生殖細(xì)胞條件性敲除Usp16 基因小鼠的建立、鑒定及表型分析

李衛(wèi)杰，梁冬麗，劉永忠，王朝霞，喬中東，徐汪節(jié)*

(1. 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240；2. 上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，上海 200240；3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院仁濟(jì)醫(yī)院上海腫瘤研究所癌基因與相關(guān)基因國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240)

精子發(fā)生是一個(gè)由一系列基因的精細(xì)調(diào)控完成的復(fù)雜過程，其間經(jīng)歷劇烈的形態(tài)與功能的變化。 我們前期發(fā)現(xiàn)，不育患者精子中的Usp16 表達(dá)下調(diào)[1]，提示Usp16 可能與精子質(zhì)量有關(guān)。

去泛素化酶Usp16 可特異性去除組蛋白H2A的泛素化修飾，調(diào)節(jié)Hox基因表達(dá)[2]、影響胚胎干細(xì)胞和造血干細(xì)胞分化[3-4]、對DNA 損傷修復(fù)起著負(fù)調(diào)控作用[5]。 Usp16 S552 的磷酸化是細(xì)胞正常增殖和細(xì)胞周期G2/M 期進(jìn)程的基礎(chǔ)[6-8]。 此外，Usp16 參與Wnt 途徑的調(diào)節(jié)[9]、參與T 細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病的發(fā)展[10]、還影響腫瘤的生長[11]。 但是Usp16 在精子發(fā)生中相關(guān)的功能研究較少。

由于Usp16 全身性敲除導(dǎo)致動(dòng)物胚胎死亡[3]，所以本研究擬通過Cre-loxP 系統(tǒng)[12]構(gòu)建生殖細(xì)胞特異性(Vasa-cre)敲除Usp16 小鼠，并分析其生殖表型來初步探究Usp16 在小鼠生精過程中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3 只野生型雄鼠(WT)、3 只雜合敲除 Usp16 雄鼠(Usp16flox/wt/Vasa-cre+)和3 只純合敲除Usp16 雄鼠(Usp16flox/flox/Vasa-cre+)為 4 月齡，體重約為28 g，用于表型分析。 5 只野生型雄鼠(WT)、27 只野生型雌鼠(WT) 和 2 只純合敲除 Usp16 雌鼠(Usp16flox/flox/Vasa-cre+)用于生育實(shí)驗(yàn)，3 月齡，體重約為 26 g(雄鼠)和 22 g(雌鼠)。 1 只 Vasa-cre 轉(zhuǎn)基因雄鼠(B6. FVB-Tg(Ddx4-cre)1Dcas/KnwJ)購自賽業(yè)模式生物研究中心(太倉)有限公司【SCXK(蘇)2018-0003】，6 月齡，約 29 g。 1 只 Usp16flox/flox雌鼠由上海市腫瘤研究所劉永忠課題組【SYXK(滬)2018-0028】贈(zèng)送，4 周齡，約 15 g。 以上小鼠均為SPF 級，遺傳背景均為C57BL/6 N，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(滬)2018-0028】，溫度為20 ～25℃，濕度為40% ～70%，晝夜各半循環(huán)照明，籠具、飼料、墊料和飲水經(jīng)高壓滅菌處理。 繁殖采用雌雄比 1 ∶1 或 2 ∶1 合籠，小鼠出生21 ～ 28 d 后分籠，至8 周齡性成熟。 所有操作均符合上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理與使用委員會(huì)要求(審批號:A2021025)。

1.1.2 主要試劑與儀器

引物合成(上海桑尼生物科技有限公司)、血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒(DP304，天根生化科技 (北京) 有限公司)、 2 × Es Taq MasterMix(Dye)(CW0690，北京康為世紀(jì)生物科技有 限 公 司 )、 RNAiso plus ( 9109， TaKaRa )、PrimeScriptTMRT Reagent Kit(RR037A，TaKaRa)、FastStart Universal SYBR Green Master ( Rox )(04913850001，Roche)、兔抗小鼠 Usp16 抗體(14055-1-AP，武漢菲恩生物科技有限公司)、β-actin 抗體(ab6276，Abcam)、Alexa Fluor 594 山羊抗兔熒光二抗(A-11012，賽默飛世爾科技公司)、山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP(CW0102S，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、山羊抗兔IgG (H+L)-HRP(CW0103S，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、抗熒光淬滅封片液(含Hoechst 33342)(P0133-5 mL，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、ECL 發(fā)光試劑(C510043，生工生物工程(上海)股份有限公司)、Diff-Qick 染色液(G1541，北京索萊寶科技有限公司)。

邁朗精子分析儀(南寧松景天倫生物科技有限公司，中國)、電泳儀、PCR 擴(kuò)增儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀和凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)、熒光顯微鏡(Zeiss，德國)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的繁殖與篩選鑒定

應(yīng)用Cre-loxP 基因編輯技術(shù)(圖1A)，將Vasacre 轉(zhuǎn)基因雄鼠與雌鼠Usp16flox/flox雜交，得F1 代雄鼠Usp16flox/wt/Vasa-cre+為雜合敲除組，繼續(xù)與雌鼠Usp16flox/flox回交得 F2 代雄鼠 Usp16flox/flox/Vasa-cre+為純合敲除組(圖1B)。

圖1 條件性敲除Usp16 小鼠的構(gòu)建與繁殖Note. A. Cre-loxP knockout principle. B. Reproductive strategy.Figure 1 Construction and reproduction of Usp16 conditional knockout mice

剪取7 日齡左右小鼠腳趾，按照TIANGEN 試劑盒提取DNA，通過PCR 擴(kuò)增并進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳的方法確定小鼠基因型。 PCR 擴(kuò)增10 μL 體系為 2 × Es Taq MasterMix(Dye)5 μL，ddH2O 4 μL，10 μmol/L 引物各 0.25 μL，模板 DNA 0.5 μL。Vasa-cre 基因擴(kuò)增條件為 94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃45 s，33 個(gè)循環(huán)；Usp16-wt 基因擴(kuò)增條件為 94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 45 s，38 個(gè)循環(huán)；Usp16-loxP 基因擴(kuò)增條件為 94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 60 s，33 個(gè)循環(huán)。 所使用的引物信息見表1。

表1 小鼠基因型鑒定引物信息Table 1 Primers for mouse genotyping

1.2.2 小鼠組織總RNA 提取及qPCR

新鮮組織經(jīng)液氮研磨后，用RNAiso plus 提取組織總RNA，取 1 μg 總 RNA 按反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。 cDNA 為模板，依照 Roche 熒光定量試劑盒說明書，用 Bio-Rad 熒光定量 PCR 儀進(jìn)行 qPCR。目的基因 Usp16 上游引物:5’-CTGCCAAGACT GTAAGACTGAC-3’， 下 游 引 物: 5’-GGTGTCGTG TAGTGCTTCAAG-3’，內(nèi)參基因 GAPDH 上游引物:5’-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3’，下游引物:5’-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3 ’。 反 應(yīng) 體 系:FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) 10 μL，ddH2O 6.8 μL，上下游引物各 0.6 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件:95℃ 10 min 預(yù)變性，95℃ 10 s，60℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。 用 2-ΔΔCt法分析結(jié)果。

1.2.3 Western Blot

用RNAiso plus 提取組織總蛋白后，加入5×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液后煮沸10 min，取30 μL上樣，恒壓60 V 濃縮蛋白，恒壓120 V 分離蛋白(8%分離膠)，恒流300 mA 濕轉(zhuǎn)90 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(1 ∶2000 稀釋)于 4℃ 過夜，TBST 洗膜后加入相應(yīng) HRP 偶聯(lián)二抗(1 ∶20 000 稀釋)室溫孵育 1 h，TBST 洗膜后ECL 化學(xué)發(fā)光顯色于成像儀成像，結(jié)果用軟件Image J 進(jìn)行灰度分析，β-actin 為內(nèi)參。

1.2.4 HE 染色和免疫熒光

組織于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，顯微鏡下拍照。 免疫熒光:切片脫蠟至水，放入預(yù)熱的檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中微波加熱30 min自然冷卻后，0.5% Triton X-100 通透 20 min，PBS 洗后5%山羊血清37℃封閉90 min，PBS 洗后一抗(1∶200 稀釋)4℃ 孵育過夜，PBS 洗后二抗(1 ∶200稀釋)室溫孵育1 h，PBS 洗后滴加抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下拍照。

1.2.5 精液分析及精子涂片

取小鼠一側(cè)附睪，剪開小口使精液置于精子獲能液HTF 中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱10 min，稀釋100倍后用邁朗精子分析儀分析。 其中取10 μL 精液涂片風(fēng)干后，Diff-Qick 快速染色，顯微鏡下拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，結(jié)果用GraphPad Prism 8 軟件統(tǒng)計(jì)分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組間平均值比較采用Student’st檢驗(yàn)，多組間平均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 Usp16 在野生型成年雄鼠不同組織中表達(dá)情況

qPCR 和 Western Blot 結(jié)果顯示 Usp16 在成年雄鼠睪丸組織表達(dá)量最高，在其他組織中(心、肝、脾、肺、腎和胃)表達(dá)量較低(圖2)。

圖2 Usp16 在野生型成年雄鼠不同組織中的表達(dá)情況Note. A. Usp16 mRNA expression level detected by qPCR. B. Usp16 protein expression level detected by Western Blot.Figure 2 Expression of Usp16 in different tissues of wild-type adult male mice

2.2 Usp16 條件性小鼠的建立及驗(yàn)證

Usp16 條件性小鼠是在Usp16 基因第4 個(gè)外顯子兩端插入loxP 位點(diǎn)，PCR 條帶大小為961 bp，若被Vasa-cre 重組酶敲除則為170 bp，野生型和Vasacre 陽性條帶大小分別為 607 bp 和 240 bp，Usp16flox/wt小鼠可見 607 bp 和 961 bp 條帶，Usp16flox/flox小鼠只可見961 bp，雜合子 Usp16flox/wt/Vasa-cre+小鼠可見 961、607 和 240 bp 條帶，純合子Usp16flox/flox/Vasa-cre+小鼠可見 961、170 和 240 bp條帶(圖3)。

圖3 小鼠腳趾DNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后電泳條帶Note. 1. Wild type. 2. Vasa-cre. 3. Usp16flox/wt. 4. Usp16flox/flox. 5.Usp16flox/wt/Vasa-cre+. 6. Usp16flox/flox/Vasa-cre+.Figure 3 Electrophoresis band of PCR amplification of mouse toe DNA

Usp16flox/wt/Vasa-cre+雄鼠與Usp16flox/flox雌鼠雜交共產(chǎn)仔 80 只(雄鼠 43 只，雌鼠 37 只)。 其中Usp16flox/wt基因型小鼠 26 只，Usp16flox/flox基因型小鼠21 只，Usp16flox/wt/Vasa-cre+基因型小鼠 27 只，Usp16flox/flox/Vasa-cre+基因型小鼠 6 只(雌鼠 3 只，雄鼠 3 只)。

qPCR 結(jié)果顯示:相較于野生型，雜合敲除組和純合敲除組雄鼠睪丸中Usp16 mRNA 表達(dá)顯著降低，分別降低了約83%和99%(Mean 0.17 SD 0.01 vs Mean 1.03 SD 0.03，P＜ 0.0001；Mean 0.01 SD 0.01 vs Mean 1.03 SD 0.03，P＜ 0.0001)(圖 4A)。Western Blot 結(jié)果顯示相較于野生型，雜合敲除組和純合敲除組雄鼠睪丸中Usp16 蛋白表達(dá)顯著降低，分別降低了約22%和43%(Mean 0.58 SD 0.10 vs Mean 0.75 SD 0.03，P= 0.0445；Mean 0.43 SD 0.05 vs Mean 0.75 SD 0.03，P= 0.0007)(圖 4B)。免疫熒光結(jié)果顯示Usp16 高表達(dá)于圓形精子，在體細(xì)胞中弱表達(dá)，純合敲除組雄鼠睪丸中Usp16 陽性圓形精子明顯少于野生型(圖4C)。 這些結(jié)果從基因和蛋白水平證明生殖細(xì)胞特異性敲除Usp16 小鼠建立成功。

圖4 條件性敲除Usp16 小鼠驗(yàn)證Note. A. The expression of Usp16 mRNA levels in the testis of the wild type， heterozygous knockout and homozygous knockout group detected by qPCR. Compared with the wild type，****P ＜ 0.0001. B. The expression of Usp16 protein levels in the testis of the wild type， heterozygous knockout and homozygous knockout group detected by Western Blot. Compared with the wild type，*P ＜ 0.05，***P ＜ 0.001. C. Immunofluorescence detection of Usp16 in the testis. Red fluorescence represents Usp16 and blue fluorescence represents cell nucleus. Arrow. Positive germ cells.Figure 4 Verification of Usp16 conditional knockout mice

2.3 Usp16 條件性敲除小鼠表型分析

2.3.1 Usp16 敲除對睪丸組織形態(tài)的影響

野生型、雜合敲除組和純合敲除組的睪丸中曲細(xì)精管排列緊密，結(jié)構(gòu)完整，直徑大小沒有明顯變化，管腔空腔化明顯，管壁至管腔的各類生精細(xì)胞層次分明，但純合敲除組睪丸中部分管腔中含有少量圓形精子相融形成的多核細(xì)胞(見圖5)。

圖5 睪丸HE 染色Note. Arrow. Multinucleated cell.Figure 5 HE staining of the testis

2.3.2 Usp16 敲除對附睪組織形態(tài)的影響

相較于野生型，純合敲除組附睪中精子密度減小，且附睪中早熟精子數(shù)顯著增加了約3 倍(Mean 5.77 SD 1.68 vs Mean 1.40 SD 0.36，P= 0.0117)，而雜合敲除組無明顯差異(圖6)。

圖6 附睪HE 染色Note. Solid arrow. Precocious sperm. Compared with the wild type，nsP ＞ 0.05，*P ＜ 0.05.Figure 6 HE staining of the epididymis

2.3.3 Usp16 敲除對精子質(zhì)量及出生率的影響

野生型和雜合敲除組雄鼠生育能力正常，純合敲除雌鼠也能正常生育產(chǎn)仔。 而純合敲除組雄鼠僅與其交配的15 只雌鼠中的1 只成功生育鼠仔，受孕率約7%(表2)。

表2 生育能力測試Table 2 Fertility test

純合敲除組雄鼠的精子數(shù)量、活率和活力相較于野生型顯著下降，分別下降了約79%、81%和87%，精子運(yùn)動(dòng)速度(VSL、VCL、VAP)與精子空間位移程度(ALH、BCF、MAD)也顯著降低，分別降低了約80%、80%、80%、80%、78%和 78%，而雜合敲除組精子各參數(shù)沒有顯著差異(表3)。

表3 計(jì)算機(jī)輔助精子分析Table 3 Computer-aided sperm analysis

野生型和雜合敲除組中有一些精子的頭部、頸部和尾部會(huì)發(fā)生畸形，而純合敲除組相較于野生型精子畸形率顯著增加了約4 倍，高達(dá)約83%(Mean 83.33 SD 6.11 vs Mean 18.33 SD 5.51，P=0.0002)。 畸形類型有精子頭部無鉤狀不定型畸形，尾部和頸部出現(xiàn)卷曲或彎曲(圖7)。

圖7 精子涂片染色Note. Solid arrow. Curved neck and tail. Hollow arrow. Abnormal head. Compared with the wild type，nsP ＞ 0.05，****P ＜ 0.0001.Figure 7 Staining of sperm smear

3 討論

本研究通過Vasa-cre 轉(zhuǎn)基因小鼠與Usp16 條件性小鼠(Usp16flox/flox)雜交成功獲得生殖細(xì)胞特異性敲除Usp16 小鼠，并從基因和蛋白水平得到證實(shí)。Vasa 蛋白從12.5 dpc 開始表達(dá)持續(xù)至減數(shù)分裂后的精子細(xì)胞，通過與Vasa-cre 小鼠雜交，雄鼠睪丸中生殖細(xì)胞中的Usp16 被定向敲除，而除了睪丸中生殖細(xì)胞外，Usp16 在支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)，故敲除后Western Blot 中仍能看到條帶，在免疫熒光中也有熒光表達(dá)。

精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜而有序的過程，從精原細(xì)胞分化、精母細(xì)胞減數(shù)分裂至精子成熟，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都有可能造成生殖缺陷。 雜合敲除組相對于野生型，Usp16 表達(dá)量也顯著降低，但生殖細(xì)胞中還存在Usp16，可能降低的Usp16 表達(dá)量不足以影響精子發(fā)生，故其精子質(zhì)量和數(shù)量與野生型相比沒有明顯差異。 純合敲除雄鼠(Usp16flox/flox/Vasa-cre+)附睪中精子濃度明顯減少，曲細(xì)精管管腔中出現(xiàn)更多的早熟精子被釋放入附睪中，可能是由于精子釋放過程異常[13]，使得精細(xì)胞未能完成重塑形成成熟精子而被釋放入附睪中。 而純合敲除雄鼠睪丸中出現(xiàn)的少量多核細(xì)胞可能是由于圓形精子相融來抵抗細(xì)胞凋亡[14]。 此外，精子變態(tài)形成過程包含頂體發(fā)生、鞭毛形成和多余胞質(zhì)脫落，其中生殖細(xì)胞染色質(zhì)重塑[15]和組蛋白與魚精蛋白的交換[16]對精子形成至關(guān)重要，此過程的異常往往導(dǎo)致精子畸形，精子質(zhì)量下降。 例如，E3 泛素連接酶RNF8 的缺失[17]或是Miwi 的雜合突變[18]都導(dǎo)致組蛋白上泛素化修飾的缺失，使得組蛋白和魚精蛋白無法完全交換造成精子少弱畸形癥，而純合敲除Usp16 雄鼠的生殖表型與其類似。 去泛素化酶Usp16 可特異性去除組蛋白H2A 泛素化修飾，且它在圓形精子細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[19]，推測其可能參與圓形精子至精子成熟的變態(tài)過程，其是否在此過程中調(diào)節(jié)組蛋白的泛素化修飾使得組蛋白和魚精蛋白交換異常，從而造成精子畸形、精子活力低和精子數(shù)量少等，還需進(jìn)一步研究。 此外，純合敲除雌鼠能正常生育產(chǎn)仔，推測Usp16 對其卵子形成沒有明顯影響。

綜上所述，本文從基因和蛋白層面證實(shí)了成功構(gòu)建了生殖細(xì)胞特異性敲除Usp16 小鼠。 通過對其生殖表型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)純合敲除雄鼠精子數(shù)量和活力嚴(yán)重下降，大量精子形態(tài)出現(xiàn)異常，這些表型提示，去泛素化酶Usp16 可調(diào)節(jié)精子生成過程來影響精子質(zhì)量和數(shù)量，最終對雄性生殖能力產(chǎn)生作用，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。