• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    紫花苜?;蚓庉嫈?shù)據(jù)庫(AlfalfaGEDB)的應(yīng)用研究
    ——以MsHB7 和MsPALM1 為例

    2022-07-17 13:19:20蔣曉可劉長寧
    熱帶農(nóng)業(yè)科技 2022年3期
    關(guān)鍵詞:等位基因靶點基因組

    蔣曉可,劉長寧

    (1.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園,云南 勐臘 666303;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

    紫花苜蓿(Medicago sativaL.)因其高產(chǎn)潛力、廣泛的適應(yīng)性和優(yōu)良的營養(yǎng)特性被譽(yù)為“牧草之王”,是世界上分布最廣、栽培歷史最悠久的飼草之一。近年來,隨著畜牧業(yè)的迅速發(fā)展,紫花苜蓿的需求增加,對紫花苜蓿的研究應(yīng)用愈加廣泛[1]。2020 年,四倍體紫花苜蓿兩個品種(新疆大葉和中苜一號)的參考基因組公布[2-3],完成了染色體水平的基因組組裝,極大推進(jìn)了紫花苜?;蚬δ艿难芯亢推贩N改良的發(fā)展。

    基因編輯是一種利用序列特異性核酸酶(sequence-specific nucleases,SSNs)在序列特定位點引起堿基突變的技術(shù)。CRISPR/Cas9 因其操作簡單、實用高效而成為目前應(yīng)用最為廣泛的基因編輯技術(shù),已被廣泛用于水稻、高粱、小麥、玉米、大豆、番茄、馬鈴薯的作物改良[4-6]。

    基于以上背景,我們利用Django Web 框架,結(jié)合SQLite 數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建了紫花苜?;蚓庉嫈?shù)據(jù)庫(Alfalfa Gene Editing Database,AlfalfaGEDB),提供基因基本信息瀏覽、BLAST 序列比對、JBrowse基因組瀏覽器、多條件查詢、sgRNA 靶點設(shè)計、在線Heatmap 繪制、生物復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)繪制、基因家族預(yù)測和數(shù)據(jù)下載等功能。AlfalfaGEDB 及其相關(guān)工具為研究人員提供了一個實用性強(qiáng)、操作簡便的平臺,用以檢索紫花苜?;虻南嚓P(guān)信息,幫助研究人員更好的開展研究。本研究以MsHB7和Ms-PALM1基因為例,對AlfalfaGEDB 的功能進(jìn)行展示,旨在證明AlfalfaGEDB 的實用性和數(shù)據(jù)庫結(jié)果的可靠性。

    1 材料和方法

    1.1 AlfalfaGEDB 的數(shù)據(jù)處理

    通過文獻(xiàn)檢索,對四倍體紫花苜蓿兩個品種(新疆大葉、中苜一號)的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行全面收集,將四倍體紫花苜蓿的蛋白序列比對至多個基因功能公共數(shù)據(jù)庫,獲得了KEGG、GO、Pfam 等多種注釋信息;基于NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫、EBI 和國家基因庫生命大數(shù)據(jù)平臺(CNGBdb)等公共數(shù)據(jù)庫,收集分析了212 份紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),涵蓋紫花苜蓿不同組織、不同環(huán)境脅迫等多種樣本;利用CRISPR-GE[7]和CRISPR-Local[8]靶點預(yù)測工具,對紫花苜蓿兩個品種分別進(jìn)行了sgRNA 預(yù)測,獲得4 套全基因組靶點預(yù)測數(shù)據(jù),基因組覆蓋率達(dá)99%以上。

    1.2 AlfalfaGEDB 的實現(xiàn)

    基于紫花苜蓿多組學(xué)數(shù)據(jù)的挖掘和整理,利用Django Web 框架,結(jié)合SQLite 數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建了紫花苜?;蚓庉嫈?shù)據(jù)庫(Alfalfa Gene Editing Database,AlfalfaGEDB),訪問網(wǎng)址為:http://alfalfagedb.liu-lab.com/。AlfalfaGEDB 收錄了紫花苜蓿兩個品種基因組信息、多樣本的基因表達(dá)譜、全基因組sgRNA 靶點預(yù)測等信息,提供基因組信息在線瀏覽,轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量可視化以及sgRNA 靶位點預(yù)測數(shù)據(jù)在線瀏覽等功能模塊。此外,數(shù)據(jù)庫也集成了在線BLAST、熱圖繪制,生物復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)查詢、基于CRISPR/Cas9 的sgRNA 靶位點設(shè)計等工具。

    1.3 AlfalfaGEDB 的應(yīng)用

    以紫花苜蓿、CRISPR 等作為關(guān)鍵字進(jìn)行文獻(xiàn)搜集,選擇經(jīng)過實驗驗證的功能基因MsHB7和MsPALM1作為主要查詢對象。通過AlfalfaGEDB的BLAST 序列比對工具,對基因進(jìn)行驗證,得到該基因在AlfalfaGEDB 中對應(yīng)的基因名,實現(xiàn)基因ID 的轉(zhuǎn)化。Browse 功能用于查詢基因的基本信息;利用JBrowse 基因組瀏覽器進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)的可視化;在線Heatmap 繪制工具展示基因在不同組織和脅迫條件下的表達(dá)信息;多條件查詢用于查詢基因所在網(wǎng)絡(luò)的信息;Network 工具繪制基因所在的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò);基因家族預(yù)測結(jié)果確定該基因所在的轉(zhuǎn)錄因子家族;sgRNA 靶點設(shè)計提示了該基因預(yù)測到的所有可能的靶點信息。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 MsHB7 基因在AlfalfaGEDB 中的應(yīng) 用

    已有研究表明,MsHB7作為HD-Zip 轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,其過表達(dá)對紫花苜蓿鹽脅迫耐受性具有負(fù)調(diào)節(jié)作用[9]。此外,還有一些植物物種中的HD-Zip 成員在非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮作用。JcHDZ07基因是小桐子(Jatropha curcasL.)中HD-Zip 家族的成員,它在擬南芥中的過表達(dá)使轉(zhuǎn)基因品系對鹽脅迫更加敏感[10]。玉米(Zea maysL.)中ZmHDZ1的過表達(dá)使轉(zhuǎn)基因水稻鹽敏感性增強(qiáng)[11];棉花(Gossypium hirsutumL.)GhHB12基因過表達(dá)也對擬南芥和棉花的鹽脅迫和耐旱性產(chǎn)生了負(fù)調(diào)控作用[12]。鹽堿脅迫是重要的植物非生物脅迫因子,土壤鹽堿化也是世界范圍內(nèi)備受關(guān)注的生態(tài)問題,紫花苜蓿作為優(yōu)質(zhì)的牧草品種,選育適宜的耐鹽堿品種將極大促進(jìn)紫花苜蓿的生產(chǎn)和發(fā)展[13]。

    在AlfalfaGEDB 中搜索MsHB7(MsG0380016624.01)基因,可以得到如下結(jié)果:

    (1)Browse 搜索結(jié)果如圖1 所示,可以得到該基因的染色體位置信息、序列信息、基因注釋信息、sgRNA 靶位點預(yù)測結(jié)果。根據(jù)數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果,該基因在公共數(shù)據(jù)庫中被注釋為HD-Zip 相關(guān)蛋白。

    圖1 MsHB7(MsG0380016624.01)基本信息瀏覽

    (2)BLAST 工具鑒定結(jié)果顯示:紫花苜蓿中苜一號品種中MsHB7(MsG0380016624.01)基因與蒺藜苜蓿中響應(yīng)ABA、鹽脅迫的MtHB12(XP_003602321.2)基因的氨基酸序列相似性高達(dá)98%(圖2A)。

    (3)JBrowse 可視化結(jié)果顯示:MsHB7具有兩個外顯子和兩個CDS 區(qū)域(圖2B)。

    (4)如圖2C 所示,轉(zhuǎn)錄因子基因家族鑒定結(jié)果表明MsHB7基因?qū)儆贖D-Zip 轉(zhuǎn)錄因子家族。

    除基因的詳細(xì)信息,AlfalfaGEDB 提供的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析工具可幫助研究人員分析和挖掘更多的基因功能。AlfalfaGEDB 網(wǎng)絡(luò)查詢工具顯示:MsHB7與MsG0380016581.01 基因有蛋白互作關(guān)系(圖2D)。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)查詢結(jié)果表明MsHB7與821 個基因有共表達(dá)關(guān)系,我們對p-value 值前10 的基因進(jìn)行了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)展示(圖2E)。熱圖聚類(圖2F)顯示,MsHB7及其相關(guān)基因受鹽脅迫誘導(dǎo)變化明顯:與對照組相比(CZM、CXJ),這些基因在鹽處理下(TZM、TXJ)表達(dá)量上升。MsHB7基因sgRNA 靶位點預(yù)測結(jié)果如圖1D所示,利用CRISPR-GE 工具在MsHB7中預(yù)測出54個靶點,CRISPR-Local 工具預(yù)測出36 個靶點,兩個工具預(yù)測到的相同靶點數(shù)為35 個。

    圖2 MsHB7在AlfalfaGEDB中查詢結(jié)果

    2.2 MsPALM1 在 AlfalfaGEDB 中的應(yīng)用

    莖葉比是衡量紫花苜蓿品質(zhì)的重要指標(biāo),與紫花苜蓿的營養(yǎng)價值呈正相關(guān),培育多葉型新品種有助于改善紫花苜蓿莖葉比,從而提高其產(chǎn)量和營養(yǎng)價值。已有研究證明,C2H2 型鋅指轉(zhuǎn)錄因子——PALM1在二倍體蒺藜苜蓿復(fù)葉形成過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[14-15]。2020 年,研究人員利用紫花苜蓿新疆大葉基因組數(shù)據(jù),以MtPALM1作為查詢,成功在紫花苜蓿中鑒定出4個MsPALM1等位基因:MS.gene059669,MS.gene09654,MS.gene21467 和 MS.gene015309。利用CRISPR/Cas9 技術(shù),對調(diào)控紫花苜蓿小葉數(shù)目的Ms-PALM1等位基因進(jìn)行定點突變,將三出復(fù)葉的紫花苜蓿突變?yōu)? 小葉的類掌狀復(fù)葉,大大加快了紫花苜蓿育種速度。

    為了更直觀地對本數(shù)據(jù)庫sgRNA 靶點設(shè)計工具進(jìn)行驗證,我們以MsPALM1為例,通過BLAST得到MtPALM1在新疆大葉基因組中的4 個等位基因,序列相似性99%以上(圖3A)。轉(zhuǎn)錄因子家族預(yù)測結(jié)果如圖3B 所示,MsPALM1的4 個等位基因?qū)儆贑2H2 轉(zhuǎn)錄因子家族,該結(jié)果進(jìn)一步印證了BLAST 結(jié)果的真實性。Browse 查詢結(jié)果顯示,4 個基因位于5 號染色體組的不同亞染色體上,GO 和Pfam 注釋結(jié)果相同,編碼C2H2 型鋅指蛋白(圖3C)。MsPALM1等位基因的表達(dá)矩陣熱圖顯示,其在敲除palm1 的葉片里明顯高表達(dá)(圖3D)。

    圖3 MtPALM1在AlfalfaGEDB中的查詢結(jié)果

    利用本數(shù)據(jù)庫的多靶點預(yù)測工具,成功預(yù)測到陳海濤等的研究中[16]敲除MsPALM1等位基因所用靶點:5’-GGAGACGAGCACGGTCGCGGCGG-3’(圖4),有力地證明了AlfalfaGEDB 靶點預(yù)測的可用性。

    圖4 MsPALM1等位基因靶點預(yù)測結(jié)果

    3 小結(jié)

    紫花苜?;蚓庉嫈?shù)據(jù)庫(AlfalfaGEDB)共收集了兩個品種紫花苜蓿的基因組數(shù)據(jù)、212 份紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及4 套全基因組sgRNA 預(yù)測數(shù)據(jù)。在此基礎(chǔ)上,利用Django Web 框架,結(jié)合多種生物信息學(xué)工具,構(gòu)建了一個相對全面的紫花苜?;蚓庉嫈?shù)據(jù)庫。本文通過對MsHB7和Ms-PALM1兩個實例進(jìn)行分析,對AlfalfaGEDB 的工具進(jìn)行了全方位的測試與驗證,數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果與已有研究結(jié)果[3,17]的一致性也進(jìn)一步印證了紫花苜?;蚓庉嫈?shù)據(jù)庫的實用性和可靠性。

    豆科作物紫花苜蓿在改良土壤、水土保持、生物固氮等方面發(fā)揮了重要作用,其應(yīng)用對飼料、作物輪作和土壤肥力至關(guān)重要,是可持續(xù)農(nóng)業(yè)的重要組成部分。作為目前最全面的紫花苜蓿功能基因研究平臺,AlfalfaGEDB 為研究人員提供了友好的Web 服務(wù)和便捷高效的生物信息學(xué)工具,成為紫花苜蓿功能基因研究的重要補(bǔ)充工具,期待其能夠持續(xù)為紫花苜?;蚬δ苎芯亢瓦z傳育種提供有用的資源。

    猜你喜歡
    等位基因靶點基因組
    維生素D受體或是糖尿病治療的新靶點
    中老年保健(2021年3期)2021-12-03 02:32:25
    牛參考基因組中發(fā)現(xiàn)被忽視基因
    親子鑒定中男性個體Amelogenin基因座異常1例
    智慧健康(2021年17期)2021-07-30 14:38:32
    腫瘤免疫治療發(fā)現(xiàn)新潛在靶點
    WHOHLA命名委員會命名的新等位基因HLA-A*24∶327序列分析及確認(rèn)
    DXS101基因座稀有等位基因的確認(rèn)1例
    心力衰竭的分子重構(gòu)機(jī)制及其潛在的治療靶點
    氯胺酮依賴腦內(nèi)作用靶點的可視化研究
    同位素(2014年2期)2014-04-16 04:57:16
    基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:58:49
    有趣的植物基因組
    亚洲人成网站在线观看播放| 日韩大片免费观看网站| 国产伦理片在线播放av一区| 色视频www国产| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 女人被狂操c到高潮| 麻豆乱淫一区二区| 国产精品久久久久久久久免| 搡女人真爽免费视频火全软件| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 视频中文字幕在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 黄色配什么色好看| 毛片女人毛片| 色视频在线一区二区三区| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲av免费在线观看| 少妇人妻久久综合中文| 一区二区av电影网| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 永久免费av网站大全| 久久久久久久久久人人人人人人| 免费观看在线日韩| 久久精品国产自在天天线| 亚洲精品乱久久久久久| 大片电影免费在线观看免费| 五月玫瑰六月丁香| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 色综合色国产| 午夜老司机福利剧场| 激情五月婷婷亚洲| 黄色怎么调成土黄色| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲内射少妇av| 国产男女内射视频| 久久久久久国产a免费观看| av一本久久久久| 综合色丁香网| av国产精品久久久久影院| av卡一久久| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 国产av国产精品国产| 美女内射精品一级片tv| 国产亚洲av嫩草精品影院| 水蜜桃什么品种好| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产中年淑女户外野战色| 成人综合一区亚洲| 日韩av不卡免费在线播放| 国产av不卡久久| 热99国产精品久久久久久7| 观看免费一级毛片| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日韩欧美一区视频在线观看 | 欧美最新免费一区二区三区| 国产男人的电影天堂91| 乱系列少妇在线播放| 久久这里有精品视频免费| 边亲边吃奶的免费视频| 国产精品精品国产色婷婷| 日韩一区二区三区影片| 看免费成人av毛片| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产精品不卡视频一区二区| 少妇丰满av| 色播亚洲综合网| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲色图av天堂| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产成人一区二区在线| 国产精品一区二区性色av| 日日撸夜夜添| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲人成网站在线播| 色综合色国产| 五月玫瑰六月丁香| 成年免费大片在线观看| 国产黄片美女视频| 色哟哟·www| 少妇 在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 最新中文字幕久久久久| 一本一本综合久久| 国产精品不卡视频一区二区| 国内精品美女久久久久久| 成人国产麻豆网| 久久影院123| 国产精品国产三级国产专区5o| 91狼人影院| 日本午夜av视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 伊人久久国产一区二区| 久久热精品热| av在线播放精品| 欧美高清性xxxxhd video| 久久久久久久久久人人人人人人| 国国产精品蜜臀av免费| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 色综合色国产| 免费av毛片视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲丝袜综合中文字幕| 婷婷色综合大香蕉| 99久国产av精品国产电影| 国产欧美日韩精品一区二区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久99热这里只频精品6学生| 99热这里只有精品一区| 两个人的视频大全免费| 日本爱情动作片www.在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 最近的中文字幕免费完整| 国产成人精品一,二区| 日本黄大片高清| 一级毛片电影观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产有黄有色有爽视频| 一区二区av电影网| 亚洲av成人精品一二三区| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 日韩视频在线欧美| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 欧美日韩在线观看h| www.av在线官网国产| 全区人妻精品视频| av国产免费在线观看| 亚州av有码| 久久久久久久久大av| 超碰av人人做人人爽久久| 久久ye,这里只有精品| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 热re99久久精品国产66热6| 夜夜爽夜夜爽视频| 黄色日韩在线| 国产 一区精品| 日韩强制内射视频| 老司机影院成人| av在线app专区| 精品酒店卫生间| 两个人的视频大全免费| 国产高清有码在线观看视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 免费观看无遮挡的男女| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲自拍偷在线| 国产免费一区二区三区四区乱码| kizo精华| 日韩大片免费观看网站| 亚洲人与动物交配视频| av福利片在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 另类亚洲欧美激情| av在线观看视频网站免费| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久这里有精品视频免费| 中文欧美无线码| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲在线观看片| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲,一卡二卡三卡| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产免费福利视频在线观看| 在线观看国产h片| 18禁动态无遮挡网站| 精品熟女少妇av免费看| 久久久久久久精品精品| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲欧美精品专区久久| 大片免费播放器 马上看| 青春草视频在线免费观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 一个人观看的视频www高清免费观看| 精品一区二区三卡| 日本wwww免费看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 中文资源天堂在线| 亚洲自偷自拍三级| 国产v大片淫在线免费观看| 精品熟女少妇av免费看| 免费观看无遮挡的男女| 人妻 亚洲 视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久久久九九精品影院| 黄色配什么色好看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲成人一二三区av| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 五月玫瑰六月丁香| 免费看av在线观看网站| 中文天堂在线官网| av国产久精品久网站免费入址| 久久这里有精品视频免费| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲成人久久爱视频| 九草在线视频观看| 在线观看国产h片| av在线app专区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| av国产久精品久网站免费入址| 波多野结衣巨乳人妻| 搡女人真爽免费视频火全软件| 午夜爱爱视频在线播放| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 成人美女网站在线观看视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产精品一二三区在线看| 人体艺术视频欧美日本| 日本av手机在线免费观看| 国产色爽女视频免费观看| 国产精品无大码| 禁无遮挡网站| .国产精品久久| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲不卡免费看| 男女啪啪激烈高潮av片| 大香蕉97超碰在线| 三级经典国产精品| 天美传媒精品一区二区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产成年人精品一区二区| 欧美3d第一页| 日韩人妻高清精品专区| 大香蕉97超碰在线| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 久热这里只有精品99| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲成人一二三区av| av在线蜜桃| 91久久精品国产一区二区成人| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久精品夜色国产| 成人毛片60女人毛片免费| 欧美zozozo另类| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲自偷自拍三级| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久人人爽人人片av| 人体艺术视频欧美日本| 欧美成人a在线观看| 日韩成人伦理影院| 麻豆国产97在线/欧美| 直男gayav资源| 国产亚洲5aaaaa淫片| 高清欧美精品videossex| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 中文欧美无线码| 精品一区二区三区视频在线| 精品国产露脸久久av麻豆| 久久久久久久精品精品| 国产在线男女| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产爽快片一区二区三区| 午夜日本视频在线| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲av不卡在线观看| 国产乱人视频| 精品一区二区三区视频在线| 日本-黄色视频高清免费观看| 日本av手机在线免费观看| 99久久精品一区二区三区| av免费在线看不卡| 伊人久久国产一区二区| 少妇人妻 视频| 成年免费大片在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 99久久精品国产国产毛片| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 青青草视频在线视频观看| 日韩一区二区视频免费看| 最近最新中文字幕免费大全7| 免费看日本二区| 日韩一本色道免费dvd| 日韩免费高清中文字幕av| 国产成人精品福利久久| 久久99热这里只频精品6学生| 少妇的逼水好多| 日韩大片免费观看网站| 新久久久久国产一级毛片| 美女主播在线视频| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲经典国产精华液单| 26uuu在线亚洲综合色| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产成人91sexporn| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日本一本二区三区精品| 色吧在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 国产精品av视频在线免费观看| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲精品,欧美精品| 国产成人aa在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 大香蕉97超碰在线| 制服丝袜香蕉在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 精品熟女少妇av免费看| 男插女下体视频免费在线播放| 熟女av电影| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 免费黄频网站在线观看国产| 成人黄色视频免费在线看| 国产中年淑女户外野战色| 国产高潮美女av| 亚洲综合精品二区| 国产熟女欧美一区二区| 精品久久久精品久久久| 精品国产露脸久久av麻豆| 91精品伊人久久大香线蕉| 伊人久久精品亚洲午夜| 久久99热这里只频精品6学生| av在线亚洲专区| 国产亚洲最大av| 亚洲丝袜综合中文字幕| 欧美国产精品一级二级三级 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 两个人的视频大全免费| 国产精品一区www在线观看| 亚洲电影在线观看av| videossex国产| 99久久九九国产精品国产免费| 色视频在线一区二区三区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 欧美一区二区亚洲| 内射极品少妇av片p| 青春草亚洲视频在线观看| 另类亚洲欧美激情| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 免费播放大片免费观看视频在线观看| 99热这里只有精品一区| 最新中文字幕久久久久| 直男gayav资源| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久精品国产a三级三级三级| 五月伊人婷婷丁香| 免费黄网站久久成人精品| 久久精品国产自在天天线| 极品教师在线视频| 久久久久精品久久久久真实原创| av线在线观看网站| 亚洲伊人久久精品综合| av在线老鸭窝| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 伊人久久国产一区二区| 各种免费的搞黄视频| 真实男女啪啪啪动态图| 久久人人爽人人爽人人片va| 成人欧美大片| 久久久精品欧美日韩精品| 91精品一卡2卡3卡4卡| 激情五月婷婷亚洲| 人人妻人人看人人澡| 亚洲精品国产色婷婷电影| 午夜视频国产福利| 深爱激情五月婷婷| 在线播放无遮挡| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产精品国产av在线观看| 久久久久久久午夜电影| 色5月婷婷丁香| 深爱激情五月婷婷| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲国产高清在线一区二区三| 禁无遮挡网站| av网站免费在线观看视频| 午夜爱爱视频在线播放| 国产极品天堂在线| 成人二区视频| 成人国产麻豆网| 99久久人妻综合| 国产成人91sexporn| 亚洲天堂国产精品一区在线| xxx大片免费视频| 免费人成在线观看视频色| 少妇的逼好多水| 久久久精品免费免费高清| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲国产精品999| 97在线视频观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 伊人久久国产一区二区| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲人成网站在线观看播放| 青青草视频在线视频观看| 日本熟妇午夜| 一区二区三区免费毛片| 天堂中文最新版在线下载 | 在线a可以看的网站| 最近手机中文字幕大全| av网站免费在线观看视频| 免费在线观看成人毛片| 深夜a级毛片| 18禁动态无遮挡网站| 婷婷色综合大香蕉| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久久国产一区二区| 秋霞伦理黄片| 免费大片18禁| 成年版毛片免费区| 国产在视频线精品| 22中文网久久字幕| 成人二区视频| 亚洲国产精品专区欧美| 中文字幕久久专区| 成人漫画全彩无遮挡| 国产成人freesex在线| 免费观看无遮挡的男女| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 在线免费十八禁| 午夜日本视频在线| 特大巨黑吊av在线直播| 七月丁香在线播放| 亚洲三级黄色毛片| 欧美性感艳星| 亚洲成色77777| 亚洲四区av| 国产乱人视频| 久热久热在线精品观看| 亚洲综合色惰| 精品视频人人做人人爽| 超碰av人人做人人爽久久| 伦理电影大哥的女人| 国模一区二区三区四区视频| 边亲边吃奶的免费视频| 美女高潮的动态| 最新中文字幕久久久久| tube8黄色片| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲精品一二三| 精品少妇久久久久久888优播| 大香蕉久久网| 国产亚洲av嫩草精品影院| 精品人妻偷拍中文字幕| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产成人91sexporn| 欧美97在线视频| 激情五月婷婷亚洲| 国产成人精品福利久久| 色婷婷久久久亚洲欧美| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久久亚洲精品成人影院| 97热精品久久久久久| 日本黄大片高清| 亚洲精品第二区| 街头女战士在线观看网站| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 免费电影在线观看免费观看| 少妇的逼水好多| 亚洲色图综合在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 国产中年淑女户外野战色| eeuss影院久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久久精品94久久精品| 国产成人一区二区在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 久久久欧美国产精品| 久久久久久国产a免费观看| 免费少妇av软件| 黑人高潮一二区| 国产 一区 欧美 日韩| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 3wmmmm亚洲av在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| av国产免费在线观看| 超碰97精品在线观看| 亚洲精品,欧美精品| 一级黄片播放器| 男女啪啪激烈高潮av片| 少妇人妻精品综合一区二区| 男女边摸边吃奶| 国产精品一区www在线观看| 日本黄大片高清| 美女cb高潮喷水在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 午夜老司机福利剧场| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 两个人的视频大全免费| 精品一区二区三区视频在线| 欧美精品一区二区大全| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品国产三级国产专区5o| 日日啪夜夜撸| 人妻系列 视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 免费在线观看成人毛片| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产乱来视频区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 韩国av在线不卡| 免费高清在线观看视频在线观看| 成年免费大片在线观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美成人精品欧美一级黄| 婷婷色综合大香蕉| 久久久久久久国产电影| 亚洲怡红院男人天堂| av在线app专区| 国产精品一及| 国产成人精品一,二区| 国产男女内射视频| 岛国毛片在线播放| 五月天丁香电影| 免费高清在线观看视频在线观看| 高清在线视频一区二区三区| 日韩强制内射视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 一级黄片播放器| 精品久久久久久电影网| 久久久欧美国产精品| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产乱人视频| 久久精品国产亚洲av天美| 久久久久久国产a免费观看| 五月开心婷婷网| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久精品国产自在天天线| 日韩电影二区| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲国产成人一精品久久久| 一级a做视频免费观看| 九草在线视频观看| 国产精品一区www在线观看| 少妇丰满av| 人妻 亚洲 视频| 嫩草影院入口| 久久久午夜欧美精品| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 搡老乐熟女国产| 九九在线视频观看精品| 99热这里只有是精品在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲国产精品999| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美日韩在线观看h| 精品一区二区三卡| 一二三四中文在线观看免费高清| 午夜福利高清视频| 国产在线一区二区三区精| 精品久久久久久久久av| 日本熟妇午夜| 在现免费观看毛片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 丝袜喷水一区| 国产精品女同一区二区软件| 免费观看在线日韩| 三级国产精品片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 联通29元200g的流量卡| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久久久久国产a免费观看| 久热这里只有精品99| 日韩大片免费观看网站| 在线观看人妻少妇| 色吧在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| av在线老鸭窝| 亚洲自偷自拍三级| 精品久久久噜噜| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 中文在线观看免费www的网站| 精品久久久久久电影网| 亚洲天堂国产精品一区在线| 少妇人妻 视频| 欧美极品一区二区三区四区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 最新中文字幕久久久久| 99热这里只有精品一区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 内地一区二区视频在线| 日韩精品有码人妻一区| 高清在线视频一区二区三区| 精品久久久久久电影网| videos熟女内射| 色吧在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久久精品免费免费高清| 久久影院123| 亚洲性久久影院| av国产精品久久久久影院| 最近中文字幕2019免费版|