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    紫花苜?;蚓庉嫈?shù)據(jù)庫(AlfalfaGEDB)的應(yīng)用研究
    ——以MsHB7 和MsPALM1 為例

    2022-07-17 13:19:20蔣曉可劉長寧
    熱帶農(nóng)業(yè)科技 2022年3期
    關(guān)鍵詞:等位基因靶點基因組

    蔣曉可,劉長寧

    (1.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園,云南 勐臘 666303;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

    紫花苜蓿(Medicago sativaL.)因其高產(chǎn)潛力、廣泛的適應(yīng)性和優(yōu)良的營養(yǎng)特性被譽(yù)為“牧草之王”,是世界上分布最廣、栽培歷史最悠久的飼草之一。近年來,隨著畜牧業(yè)的迅速發(fā)展,紫花苜蓿的需求增加,對紫花苜蓿的研究應(yīng)用愈加廣泛[1]。2020 年,四倍體紫花苜蓿兩個品種(新疆大葉和中苜一號)的參考基因組公布[2-3],完成了染色體水平的基因組組裝,極大推進(jìn)了紫花苜?;蚬δ艿难芯亢推贩N改良的發(fā)展。

    基因編輯是一種利用序列特異性核酸酶(sequence-specific nucleases,SSNs)在序列特定位點引起堿基突變的技術(shù)。CRISPR/Cas9 因其操作簡單、實用高效而成為目前應(yīng)用最為廣泛的基因編輯技術(shù),已被廣泛用于水稻、高粱、小麥、玉米、大豆、番茄、馬鈴薯的作物改良[4-6]。

    基于以上背景,我們利用Django Web 框架,結(jié)合SQLite 數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建了紫花苜?;蚓庉嫈?shù)據(jù)庫(Alfalfa Gene Editing Database,AlfalfaGEDB),提供基因基本信息瀏覽、BLAST 序列比對、JBrowse基因組瀏覽器、多條件查詢、sgRNA 靶點設(shè)計、在線Heatmap 繪制、生物復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)繪制、基因家族預(yù)測和數(shù)據(jù)下載等功能。AlfalfaGEDB 及其相關(guān)工具為研究人員提供了一個實用性強(qiáng)、操作簡便的平臺,用以檢索紫花苜?;虻南嚓P(guān)信息,幫助研究人員更好的開展研究。本研究以MsHB7和Ms-PALM1基因為例,對AlfalfaGEDB 的功能進(jìn)行展示,旨在證明AlfalfaGEDB 的實用性和數(shù)據(jù)庫結(jié)果的可靠性。

    1 材料和方法

    1.1 AlfalfaGEDB 的數(shù)據(jù)處理

    通過文獻(xiàn)檢索,對四倍體紫花苜蓿兩個品種(新疆大葉、中苜一號)的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行全面收集,將四倍體紫花苜蓿的蛋白序列比對至多個基因功能公共數(shù)據(jù)庫,獲得了KEGG、GO、Pfam 等多種注釋信息;基于NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫、EBI 和國家基因庫生命大數(shù)據(jù)平臺(CNGBdb)等公共數(shù)據(jù)庫,收集分析了212 份紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),涵蓋紫花苜蓿不同組織、不同環(huán)境脅迫等多種樣本;利用CRISPR-GE[7]和CRISPR-Local[8]靶點預(yù)測工具,對紫花苜蓿兩個品種分別進(jìn)行了sgRNA 預(yù)測,獲得4 套全基因組靶點預(yù)測數(shù)據(jù),基因組覆蓋率達(dá)99%以上。

    1.2 AlfalfaGEDB 的實現(xiàn)

    基于紫花苜蓿多組學(xué)數(shù)據(jù)的挖掘和整理,利用Django Web 框架,結(jié)合SQLite 數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建了紫花苜?;蚓庉嫈?shù)據(jù)庫(Alfalfa Gene Editing Database,AlfalfaGEDB),訪問網(wǎng)址為:http://alfalfagedb.liu-lab.com/。AlfalfaGEDB 收錄了紫花苜蓿兩個品種基因組信息、多樣本的基因表達(dá)譜、全基因組sgRNA 靶點預(yù)測等信息,提供基因組信息在線瀏覽,轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量可視化以及sgRNA 靶位點預(yù)測數(shù)據(jù)在線瀏覽等功能模塊。此外,數(shù)據(jù)庫也集成了在線BLAST、熱圖繪制,生物復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)查詢、基于CRISPR/Cas9 的sgRNA 靶位點設(shè)計等工具。

    1.3 AlfalfaGEDB 的應(yīng)用

    以紫花苜蓿、CRISPR 等作為關(guān)鍵字進(jìn)行文獻(xiàn)搜集,選擇經(jīng)過實驗驗證的功能基因MsHB7和MsPALM1作為主要查詢對象。通過AlfalfaGEDB的BLAST 序列比對工具,對基因進(jìn)行驗證,得到該基因在AlfalfaGEDB 中對應(yīng)的基因名,實現(xiàn)基因ID 的轉(zhuǎn)化。Browse 功能用于查詢基因的基本信息;利用JBrowse 基因組瀏覽器進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)的可視化;在線Heatmap 繪制工具展示基因在不同組織和脅迫條件下的表達(dá)信息;多條件查詢用于查詢基因所在網(wǎng)絡(luò)的信息;Network 工具繪制基因所在的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò);基因家族預(yù)測結(jié)果確定該基因所在的轉(zhuǎn)錄因子家族;sgRNA 靶點設(shè)計提示了該基因預(yù)測到的所有可能的靶點信息。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 MsHB7 基因在AlfalfaGEDB 中的應(yīng) 用

    已有研究表明,MsHB7作為HD-Zip 轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,其過表達(dá)對紫花苜蓿鹽脅迫耐受性具有負(fù)調(diào)節(jié)作用[9]。此外,還有一些植物物種中的HD-Zip 成員在非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮作用。JcHDZ07基因是小桐子(Jatropha curcasL.)中HD-Zip 家族的成員,它在擬南芥中的過表達(dá)使轉(zhuǎn)基因品系對鹽脅迫更加敏感[10]。玉米(Zea maysL.)中ZmHDZ1的過表達(dá)使轉(zhuǎn)基因水稻鹽敏感性增強(qiáng)[11];棉花(Gossypium hirsutumL.)GhHB12基因過表達(dá)也對擬南芥和棉花的鹽脅迫和耐旱性產(chǎn)生了負(fù)調(diào)控作用[12]。鹽堿脅迫是重要的植物非生物脅迫因子,土壤鹽堿化也是世界范圍內(nèi)備受關(guān)注的生態(tài)問題,紫花苜蓿作為優(yōu)質(zhì)的牧草品種,選育適宜的耐鹽堿品種將極大促進(jìn)紫花苜蓿的生產(chǎn)和發(fā)展[13]。

    在AlfalfaGEDB 中搜索MsHB7(MsG0380016624.01)基因,可以得到如下結(jié)果:

    (1)Browse 搜索結(jié)果如圖1 所示,可以得到該基因的染色體位置信息、序列信息、基因注釋信息、sgRNA 靶位點預(yù)測結(jié)果。根據(jù)數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果,該基因在公共數(shù)據(jù)庫中被注釋為HD-Zip 相關(guān)蛋白。

    圖1 MsHB7(MsG0380016624.01)基本信息瀏覽

    (2)BLAST 工具鑒定結(jié)果顯示:紫花苜蓿中苜一號品種中MsHB7(MsG0380016624.01)基因與蒺藜苜蓿中響應(yīng)ABA、鹽脅迫的MtHB12(XP_003602321.2)基因的氨基酸序列相似性高達(dá)98%(圖2A)。

    (3)JBrowse 可視化結(jié)果顯示:MsHB7具有兩個外顯子和兩個CDS 區(qū)域(圖2B)。

    (4)如圖2C 所示,轉(zhuǎn)錄因子基因家族鑒定結(jié)果表明MsHB7基因?qū)儆贖D-Zip 轉(zhuǎn)錄因子家族。

    除基因的詳細(xì)信息,AlfalfaGEDB 提供的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析工具可幫助研究人員分析和挖掘更多的基因功能。AlfalfaGEDB 網(wǎng)絡(luò)查詢工具顯示:MsHB7與MsG0380016581.01 基因有蛋白互作關(guān)系(圖2D)。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)查詢結(jié)果表明MsHB7與821 個基因有共表達(dá)關(guān)系,我們對p-value 值前10 的基因進(jìn)行了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)展示(圖2E)。熱圖聚類(圖2F)顯示,MsHB7及其相關(guān)基因受鹽脅迫誘導(dǎo)變化明顯:與對照組相比(CZM、CXJ),這些基因在鹽處理下(TZM、TXJ)表達(dá)量上升。MsHB7基因sgRNA 靶位點預(yù)測結(jié)果如圖1D所示,利用CRISPR-GE 工具在MsHB7中預(yù)測出54個靶點,CRISPR-Local 工具預(yù)測出36 個靶點,兩個工具預(yù)測到的相同靶點數(shù)為35 個。

    圖2 MsHB7在AlfalfaGEDB中查詢結(jié)果

    2.2 MsPALM1 在 AlfalfaGEDB 中的應(yīng)用

    莖葉比是衡量紫花苜蓿品質(zhì)的重要指標(biāo),與紫花苜蓿的營養(yǎng)價值呈正相關(guān),培育多葉型新品種有助于改善紫花苜蓿莖葉比,從而提高其產(chǎn)量和營養(yǎng)價值。已有研究證明,C2H2 型鋅指轉(zhuǎn)錄因子——PALM1在二倍體蒺藜苜蓿復(fù)葉形成過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[14-15]。2020 年,研究人員利用紫花苜蓿新疆大葉基因組數(shù)據(jù),以MtPALM1作為查詢,成功在紫花苜蓿中鑒定出4個MsPALM1等位基因:MS.gene059669,MS.gene09654,MS.gene21467 和 MS.gene015309。利用CRISPR/Cas9 技術(shù),對調(diào)控紫花苜蓿小葉數(shù)目的Ms-PALM1等位基因進(jìn)行定點突變,將三出復(fù)葉的紫花苜蓿突變?yōu)? 小葉的類掌狀復(fù)葉,大大加快了紫花苜蓿育種速度。

    為了更直觀地對本數(shù)據(jù)庫sgRNA 靶點設(shè)計工具進(jìn)行驗證,我們以MsPALM1為例,通過BLAST得到MtPALM1在新疆大葉基因組中的4 個等位基因,序列相似性99%以上(圖3A)。轉(zhuǎn)錄因子家族預(yù)測結(jié)果如圖3B 所示,MsPALM1的4 個等位基因?qū)儆贑2H2 轉(zhuǎn)錄因子家族,該結(jié)果進(jìn)一步印證了BLAST 結(jié)果的真實性。Browse 查詢結(jié)果顯示,4 個基因位于5 號染色體組的不同亞染色體上,GO 和Pfam 注釋結(jié)果相同,編碼C2H2 型鋅指蛋白(圖3C)。MsPALM1等位基因的表達(dá)矩陣熱圖顯示,其在敲除palm1 的葉片里明顯高表達(dá)(圖3D)。

    圖3 MtPALM1在AlfalfaGEDB中的查詢結(jié)果

    利用本數(shù)據(jù)庫的多靶點預(yù)測工具,成功預(yù)測到陳海濤等的研究中[16]敲除MsPALM1等位基因所用靶點:5’-GGAGACGAGCACGGTCGCGGCGG-3’(圖4),有力地證明了AlfalfaGEDB 靶點預(yù)測的可用性。

    圖4 MsPALM1等位基因靶點預(yù)測結(jié)果

    3 小結(jié)

    紫花苜?;蚓庉嫈?shù)據(jù)庫(AlfalfaGEDB)共收集了兩個品種紫花苜蓿的基因組數(shù)據(jù)、212 份紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及4 套全基因組sgRNA 預(yù)測數(shù)據(jù)。在此基礎(chǔ)上,利用Django Web 框架,結(jié)合多種生物信息學(xué)工具,構(gòu)建了一個相對全面的紫花苜?;蚓庉嫈?shù)據(jù)庫。本文通過對MsHB7和Ms-PALM1兩個實例進(jìn)行分析,對AlfalfaGEDB 的工具進(jìn)行了全方位的測試與驗證,數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果與已有研究結(jié)果[3,17]的一致性也進(jìn)一步印證了紫花苜?;蚓庉嫈?shù)據(jù)庫的實用性和可靠性。

    豆科作物紫花苜蓿在改良土壤、水土保持、生物固氮等方面發(fā)揮了重要作用,其應(yīng)用對飼料、作物輪作和土壤肥力至關(guān)重要,是可持續(xù)農(nóng)業(yè)的重要組成部分。作為目前最全面的紫花苜蓿功能基因研究平臺,AlfalfaGEDB 為研究人員提供了友好的Web 服務(wù)和便捷高效的生物信息學(xué)工具,成為紫花苜蓿功能基因研究的重要補(bǔ)充工具,期待其能夠持續(xù)為紫花苜?;蚬δ苎芯亢瓦z傳育種提供有用的資源。

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