性、淺黃色、淺褐色、深褐色；陽性范圍0～4分：依次為0～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%。免疫反應(yīng)評分=染色強(qiáng)度評分×陽性范圍。

1.3.4 慢病毒轉(zhuǎn)染及分組 將處于對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞用0.25%胰酶消化并分別接種至6孔板內(nèi)（5×10/孔），當(dāng)細(xì)胞貼壁后更換為含5 μg/mL VASH2過表達(dá)慢病毒載體或過表達(dá)慢病毒空載體病毒的無雙抗完全培養(yǎng)基感染48 h，感染后細(xì)胞融合度達(dá)到85%左右，進(jìn)行傳代處理，傳代后加入嘌呤霉素持續(xù)作用，篩選3代后收集細(xì)胞，分組為：HeLa-VASH2 和HeLa-VASH2-vector。用同樣的方法在Ca ski 和MS751 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染VASH2 干擾慢病毒載體和干擾慢病毒空載體，其中VASH2干擾慢病毒載體分別構(gòu)建3條，待細(xì)胞轉(zhuǎn)染傳代后收集細(xì)胞進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，篩選其中干擾效果最佳的2條慢病毒載體，分組為：Ca ski-VASH2RNAi#1、Ca ski-VASH2RNAi#2、Ca ski-VASH2RNAi-vector 以及 MS751-VASH2RNAi#1、MS751-VASH2RNAi#2、MS751-VASH2RNAi-vector。

我國金融行業(yè)發(fā)展速度日益加快，通過我國嚴(yán)格的相關(guān)法律法規(guī)規(guī)定，銀行理財業(yè)務(wù)開展也逐漸豐富，但我國理財市場仍處于初級發(fā)展階段，隨著市場規(guī)模的不斷擴(kuò)大，競爭日益激烈，產(chǎn)品創(chuàng)新層出不窮。同時國民的理財意識也逐漸加強(qiáng)，需要多結(jié)構(gòu)、多類型、低風(fēng)險產(chǎn)品投入市場，全面推動銀行理財業(yè)務(wù)的創(chuàng)新發(fā)展。

無水乙醇（廣州金華大化學(xué)試劑有限公司）；PBS緩沖液粉末、檸檬酸鹽修復(fù)液（北京中杉金橋公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco），MEM培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清及青霉素、鏈霉素（Gibco）；RNA-seq（廣州基迪奧）；VASH2RNAi慢病毒載體（中國銳博），VASH2過表達(dá)慢病毒載體（吉滿生物）；FastKing RT Kit（With gDNase）cDNA第一鏈合成試劑盒（KR116，F(xiàn)astKing）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天）；兔抗人VASH2抗體（Abcam），兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、VEGF-C（Abcam）；二抗（山羊抗兔IgG/HRP 標(biāo)記，山羊抗鼠IgG/HRP 標(biāo)記）（Abcam）；ECL發(fā)光液（Biosharp）；CCK-8 試劑盒（同仁化學(xué)公司）；劃痕插件（IBIDI 80466）；基質(zhì)膠（Corning），Transwell試劑盒（Corning）。

小伊發(fā)覺到自己的雙重人格時，正騎著已經(jīng)被禁止的無牌照摩托車穿越在寂靜的市中心，播放出的聒噪搖滾樂引來了巡邏民警，小伊熟練地把速度換到最高檔位，享受著擺脫追逐的快感，轉(zhuǎn)彎的瞬間離心力在地上蹭出一條劃痕，眼角根據(jù)角度的變換在無意中瞥到了什么建筑，他還沒有明白對這棟建筑的熟悉感來自哪里，大腦就已經(jīng)傳來陣痛，愈演愈烈，在從摩托車飛出的瞬間，他恍惚想起這似乎是個學(xué)校，桌椅已經(jīng)老舊，上面寫滿了少男少女的筆跡。摔在地上的那一刻，小伊感到似乎有什么重要的東西從他身體里流出。

1.3.11 淋巴管形成實(shí)驗(yàn) Matrigel在4 ℃隔天融化，槍頭、Transwell小室、24孔板提前置于4 ℃預(yù)冷。4 ℃預(yù)冷96孔板，加入50 μL/孔基質(zhì)膠，培養(yǎng)箱內(nèi)放置30 min使其凝固。0.25%胰酶消化收集HLEC細(xì)胞，使用各組細(xì)胞培養(yǎng)基分別調(diào)整懸液濃度為2.5×10/mL，往含有Matrigel的孔中加入100 μL的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后倒置顯微鏡下觀察管腔形成情況拍照，隨機(jī)挑選顯微鏡攝片中3個同等大小視野對淋巴管形成數(shù)量計數(shù)并求算術(shù)和。

1.3.3 RNA-seq測序 將外源性過表達(dá)和抑制內(nèi)源性flotillin-1表達(dá)的宮頸癌SiHa和HeLa細(xì)胞進(jìn)行RNAseq 測序。樣品提取總RNA 后，去除其中的核糖體RNA，以最大限度地保留所有codingRNA和ncRNA。得到的RNA 隨機(jī)打斷成為短片段，再以片斷化后的RNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈；接著加入緩沖液、dNTPs（dUTP代替dTTP）、RNase H和DNA polymerase I 合成cDNA 第二鏈，經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A，加測序接頭，然后通過UNG酶降解第二條鏈。用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最后建好的測序文庫用Illumina HiSeq4000進(jìn)行測序。

視域整合度表示剔除拓?fù)鋵W(xué)意義上的影響因素之后，從全系統(tǒng)任意位置能夠看到某一元素所需轉(zhuǎn)折的數(shù)值，整合度數(shù)值越高，顏色越深，越容易吸引空間中人的注視.其衡量了所研究空間吸引到達(dá)交通的潛力，顯示出此空間對于其他空間在視線方面聚集或離散的程度.具體來說，在視域分析中，整合度越高(分析圖顏色越深)表示在整體空間中的任意位置經(jīng)過較少的轉(zhuǎn)折點(diǎn)就可以看到此區(qū)域，從而區(qū)域內(nèi)的視線聚集性越高；而顏色越淺，區(qū)域內(nèi)的視線聚集性越低.

1.3.8 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞接種至96孔板中，約3000/孔，培養(yǎng)0、24、48、72、96 h 后，加入CCK-8 試劑，每組設(shè)定3個復(fù)孔，混勻后放培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，2 h后酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔細(xì)胞光密度，繪制生長曲線，計算細(xì)胞活力=（-）/（-）×100%。

1.3.9 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 用0.25%胰酶消化各組細(xì)胞，以2000/孔接種至Ibidi 劃痕插件內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到95%時移除插件，培養(yǎng)基洗3次，加入500 μL/孔基礎(chǔ)培養(yǎng)基后于0、12、24 h時間點(diǎn)各組細(xì)胞相同位置拍照，每組設(shè)定3個復(fù)孔。使用imagine J Pro軟件分析0、12、24 h各組細(xì)胞之間遷移的面積，計算細(xì)胞遷移百分率=0 h平均面積-24 h平均面積/0 h平均面積×100%。

根據(jù)上述VASH2在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，我們通過慢病毒穩(wěn)定表達(dá)載體構(gòu)建了外源性過表達(dá)VASH2 的HeLa細(xì)胞（HeLa-VASH2）和過表達(dá)空白載體的對照細(xì)胞（HeLa-VASH2-vector，圖3A～C），以及抑制內(nèi)源性VASH2 表達(dá)的Ca ski、MS751 細(xì)胞（Ca Ski-VASH2RNAi#1、Ca Ski-VASH2RNAi#2；MS751-VASH2RNAi#1、MS751-VASH2RNAi#2）和相應(yīng)的對照細(xì)胞（Ca Ski-VASH2RNAi-vector、MS751-VASH2RNAi-vector，圖4A～C）。

1.3.6 Western blot檢測各組細(xì)胞和組織中的蛋白表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞和宮頸癌組織標(biāo)本提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度，取相應(yīng)量的蛋白質(zhì)用10%的SDS-PAGE上樣緩沖液調(diào)至蛋白濃度為1 mg/mL，并變性，采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法將蛋白條帶完全跑開，恒流（210 mA）轉(zhuǎn)移分離后的蛋白質(zhì)至PVDF膜上。5%的BSA37 ℃封閉2 h后，分別加入一抗4 ℃孵育過夜（VASH2/E-cadherin/N-cadherin/Vimentin/VEGF-C，1∶1000 稀釋）。TBST 溶液洗去游離抗體，分別加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5000 稀釋）或HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶5000 稀釋），37 ℃孵育1 h，1×TBST洗膜10 min×3后用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件和GraphPad prism7統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，獨(dú)立兩組間比較采用非配對雙尾檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用方差分析，以＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VASH2 在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)與flotillin-1 呈正相關(guān)

本研究在外源性過表達(dá)和抑制內(nèi)源性flotillin-1表達(dá)的SiHa和HeLa細(xì)胞中進(jìn)行RNA-seq測序，結(jié)果顯示flotillin-1能夠調(diào)控一系列下游基因的表達(dá)（圖1A、B），結(jié)合flotillin-1下游調(diào)控基因在TCGA及GEO數(shù)據(jù)庫中宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和宮頸癌淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移標(biāo)本中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)基因VASH2受flotillin-1顯著正調(diào)控，且在TCGA及GEO數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，相對于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織，其在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)（圖1C、D）。

2.2 VASH2在宮頸癌細(xì)胞和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)

運(yùn)用RT-qPCR、Western blotting和免疫組織化學(xué)（IHC）檢測VASH2的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：相對于正常宮頸上皮HcerEpic細(xì)胞，VASH2在宮頸癌細(xì)胞Ca ski、SiHa和MS751中的表達(dá)上調(diào)（＜0.05，圖2A、C），而相對于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織，VASH2在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中的表達(dá)也上調(diào)（＜0.05，圖2B、D～G）。

2.3 VASH2在體外促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和淋巴管形成

1.3.10 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) Matrigel在4 ℃隔天融化，槍頭、Transwell 小室、24 孔板提前置于4 ℃預(yù)冷。取50 μL 融化好的Matrigel 加入到Transwell 小室中，使Matrigel 均勻鋪在Transwell 膜上，37 ℃干膠30 min。0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞，計數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10/mL，接種100 μL細(xì)胞懸液至Transwell-matrigel小室內(nèi)，3孔/組重復(fù)，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。隨后取出小室移入加有1 mL 4%多甲固定液的孔內(nèi)，小心吸干上室液體，往上室小心滴加200 μL 4%多聚甲醛固定液，室溫固定30 min；吸取固定液，擦去Matrigel膠，把小室放入加有500 μL結(jié)晶紫染色液的孔中，室溫染色15 min。染色后PBS清洗3次，于顯微鏡下觀察拍照，使用imagine J Pro軟件分析各組穿越Transwell膜的細(xì)胞數(shù)目。

在上述細(xì)胞中通過CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，相對于對照細(xì)胞，外源性過表達(dá)VASH2 的HeLa細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（＜0.05，圖3D），而抑制內(nèi)源性VASH2 表達(dá)的Ca Ski 和MS751 細(xì)胞增殖能力則明顯減弱（＜0.01，圖4D）。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，相對于對照細(xì)胞，外源性過表達(dá)VASH2后HeLa細(xì)胞的遷移（＜0.01，圖3E、F）和侵襲能力（＜0.001，圖3G、H）增強(qiáng)，而在抑制內(nèi)源性VASH2表達(dá)后，Ca Ski和MS751細(xì)胞的遷移（＜0.001，圖4E、F）和侵襲能力（＜0.001，圖4G、H）減弱。淋巴管形成實(shí)驗(yàn)顯示，相對于對照細(xì)胞，過表達(dá)VASH2后HeLa細(xì)胞形成新生淋巴管腔的數(shù)量明顯增加，長度明顯增長（＜0.01，圖3I、J），而抑制內(nèi)源性VASH2表達(dá)后，Ca Ski和MS751細(xì)胞形成新生淋巴管腔的數(shù)量明顯減少，長度明顯變短（＜0.001，圖4I、J）。

2.4 VASH2可能通過調(diào)控EMT途徑促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

本研究先構(gòu)建了外源性過表達(dá)VASH2 的HeLa細(xì)胞和其對照細(xì)胞以及抑制內(nèi)源性VASH2 表達(dá)的Ca ski、MS751細(xì)胞和其對照細(xì)胞（＜0.01，圖5A、B），再通過Western blot檢測EMT途徑關(guān)鍵分子的蛋白表達(dá)水平（圖5C），結(jié)果顯示：外源性過表達(dá)VASH2后，上皮細(xì)胞的表面標(biāo)記E-cadherin的表達(dá)下調(diào)（＜0.01，圖5C、D），而間質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)記N-cadherin和Vimentin的表達(dá)上調(diào)（＜0.05，圖5C、E、F），同時調(diào)控新生血管形成的關(guān)鍵分子VEGF-C的表達(dá)也上調(diào)（＜0.001，圖5C、G）。抑制內(nèi)源性VASH2表達(dá)后，E-cadherin的表達(dá)明顯恢復(fù)（＜0.001，圖5C、D），N-cadherin、Vimentin和VEGF-C的表達(dá)下調(diào)（＜0.05，圖5C、E～G）。為進(jìn)一步探尋其可能的分子機(jī)制，通過RT-qPCR檢測以上細(xì)胞模型中調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）的mRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)外源性過表達(dá)VASH2后，TGF-β的表達(dá)上調(diào)（＜0.0001，圖5H），而抑制內(nèi)源性VASH2表達(dá)后，TGF-β的表達(dá)下調(diào)（＜0.0001，圖5I）。

我很愧疚，像是無意中看見了別人的隱秘日記，想放下，卻被內(nèi)心的魔鬼驅(qū)使著要看下去，直到被主人發(fā)現(xiàn)，才驚慌失措。

3 討論

flotillin-1是脂筏的重要組成部分，其參與多種細(xì)胞生物學(xué)功能，包括細(xì)胞粘附、肌動蛋白細(xì)胞骨架重組、內(nèi)吞、吞噬和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，研究發(fā)現(xiàn)其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)flotillin-1與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在進(jìn)一步研究其分子機(jī)制時，通過干擾和過表達(dá)flotillin-1進(jìn)行RNAseq測序?qū)ふ移湎掠握{(diào)控基因，發(fā)現(xiàn)促進(jìn)新生血管形成的基因VASH2的表達(dá)與flotillin-1呈現(xiàn)正相關(guān)，進(jìn)而推測flotillin-1可能是通過VASH2調(diào)控宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究通過細(xì)胞和組織標(biāo)本檢測、建立過表達(dá)和抑制內(nèi)源性VASH2表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞模型及一些列體外實(shí)驗(yàn)，初步證實(shí)了VASH2在可能通過調(diào)控EMT促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞在體外的增殖和轉(zhuǎn)移。

新生血管形成被認(rèn)為是由血管生成刺激因子和血管生成抑制因子之間的局部平衡所調(diào)節(jié)的，而腫瘤的發(fā)生和發(fā)展離不開新生血管的形成。研究表明，VASH2與新生血管形成和腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；VASH2還可以通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞遷移促進(jìn)新生血管形成進(jìn)而影響漿液性卵巢癌的生長和腹腔播散。本研究通過RT-qPCR、Western blot和IHC檢測VASH2的在宮頸癌細(xì)胞和不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的宮頸癌組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)VASH2在宮頸癌細(xì)胞HeLa、Ca ski和MS751中的表達(dá)水平顯著高于宮頸正常上皮細(xì)胞，特別是在宮頸癌腸轉(zhuǎn)移來源細(xì)胞Ca ski和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移來源細(xì)胞MS751中呈異常高表達(dá)；VASH2在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中其mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織，提示其可能與宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究進(jìn)而構(gòu)建了外源性過表達(dá)和抑制內(nèi)源性VASH2表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞模型，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)VASH2能在體外促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖。而研究顯示VASH2具有微管羧肽酶活性，參與形成細(xì)胞內(nèi)微管，微管作為細(xì)胞骨架的重要部分是細(xì)胞有絲分裂過程中必不可少的，這也可能是VASH2能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖的原因。我們進(jìn)而通過劃痕愈合、Transwell侵襲和淋巴管形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)VASH2能在體外促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲和淋巴管形成。

研究證實(shí)，VASH2能對微管蛋白進(jìn)行許多翻譯后修飾以產(chǎn)生異質(zhì)微管，這些修飾包括去除和連接β-微管蛋白的C末端酪氨酸等；同時VASH2具有微管羧肽酶活性，能通過改變細(xì)胞骨架參與EMT途徑。EMT途徑是多種腫瘤如乳腺癌、胃癌、肺癌轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟。本研究發(fā)現(xiàn)外源性過表達(dá)VASH2后EMT途徑的關(guān)鍵分子E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯降低，而Ncadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平則明顯升高；在抑制內(nèi)源性VASH2表達(dá)后，這些分子的表達(dá)水平則呈現(xiàn)相反的趨勢。E-cadherin作為上皮細(xì)胞的表面標(biāo)志物，通過其細(xì)胞內(nèi)外粘附功能，維持細(xì)胞間連接及上皮細(xì)胞的諸多功能；N-cadherin作為間質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志物，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；Vimentin又作為上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的表面標(biāo)志物，與VASH2的表達(dá)呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了VASH2能在體外誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT過程。EMT途徑受到多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控。有研究表明，VASH2 可以通過TGF-β、Hedgehog 等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)EMT 途徑，而后者在宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β通路中總TGF-β的mRNA表達(dá)水平在宮頸癌細(xì)胞中受到VASH2 的調(diào)控，同時VASH2 也能促進(jìn)VEGF 家族關(guān)鍵分子VEGF-C 的表達(dá)，提示VASH2可能通過TGF-β通路調(diào)控EMT過程從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)flotillin-1 下游靶基因VASH2在轉(zhuǎn)移宮頸癌細(xì)胞和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中呈異常高表達(dá)，并能在體外促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和淋巴管形成，其機(jī)制可能與TGF-β通路調(diào)控的EMT途徑有關(guān)，可能作為flotillin-1促進(jìn)宮頸癌淋巴結(jié)的下游途徑，同時本研究為證實(shí)VASH2可能作為宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在分子治療靶點(diǎn)和診斷分子標(biāo)志物提供了初步依據(jù)。