男性生殖道Uu感染對精液主要參數(shù)及精液DNA碎片率的影響

邢夢雪　陳亞強　吳成亮

[摘要] 目的 探討解脲脲原體（Uu）感染對精子主要參數(shù)和精子DNA碎片率（DFI）的影響。方法? 選取2021年1～8月九江市婦幼保健院男科收治的男性不育患者758例，根據(jù)患者是否感染Uu將其分為男性不育無Uu感染組（A組）和男性不育伴Uu感染組（B組，104 copies/ml），另選取412名已生育的男性健康體檢者（C組），用PCR儀定量檢測Uu含量，用染色質(zhì)擴散法檢測DFI，同時以精子質(zhì)量檢測分析系統(tǒng)（CASA）對精液的相關(guān)參數(shù)進行分析處理。結(jié)果? A組的精液pH值、精子濃度、DFI與B組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）;A組的精子活力顯著高于B組（P<0.05）。結(jié)論? 男性生殖道Uu感染會對患者精液質(zhì)量造成影響，主要方面為抑制精子活力，從而導(dǎo)致男性不育癥的發(fā)生，因此臨床需要給予更多的關(guān)注，并及早處理，從而早日幫助患者獲得子代。

[關(guān)鍵詞] 男性不育;感染;Uu;精液常規(guī)參數(shù);精子DNA碎片

[中圖分類號] R698.2? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）17-0008-03

Effects of the Uu infection in the male reproductive tract on major semen parameters and sperm DNA fragmentation index

XING Mengxue1? ?CHEN Yaqiang2? ?WU Chengliang2

1. Department of Laboratory Medicine， Jiujiang Maternal and Child Health Hospital in Jiangxi Province， Jiujiang 332000， China; 2.Department of Assisted Reproduction， Jiujiang Maternal and Child Health Hospital in Jiangxi Province， Jiujiang 332000， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of ureaplasma urealyticum （Uu） infection on major semen parameters and sperm DNA fragmentation index （DFI）. Methods A total of 758 male infertility patients received in the Department of Andrology of Jiujiang Maternal and Child Health Hospital in Jiangxi Province from January to August 2021 were selected as the research objects. According to whether the patients developed Uu infection， they were divided into two groups： the male infertility group without Uu infection （group A） and the male infertility group with Uu infection （group B， 104 copies/ml）. And other 412 healthy males （group C） who underwent physical examination and had children were selected. The content of Uu was quantitatively measured by a PCR instrument， DFI was detected by chromatin dispersion assay， and semen related parameters were analyzed by the computer-assisted sperm analysis （CASA） system. Results There were no statistically significant differences in semen pH， sperm concentration and DFI between the group A and the group B （all P>0.05）. The sperm motility in the group A was significantly higher than that in the group B （P<0.05）. Conclusion Uu infection in the male reproductive tract will affect the semen quality of patients， which manifests as the inhibition of sperm motility， and thus it will lead to the occurrence of male infertility. Therefore， more attention and early treatment are needed in clinic， so as to help patients obtain offspring as soon as possible.

[Key words] Male infertility; Infection; Uu; Semen routine parameters; Sperm DNA fragmentation

目前，我國適當(dāng)生育年齡的夫婦中不孕不育癥高達13%～16%，其中男女兩方因素各占一半左右[1]。男性不育癥是指在未采取任何避孕措施前提下，有正常頻率性生活的夫妻同居1年以上，而女方未懷孕的疾病。男性不育癥是一種較為復(fù)雜的綜合征，并不是由某一種因素造成的結(jié)果[2]。本病的具體病因主要有染色體異常、內(nèi)分泌疾病、生殖道感染、輸精管道梗阻、免疫系統(tǒng)異常、性功能障礙等等方面的原因[3]。在眾多原因中，生殖道感染受到較高關(guān)注，其中Uu（ureaplasma urealyticum）與泌尿生殖炎癥有密切關(guān)系[4]。Uu為支原體中的一種，因為生長需要尿素而得名，主要寄生于人體泌尿生殖系統(tǒng)，通過性生活和被污染的衣物傳播，主要見于年輕性生活旺盛時期。國內(nèi)外報告顯示，不孕癥夫婦的分泌物及精液中Uu DNA檢測陽性率可高達50%以上，所以對不育患者及早進行Uu檢測是十分有必要的，對提高我國育齡夫婦的優(yōu)生優(yōu)育率有重要意義[5～9]。本研究對不育癥患者的Uu、精液常規(guī)、精液DNA碎片率等檢測數(shù)據(jù)進行分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2021年1～8月在九江市婦幼保健院男科門診就診的不育癥男性患者758例（不含無精子癥患者），年齡23～44歲，平均（32.05±4.51）歲;另取412名已生育的男性健康體檢者，年齡23～44歲，平均（31.22±4.53）歲。兩組研究對象的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。將男性不育癥患者以是否感染Uu為依據(jù)分為兩組，Uu陰性組（A組）516例，且未感染沙眼衣原體（CT）;Uu感染陽性組（B組，Uu≥104 copies/ml）242例。另將已生育的男性健康體檢者正常組412名編為C組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①育齡夫婦規(guī)律性生活1年以上，未采用任何避孕措施;②結(jié)合婚育史、內(nèi)外科病史，未使用煙草、酒精或非法毒品等;③外生殖器檢查無病變，精漿及血清抗精子抗體陰性;④近期未使用抗菌藥物，如阿奇霉素、強力霉素等。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有外傷史、遺傳性疾病家族史及性功能障礙病史者;②女方檢查有明顯不孕因素者。本試驗已上報江西省九江市婦幼保健院生殖倫理委員會，經(jīng)過討論后，通過倫理委員會審查，允許進行本次試驗。

1.2 方法

1.2.1 精液常規(guī)? 標(biāo)本液化后，應(yīng)盡快檢測精子活力，充分混勻精液標(biāo)本，混勻后立即加樣，加入10 μm深的Geoffrey專用玻片，每份標(biāo)本檢測兩次，計數(shù)約200條精子，兩次結(jié)果檢測均值在95%可信區(qū)間內(nèi)。當(dāng)濃度在（2～100）×106/ml時，可直接用于檢測;若標(biāo)本的精子濃度>100×106/ml，需進行稀釋。收集CASA分析儀檢測出的各組患者精液的精子濃度、活力精子百分率等參數(shù)。

1.2.2 解脲脲原體（Uu）? Uu核酸檢測試劑盒為艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司產(chǎn)品。操作方法：①樣本處理，在標(biāo)本管中加入無菌生理鹽水，混勻后吸取處理的標(biāo)本至離心管中，12 000 rpm離心5 min，取沉淀物加入50 μl核酸提取液，混勻后離心10 s，水浴10 min，12 000 rpm低速離心10 min，上清液供PCR擴增用。陰性對照、陽性對照直接取50 μl，加入等量核酸提取液，混勻后加熱10 min，高速離心10 min后備用。②試劑配制，從試劑盒取出Uu反應(yīng)混合液，室溫下融化并震蕩混勻后，2000 rpm離心10 s計算準(zhǔn)備反應(yīng)試劑人份數(shù)。③加入待測樣本，分別加入4 μl的陰性對照、陽性對照、樣品處理上清液，蓋緊反應(yīng)管，轉(zhuǎn)移至檢測區(qū)。④PCR擴增及熒光檢測，按程序擴增，檢測熒光選擇FAM熒光檢測。陽性對照Uu值應(yīng)<38，陰性對照Uu無數(shù)值，檢測樣本Uu值。

1.2.3 DFI? DFI（DNA fragmentation index）檢測試劑采用染色質(zhì)擴散法，具體操作方法如下：①使用樣本稀釋液對精液標(biāo)本進行稀釋處理;②加熱低熔點瓊脂糖后，加入30 μl精液標(biāo)本，混勻;③取20 μl混勻后的瓊脂糖精液標(biāo)本置于預(yù)先處理過的載玻片之上，蓋上蓋玻片，放入4℃冰箱5～7 min;④配置稀鹽酸或購買商品化的稀鹽酸;小心推開蓋玻片，垂直墜入配置好的稀鹽酸試劑缸中室溫7 min;⑤取出玻片，置入裂解液試劑缸中室溫25 min后，放入蒸餾水試劑缸中5 min漂洗，然后分別置入濃度由低至高的乙醇溶液中各2 min，取出自然晾干;⑥使用瑞氏-吉姆薩染液對玻片染色;⑦用光學(xué)顯微鏡，于400倍或1000倍鏡下觀察200個精子涂片形態(tài)。結(jié)果判定：精子碎片率≥30%為異常結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0中文版統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A+B組與C組的Uu感染情況比較

A+B組的Uu感染陽性率高于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 A+B組與C組的精液常規(guī)參數(shù)比較

A+B組的精液pH值、精子濃度與C組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）;A+B組的精子活力顯著低于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 A組與B組的精液常規(guī)參數(shù)及DFI比較

A組的精液pH值、精子濃度、DFI與B組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）;A組的精子活力顯著高于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

Uu的基因組為環(huán)狀雙鏈DNA，分子量約為13×106，18.9 kb，是一種原核細胞微生物，可通過除菌濾器，無細胞壁，不能維持固有形態(tài)故而呈現(xiàn)出多形性，為非淋球菌性尿道炎的主要致病菌，主要侵犯人類的生殖與泌尿系統(tǒng)的黏膜上皮細胞，影響上皮代謝，從而影響生殖及泌尿系統(tǒng)的相關(guān)功能[10，11]。所以Uu檢測可作為診斷及治療生殖系統(tǒng)感染循證醫(yī)學(xué)依據(jù)，且為泌尿系統(tǒng)感染常規(guī)檢測項目之一。精子的損傷機制大概分為：誘導(dǎo)氧化應(yīng)激（induce oxidative stress）、改變細胞周期和誘導(dǎo)細胞凋亡（change cell cycle and induce apoptosis）、改變雄激素水平（change androgen levels）、其他可能的分子機制（other possible molecular mechanisms）等[12]。而Uu對精子的損傷機制大概過程為：Uu通過直接接觸或間接接觸感染源等方式，寄生在附屬性腺及睪丸等生殖系統(tǒng)中，從而對生精小管造成損傷，同時Uu本身又常黏附在精子的頸部和尾部，使精子游動速度減慢，可使精子間互相黏附、聚集，導(dǎo)致細胞膜相互融合，最終使得Uu中的遺傳物質(zhì)及有害物質(zhì)全部進入精子細胞，從而導(dǎo)致精子細胞膜的損傷，繼而降低精子活力和精子濃度。且融合后的細胞還會釋放各類有毒因子損傷精液內(nèi)環(huán)境，影響生精過程，造成精子畸形[13～15]。本研究結(jié)果顯示，B組的精液pH值、精子濃度與A組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）;而精子活力顯著低于A組，必然嚴(yán)重影響男性的生育能力。此外，Uu感染可導(dǎo)致白細胞水平升高，使得精漿活性氧水平及細胞因子等水平迅速提升，同時引起睪丸病理損傷，從而導(dǎo)致男性生育能力下降。除精子活力、精子活率等精液常規(guī)參數(shù)外，精子DNA也是診斷男性不育癥的重要指標(biāo)，有研究表明精子碎片率的提升會對無論是自然正常受孕或?qū)?yīng)用輔助生殖技術(shù)治療后的受孕的最終結(jié)果造成不良影響，并與發(fā)生流產(chǎn)相關(guān)[16～20]。但本試驗結(jié)果顯示，男性不育癥患者中Uu陽性感染者與未感染者精子DNA完整性比較，Uu陽性感染組的DFI并未顯著高于未感染Uu組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但并不能說明二者沒有相關(guān)性。有些研究認為Uu感染與精子DNA碎片率呈正相關(guān)，本研究可能由于未排除禁欲天數(shù)和年齡等因素的影響所致。Uu感染造成男性不育的機制中除了DFI外，也有研究認為，Uu感染可引起精子DCXR蛋白表達量的減少和精子凋亡率的增高，并引起VEGF和VEGFR2的表達量減少，同時也可使精子頂體酶活性降低，進而精子與卵子透明帶結(jié)合困難，造成男性生育困難。但當(dāng)前Uu精子DNA損傷機制未完全明了，有待進一步研究發(fā)現(xiàn)，而本研究作為一個初步的相關(guān)性分析，存在一定不足，如未對解脲脲原體（T960群和parvo群）、禁欲天數(shù)、環(huán)境中的有害因素（如吸煙、酗酒、接觸毒物等）進行分類統(tǒng)計比較。

綜上所述，男性不育癥患者Uu陽性感染者的精子活力相比陰性者下降，但對于其他參數(shù)影響本研究并未發(fā)現(xiàn)。Uu感染對我國不育癥夫妻的發(fā)生依然是相對重要的危險因素，須及早就醫(yī)及早治療。Uu感染的具體機制、對男性生殖系統(tǒng)的具體損傷及臨床治療用藥有待進一步分析研究。

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（收稿日期：2021-11-09）