盈江澳洲堅(jiān)果黑果病病原鑒定及防治藥劑室內(nèi)篩選

蔣桂芝，王 康，李學(xué)斌，賀熙勇*

（1.云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪 666100；2.云南迪思企業(yè)集團(tuán)堅(jiān)果有限公司，云南盈江 679300）

堅(jiān)果納入云南省高原特色農(nóng)業(yè)規(guī)劃和“十三五”木本油料發(fā)展規(guī)劃中，盈江縣成為云南澳洲堅(jiān)果的產(chǎn)地之一［1］。澳洲堅(jiān)果是外來(lái)引進(jìn)物種，國(guó)內(nèi)對(duì)澳洲堅(jiān)果的研究起步晚，種植模式、栽培環(huán)境與原產(chǎn)地有較大差異。由于栽培環(huán)境、管理模式的不同，導(dǎo)致病蟲(chóng)害的發(fā)生情況與原產(chǎn)地也不盡相同。如近年來(lái)發(fā)生越來(lái)越嚴(yán)重的澳洲堅(jiān)果黑果病（又稱炭疽?。瑩?jù)云南盈江迪思企業(yè)集團(tuán)堅(jiān)果有限公司的產(chǎn)量損失統(tǒng)計(jì)：2019 年損失23 t，2020 年損失53 t，2021 年損失達(dá)113.5 t。

澳洲堅(jiān)果黑果病常發(fā)生于每年雨季6—8 月，果實(shí)正處于養(yǎng)分積累期至成熟期，未成熟的果實(shí)感病后脫落，造成產(chǎn)量損失嚴(yán)重，并且黑果病發(fā)生嚴(yán)重的果園常發(fā)生葉枯病。澳洲堅(jiān)果原產(chǎn)地澳大利亞有報(bào)道，引起果斑病的病原菌有炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、擬莖點(diǎn)霉Phomopsissp.、束梗尾孢菌Pseudocercospora、毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae等，Pseudocercospora通常在開(kāi)花后4～5 個(gè)月引起病態(tài)早熟的果實(shí)脫落［2］；由束梗孢菌Stilbella cinnabarina引起果殼斑點(diǎn)病可造成大量的熟前落果，該病發(fā)生在長(zhǎng)期潮濕的季節(jié)［3］；筆者曾報(bào)道國(guó)內(nèi)由橡膠疫霉Phytophthora heveae引起的果腐?。?］，以及在云南景洪引起澳洲堅(jiān)果果實(shí)褐斑病發(fā)生的是Calonectria pentaseptata［5］。2019—2021 年，課題組在云南省盈江縣進(jìn)行調(diào)查、采樣和鑒定，分析該病害發(fā)生的環(huán)境條件以及控制黑果病的技術(shù)措施，以明確黑果病的致病菌和防治的化學(xué)藥劑，為云南澳洲堅(jiān)果黑果病的大田防控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

病原菌分離材料取自云南省盈江縣迪思堅(jiān)果公司蓮花山基地（N24°46′37″，E97°55′35″，海拔956 m）、太平鎮(zhèn)基地（N24°38′47 ″，E97°47′24 ″，海拔1 043 m）及云南源潤(rùn)堅(jiān)果開(kāi)發(fā)有限公司基地（N24°42′49 ″，E97°56′10 ″，海拔936 m）。

真菌菌絲DNA 快速抽提試劑盒、ITS1/ITS4、HIS3、β-tubulin 等PCR 擴(kuò)增引物，由 生工生物工程（上海）技術(shù)服務(wù)有限公司提供。

試驗(yàn)接種材料為澳洲堅(jiān)果未成熟果實(shí)，農(nóng)業(yè)部景洪澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源圃提供。

參試藥劑：（1）50%多菌靈WP（江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司），（2）450 g/L 咪鮮胺EW（江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司），（3）200 g/L 氟唑菌酰羥胺SC（先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司），（4）250 g/L 嘧菌酯SC（先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司），（5）44%苯甲·百菌清SC（4%苯醚甲環(huán)唑，40%百菌清；先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司），（6）36%丙環(huán)·咪鮮胺SE（10%丙環(huán)唑，26%米鮮胺；浙江天豐生物科學(xué)有限公司），（7）60%唑醚·代森聯(lián)WG（5%吡唑醚菌酯，55%代森聯(lián)；巴斯夫植物保護(hù)（江蘇）），（8）500 g/L 甲基硫菌靈SE（江蘇龍燈化學(xué)有限公司），（9）325 g/L 苯甲·嘧菌酯SC（先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司），（10）40%吡唑醚菌酯·喹啉銅SC（10%吡唑醚菌酯，30%喹啉銅；江西中迅農(nóng)化有限公司），（11）75%唑醚·甲硫靈WP（15%吡唑醚菌酯，65%甲基硫菌靈；江蘇龍燈化學(xué)有限公司），（12）10%苯醚甲環(huán)唑WG（先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司），（13）75%肟菌·戊唑醇WG（25%肟菌酯，50%戊唑醇；拜耳作物科學(xué)中國(guó)有限公司），（14）20%噁霉·乙蒜素WP（5%噁霉靈，15%乙蒜素；南陽(yáng)新臥龍生物化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離

將病果用自來(lái)水清洗，晾干后用75%乙醇表面消毒處理30 s，剖開(kāi)病果，選擇病健交界組織，分別挑取大小2～3 mm×2～3 mm 的組織分別放置在PDA 平板上，在25℃、RH65%條件下培養(yǎng)5 d，將得到的菌落鏡檢、單孢分離，得到純培養(yǎng)菌株用于致病性試驗(yàn)，并將菌株與病果上鏡檢結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

1.2.2 致病性測(cè)定

將培養(yǎng)10 d 的測(cè)試菌株孢子制成濃度為1×103個(gè)/mL 的孢子懸浮液備用。在果園選取20 個(gè)正常未成熟帶皮果，其中10 個(gè)噴孢子懸浮液1 mL/個(gè)，10 個(gè)作對(duì)照噴無(wú)菌水1 mL/個(gè)，處理后均分別放置于20～28℃、RH85%條件下的保濕缸中保濕。當(dāng)接種帶皮果出現(xiàn)與田間一致的感病癥狀后，再進(jìn)行病原分離，得到與接種菌一致的菌，即確認(rèn)為病原菌。

1.2.3 病原菌鑒定

（1）形態(tài)學(xué)鑒定

病果上霉?fàn)钗镧R檢：用滅菌牙簽挑取病果表層霉?fàn)钗锷僭S，放在載玻片上，加滅菌水，蓋上玻片，在顯微鏡下觀察霉?fàn)钗锏男螒B(tài)特征。

將純培養(yǎng)病原菌在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d，觀察形態(tài)特征、產(chǎn)孢方式等，依據(jù)Crous［6］、莊文穎［7］等的方法進(jìn)行鑒定。

（2）分子生物學(xué)鑒定

按照Fungal DNA Kitr 的提取步驟，提取菌絲的DNA 置 于4℃冰箱中備用。用ITS1/ITS4［8］、HIS3［9］、β-tubulin［10-12］等序列引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送交生工生物工程（上海）技術(shù)服務(wù)有限公司完成測(cè)序。將獲得的ITS、HIS3、TUB2 序列上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，并與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)序列進(jìn)行同源性比較，應(yīng)用MEGA 7.0 軟件對(duì)拼接序列進(jìn)行對(duì)比分析，構(gòu)建rDNA-ITS-HIS-TUB序列多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定其分類學(xué)地位。

1.2.4 藥劑毒力測(cè)試

各參試藥劑的使用濃度選用藥劑說(shuō)明推薦使用濃度的中間濃度。各參試農(nóng)藥配制成含毒培養(yǎng)基，對(duì)照為空白（不加任何農(nóng)藥）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離、致病性的測(cè)定

分離樣本18 個(gè)，得到18 個(gè)菌落。經(jīng)觀察菌落和分生孢子形態(tài)初步鑒定，其中15 個(gè)菌落均為同一種真菌，分生孢子形態(tài)與病果上霉?fàn)钗镧R檢結(jié)果一致。選取代表性菌落進(jìn)行單孢分離，經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)移培養(yǎng)，獲得了一些菌落和孢子完全一致的純培養(yǎng)物，編號(hào)為OJ20190628。從PDA 上培養(yǎng)10 d 的純培養(yǎng)物中獲得孢子制備濃度為1×103的孢子懸浮液。

孢子懸浮液接種2 d 后，帶皮果表面開(kāi)始出現(xiàn)點(diǎn)狀水漬斑，5 d 病斑已擴(kuò)大變成黑色，病斑邊緣呈水漬狀，有的病斑上開(kāi)始出現(xiàn)白色霉?fàn)钗?，病狀與田間一致；對(duì)照無(wú)癥狀。從有癥狀的果實(shí)中重新分離到與接種一致的真菌，確認(rèn)菌株OJ20190628 對(duì)澳洲堅(jiān)果果實(shí)有致病性。

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

病果上霉?fàn)钗镧R檢：霉?fàn)钗餅榫z體和分生孢子，分生孢子棒狀，有5 個(gè)隔，大小66～72 μm×5.2～6.0 μm。

菌株OJ20190628 在PDA 上菌絲白色，老熟菌絲棕色至紅棕色（圖1，a）。在PDA 上產(chǎn)生大量分生孢子，分生孢子圓柱形（圖1，b，c），長(zhǎng) 61～81 μm，寬 4.3～6.3 μm，有5 個(gè)隔。厚垣孢子褐色或棕褐色，串生或聚生，近球形、橢圓形及長(zhǎng)圓柱形（圖1，d）。分生孢子梗有大型分生孢子梗和小型分生孢子梗，大型分生孢子梗由總梗、帚狀可育分枝、伸延梗和頂生囊泡組成；分生孢子總梗有隔，長(zhǎng)50～145 μm，寬5.6～9.0 μm；伸延梗有隔（圖1，e），直或彎曲，長(zhǎng)190～340 μm，寬3.1～5.5 μm，終止于棒狀的囊泡；棒狀的囊泡寬3.1～5.0 μm。帚狀可育分枝常3 級(jí)分枝（圖1，f），偶見(jiàn)4、5 級(jí)分枝，孢子梗長(zhǎng)49～100 μm，寬6～9 μm；1 級(jí)分枝0～1 隔，長(zhǎng)16～33 μm，寬3～6 μm；2 級(jí)分枝0～1 隔，長(zhǎng)17～29 μm，寬4～6 μm；3 級(jí)分枝無(wú)隔，長(zhǎng)14～22 μm，寬3～6 μm，每個(gè)末端分支產(chǎn)生1～3 瓶梗，瓶梗無(wú)隔，圓柱形至臘腸狀，單生時(shí)倒梨形，長(zhǎng)12～23 μm，寬 3～6 μm?；谶@ 些形態(tài)特征，OJ20190628 鑒定為麗赤殼菌屬Calonectria pseudoreteaudii。

圖1 OJ20190628菌株的形態(tài)特征

2.2.2 分子鑒定

從菌絲體中提取DNA 基因組，通過(guò)3 對(duì)引物對(duì)ITS1/ITS4、HIS3、β-tubulin 片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、測(cè)序，分別獲得521 bp ITS（MN906306）、450 bp HIS3（MT052331）、331 bp TUB2（MT052332）等 序列，在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比較，通過(guò)BLAST搜索核酸數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，這些序列分別與已報(bào)道的Ca.pseudoreteaudii系列中的FAFU201101 菌株的ITS（JN794044）、HIS3（JN975409）和TUB2（JN975408）序列同一性分別為100%，100%和99.6%。通過(guò)MEGA7 軟件構(gòu)建病原菌OJ20190628 的rNDA-ITSHIS-TUB 多基因聯(lián)合與近源物種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示病原菌OJ20190628 與Ca.pseudoreteaudii位于同一分枝，支持率為100%（表1、圖2）。

圖2 OJ20190628基于rNDA-lTS-HlS 多基因聯(lián)合與近源物種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表1 參考菌株名稱、館藏號(hào)和GenBank登錄號(hào)

形態(tài)學(xué)和分子鑒定分析表 明病原 菌OJ20190628 是Ca.pseudoreteaudii。

2.3 藥劑毒力測(cè)試

試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，參試的14 種藥劑中有8 種藥劑對(duì)病原菌菌絲的生長(zhǎng)抑制率達(dá)50%以上，分別是唑醚·甲硫靈、多菌靈、甲基硫菌靈、丙環(huán)·咪鮮胺、氟唑菌酰羥胺、肟菌·戊唑醇、咪鮮胺、吡唑醚菌酯·喹啉銅，其中抑制率達(dá)75%以上有多菌靈、甲基硫菌靈、唑醚·甲硫靈、丙環(huán)·咪鮮胺、氟唑菌酰羥胺、肟菌·戊唑醇等6 種藥劑防治黑果??；噁霉·乙蒜素、苯甲·百菌清、嘧菌酯、苯甲·嘧菌酯、苯醚甲環(huán)唑等6 種藥劑的生長(zhǎng)抑制率低于50%。

表2 不同藥劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

3 討論

由Calonectria pseudoreteaudii引起澳洲堅(jiān)果果實(shí)黑斑病為首次報(bào)道。由Ca.pseudoreteaudii引起植物病害的報(bào)道不多見(jiàn)，目前已報(bào)道Ca.pseudoreteaudii是桉樹(shù)焦枯病的病原菌之一［13-14］。麗赤殼屬Calonectria無(wú)性型為帚梗柱孢霉屬Cylindrocladium，但由Cylindrocladium引起植物病害的報(bào)道并不多見(jiàn)。在云南景洪引起澳洲堅(jiān)果果實(shí)褐斑病發(fā)生的是Ca.Pentaseptata［15］，在德宏引起黑果實(shí)病的是Ca.pseudoreteaudii，Ca.pentaseptata與Ca.pseudoreteaudii為同屬不同種，或許是因?yàn)榈赜虿町悓?dǎo)致的種間差異，是否也表明在我國(guó)澳洲堅(jiān)果種植區(qū)造成果實(shí)病害的Ca.pentaseptata與Ca.pseudoreteaudii這兩種病原菌具有明顯的區(qū)域性為害特征，即Ca.pentaseptata與Ca.pseudoreteaudii引起的果實(shí)病害為我國(guó)澳洲堅(jiān)果種植區(qū)所特有的一種新病害。

在調(diào)查過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，這兩種病原菌除引起澳洲堅(jiān)果的果實(shí)感病外，還可引起葉斑、葉枯，嚴(yán)重的造成枝條回枯，說(shuō)明這兩種菌對(duì)澳洲堅(jiān)果果樹(shù)的危害不可忽視，或許還有一些潛在的危害可能尚未被發(fā)現(xiàn)，這兩種菌有可能成為云南澳洲堅(jiān)果栽培過(guò)程中重要的病原菌。

Ca.pseudoreteaudii產(chǎn)孢最適溫度為25℃，孢子萌發(fā)最適溫度為28℃，孢子萌發(fā)與相對(duì)濕度成正相關(guān)，黑暗有助于孢子萌發(fā)［16］，這些特性與澳洲堅(jiān)果黑果病發(fā)生的環(huán)境高度相吻合。澳洲堅(jiān)果黑果病發(fā)生在高溫、高濕的雨季，病害傳播速度快，因而要控制黑果病的發(fā)生就必須改善果園的環(huán)境條件，即降低果園的濕度，增加果園的通風(fēng)透光，進(jìn)入發(fā)病期采用化學(xué)藥劑控制。

4 結(jié)論

澳洲堅(jiān)果黑果病主要發(fā)生在高溫、高濕的雨季6—8 月，種植過(guò)密、蔭蔽度較高的果園易發(fā)生黑果病流行，控制該病害發(fā)生流行應(yīng)采用綜合防治措施：第一建立病蟲(chóng)害監(jiān)測(cè)；第二加強(qiáng)果園修剪、施肥等田間管理；第三預(yù)防為主，進(jìn)入雨季出現(xiàn)第一次連續(xù)降雨后適時(shí)采用化學(xué)藥劑防治，化學(xué)藥劑防治推薦使用唑醚·甲硫靈、多菌靈、甲基硫菌靈、丙環(huán)·咪鮮胺等4 種常見(jiàn)藥劑。