酒精性肝病與腸道微生物群落研究進展

李國華，李鶴齡，陳智崗，劉海原，王宏*

(1. 昆明理工大學(xué)靈長類轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，省部共建非人靈長類生物醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，昆明 650500；2. 云南中科靈長類生物醫(yī)學(xué)重點實驗室，昆明 650500)

酒精性肝病(alcoholic liver diseases，ALD)是一類從無癥狀肝細(xì)胞脂肪變性發(fā)展為肝纖維化、肝硬化，或者發(fā)展為酒精性肝炎的疾病[1]。 ALD 是慢性肝病的主要病因之一，占美國肝硬化相關(guān)疾病死亡病例數(shù)的48%[2]。 我國也因酗酒人數(shù)激增，產(chǎn)生了大量酒精性肝病患者。 尋找酒精性肝病的治療方法和早期干預(yù)是當(dāng)前需要解決的問題。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)肝疾病與腸道微生物群落有密切的相關(guān)性。 國內(nèi)外以小鼠、大鼠及非人靈長類動物為模型進行了關(guān)于腸道菌群失調(diào)在肝損傷中的發(fā)生發(fā)展機制的相關(guān)研究。 隨著對兩者關(guān)系研究的不斷深入，逐漸明晰了其作用機制。 本文從酒精性肝病與腸道微生物群落相關(guān)性研究進展，存在問題及未來發(fā)展趨勢幾個方面進行綜述，為利用微生物治療酒精性肝病探索有效方法。

1 酒精性肝損傷

酒精是最常見的能導(dǎo)致肝損傷的物質(zhì)。 酒精一般指乙醇，乙醇主要利用細(xì)胞質(zhì)中的醇脫氫酶代謝為乙醛，乙醛再由乙醛脫氫酶代謝為二氧化碳和水。 過量飲酒后中間產(chǎn)物乙醛不能及時代謝為水和二氧化碳，會與多種蛋白和DNA 結(jié)合形成加合物，干擾多種酶活性，影響脂質(zhì)代謝、DNA 復(fù)制等，導(dǎo)致肝損傷甚至癌變[3]。 乙醇可誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，經(jīng)STING-IRF3 等信號傳導(dǎo)通路導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡[4]。 長期攝入酒精能產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，如丙二醛、4-羥基壬烯醛等，過氧化物能與蛋白結(jié)合形成蛋白加合物，作為抗原能激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答，增加肝中T 細(xì)胞數(shù)量[3]。 乙醇能破壞腸道緊密連接完整性，使腸道通透性增強，導(dǎo)致內(nèi)毒素容易進入血液中損傷肝[3]。 酒精性肝病也與腸道細(xì)菌過度增殖，擬桿菌和益生菌比例變低有關(guān)[5]。

酒精性肝損傷模型是研究酒精對肝病及與腸道微生物關(guān)系的有力工具。 本課題組建立了獼猴酒精肝模型，研究酒精對肝的致病機制，探索治療酒精性肝病的新藥和方法[6]，闡述了酒精性肝病和腸道微生物群落之間的相關(guān)性[7]。

2 腸道微生物群落與酒精性肝病

腸道微生物群落與酒精性肝病密切相關(guān)，并參與肝細(xì)胞脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌等病理進程。 腸道微生物群落和肝互相作為彼此的物質(zhì)基礎(chǔ)，共同促進疾病的發(fā)生發(fā)展過程。

2.1 腸道微生物群落與酒精性肝病(ALD)

酗酒是導(dǎo)致肝病的常見原因。 臨床研究表明攝入酒精影響腸道菌群的組成。 而且，腸道菌群對酒精性肝損傷的發(fā)病機制也有重要作用。 酗酒能誘導(dǎo)腸道菌群組成發(fā)生改變，雖然確切改變機制還不清楚，但菌群產(chǎn)物通過門靜脈入血對肝損傷有重要影響[8]。 酒精具有肝毒性，因酒精導(dǎo)致的肝病仍是世界上最常見的疾病之一[9]。 一方面酒精通過毒性中間代謝產(chǎn)物乙醛刺激肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥。 另一方面，腸道菌群在ALD 中也發(fā)揮了重要作用。 濫用酒精導(dǎo)致某些腸道菌群過度增殖，菌群失調(diào)和腸道屏障失去功能，繼而細(xì)菌產(chǎn)生的產(chǎn)物(如LPS)通過門靜脈進入肝并刺激其發(fā)生炎癥和代謝紊亂[8]。

ALD、細(xì)菌的過度增殖與擬桿菌、益生菌(乳酸菌)有關(guān)，病因包括小腸運動障礙和膽酸池改變。乙醇破壞小腸緊密連接的完整性，長期濫用酒精的人腸道通透性增高，根據(jù)血漿內(nèi)毒素水平較健康對照組高可以判定。 動物模型中，通過基因突變、抗生素或表達(dá)非功能性TLR4 受體，可以降低酒精導(dǎo)致的肝損傷[3]。 而Petrasek 等[4]發(fā)現(xiàn)乙醇誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激并通過干擾素基因刺激因子(STING)活化IRF3 相關(guān)通路使肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，STING 缺乏或IRF3 缺乏均可防止肝細(xì)胞凋亡，說明乙醇本身也對肝病發(fā)生發(fā)展起作用。

以上研究證實肝病與腸道微生物群落密切相關(guān)。

2.2 腸道和肝相互作用的物質(zhì)基礎(chǔ)

腸道和肝通過與膽管、門靜脈和循環(huán)系統(tǒng)緊密連接溝通，形成腸-肝軸。 肝通過分泌膽酸到膽管，以及分泌許多生物活性物質(zhì)到體循環(huán)中，與腸道相互作用。 宿主和微生物在腸道代謝膽酸、氨基酸等內(nèi)源性物質(zhì)和攝入的食物等外源性物質(zhì)，消化吸收后再經(jīng)門靜脈轉(zhuǎn)運到肝進而影響功能[10]。

膽酸與腸道微生物群落相互作用相互調(diào)節(jié)。膽酸直接控制腸道微生物群落，通過與腸細(xì)胞中的法尼醇受體(FXR)結(jié)合，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗微生物肽，從而抑制腸道微生物過度生長，保護腸道屏障功能[10]。 膽堿在維持肝功能、腦功能、神經(jīng)功能、肌肉運動和正常新陳代謝方面發(fā)揮重要作用。 膽堿能被機體加工成磷脂酰膽堿，然后協(xié)助肝分泌極低密度脂蛋白(VLDL)，避免肝積聚甘油三酯，防止肝細(xì)胞脂肪變性。 膽堿還可以被腸道細(xì)菌轉(zhuǎn)化成三甲胺(TMA)，TMA 隨肝門靜脈到肝被轉(zhuǎn)變成氧化三甲胺(TMAO)，TMAO 增多會降低磷脂酰膽堿水平，進而導(dǎo)致甘油三酯在肝積聚，誘發(fā)肝細(xì)胞脂肪變性等一系列非酒精性脂肪肝[10]。

游離脂肪酸(FFA)是保護腸道健康的另一類物質(zhì)。 游離脂肪酸包括短鏈脂肪酸(SCFA)和飽和長鏈脂肪酸(LCFA)。 丁酸和丙酸是大腸中的主要短鏈脂肪酸，而且丁酸是腸細(xì)胞的能量來源并參與維持腸道屏障功能，保護肝不受腸道有害菌侵襲。 乙醇的不完全代謝產(chǎn)物乙醛增加會降低腸道屏障功能，誘導(dǎo)腸道細(xì)菌等微生物或抗原轉(zhuǎn)入肝增加損傷。 以三丁酸甘油的形式補充丁酸可以減少乙醇誘導(dǎo)的腸道通透性增加和肝損傷，但作用機制還不清楚[10]。

腸道屏障的主要組成是腸細(xì)胞。 腸細(xì)胞間通過頂端連接蛋白緊密連接在一起，限制腸管內(nèi)微生物和分子穿過，只允許營養(yǎng)物質(zhì)通過選擇性滲透或主動運輸?shù)姆绞酱┻^。 黏蛋白、抗菌凝集素、sIgA抗體和共生菌是另外幾種重要的腸道屏障成分，破壞其中1 ～2 種即可損傷腸道屏障完整，使腸道發(fā)炎，菌群失調(diào)及通透性增加。 阿克曼嗜黏蛋白菌(Akkermansia muciniphila)是一種定殖在腸道黏液層的革蘭氏陰性厭氧菌，它能通過降解黏蛋白增加腸道黏液層厚度。 該菌豐度降低會使腸道黏液層變薄、炎性增強，進而促進酒精性和非酒精性肝損傷[10-11]。

綜上所述，腸道菌群與肝損傷的相關(guān)機制復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展是一個相互影響、相互促進的過程。肝功能受損后，肝可通過改變膽汁分泌，減少腸道血液供應(yīng)及蠕動等，導(dǎo)致腸黏膜破壞和腸道菌群失衡。 腸道菌群可通過產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物如內(nèi)毒素等，增加腸壁通透性、激活肝免疫應(yīng)答，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，進而加重肝損傷。

3 微生物治療現(xiàn)狀

目前肝病治療除了用各種化藥外，微生物及其代謝產(chǎn)物療法也是熱門方案。 包括益生菌( probiotics )、 益 生 元 ( prebiotics )、 合 生 元(synbiotics)及后生元(postbiotics)等，使用后能不同程度改善有益微生物菌群數(shù)量、調(diào)節(jié)腸道菌群比例、增強腸道粘膜完整性、抑制有害微生物產(chǎn)生酒精等，發(fā)揮保腸護肝等作用。 小鼠模型中，使用艾克曼嗜黏蛋白菌 (Akkermansia muciniphila)和鼠李糖乳酸桿菌GG 株(L. rhamnosusGG)能提高腸道屏障功能，降低炎癥反應(yīng)，改善酒精性肝損傷[5，11]。Kirpich 等[12]用分叉雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)和植物乳桿菌8PA3(Lactobacillus plantarum8PA3)治療改善了患者肝損傷水平。 Han 等[13]用含有枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和屎腸球菌(Enterococcus faecium)的益生菌治療酒精性肝炎患者，結(jié)果顯示糞便大腸桿菌豐度減少，內(nèi)毒素血癥和肝功能相關(guān)的酶水平均有改善，但炎性因子水平?jīng)]有變化[14]。 果聚糖和半乳聚糖是典型的益生元，主要刺激腸道有益菌乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖。小鼠研究顯示果聚糖通過改變腸道微生物組成減少了飲食造成的肥胖、糖尿病、肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥[15]。 大鼠研究顯示果聚糖使大鼠的胰島素耐受趨于正常，并減少了子代肥胖[16]。 2017 年國際益生菌和益生元科學(xué)協(xié)會(International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics，ISAPP)更新了益生元概念，定義為能被宿主微生物選擇性利用并有益宿主健康的物質(zhì)，拓寬了益生元的范圍，如對人來說不是益生元的纖維素卻是反芻動物的益生元[17]。 利用益生菌和益生元的混合物也可促進宿主機體健康，這種益生菌-益生元的混合物被稱為合生元[18]，如雙歧桿菌(Bifidobacteria)和低聚果糖(fructooligosaccharides，F(xiàn)OS)、雙歧桿菌和低聚半乳糖(galactooligosaccharides， GOS)、鼠李糖乳桿菌GG 株(Lactobacillus rhamnosusGG)和菊粉(inulins)等。 2019 年ISAPP 更新了合生元概念，即能夠促進宿主機體健康的微生物及其底物(能被微生物利用的)混合物，該含義為合生元的研發(fā)提供了更廣闊的 空 間[19]。 糞 菌 移 植 ( fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)是將健康人糞便微生物群落移植到菌群失調(diào)患者腸道的一種療法。 FMT 最初用作艱難梭菌(Clostridioides difficile)感染患者的治療，大量治療案例表明FMT 有良好治療效果，移植菌群能穩(wěn)定存在于患者腸道發(fā)揮作用[20]。 Ferrere等[21]給酒精敏感小鼠移植酒精耐受性高的小鼠的新鮮糞便，飲酒結(jié)束后酒精敏感小鼠獲得了與耐酒精小鼠相似的腸道微生物群落，預(yù)防了肝細(xì)胞脂肪變性、肝炎，維持了腸道平衡，顯示通過糞菌移植調(diào)控腸道微生物群落可以預(yù)防酒精性肝損傷。 Philips等[22]選用ALD 病人做糞菌移植預(yù)實驗，結(jié)果顯示肝病程度明顯改善。 后續(xù)針對重度酒精性肝炎患者，采用FMT、營養(yǎng)療法、皮質(zhì)類固醇或己酮可可堿療法對比治療，結(jié)果顯示 3 個月后 FMT 生存率75%，遠(yuǎn)高于其它治療組(29% ～38%)，顯示FMT具有良好治療優(yōu)勢[23]。 由于印度患者的重度酒精性肝炎患者死亡率較高，而歐美地區(qū)的死亡率較低，Schnabl[24]認(rèn)為Philips 的FMT 療法對歐美重度酒精肝患者療效還有待進一步觀察。 擴大不同地區(qū)患者樣本數(shù)量或者建立靈長類酒精肝疾病模型用FMT 治療，應(yīng)是衡量FMT 療法的有力手段。 FMT療法在西方世界并不是新概念，Brandt 等[25]和Borody 等[26]記載這種方法最早在17 世紀(jì)用于獸醫(yī)治療。 古代中國也有類似的治療方式，公元4 世紀(jì)，東晉著名中醫(yī)葛洪就描述了用人的糞汁口服治療了病人食物中毒或嚴(yán)重腹瀉，該方法被收錄到《肘后備急方》中。 公元16 世紀(jì)，明朝醫(yī)學(xué)家李時珍在中醫(yī)專著《本草綱目》里也介紹了用發(fā)酵糞便懸液、新鮮糞便懸液、干糞便或嬰兒糞便等有效治療重度腹瀉、發(fā)熱、嘔吐、便秘等病癥[27]。

微生物療法是已被古今中外證實有效的治療方法，這些療法是前人豐富實踐經(jīng)驗的總結(jié)。 取得這樣的成果離不開前人善于發(fā)現(xiàn)，勇于嘗試，善于總結(jié)的務(wù)實精神。 這些療效顯著的治療方法提示我們傳統(tǒng)中醫(yī)藥中有很多寶貴經(jīng)驗有待發(fā)掘。 我們不僅要學(xué)習(xí)前人行之有效的驗方，更要學(xué)習(xí)古人善于觀察，善于向大自然學(xué)習(xí)的探索精神。

4 存在問題及下一步發(fā)展趨勢

腸道微生物群落與肝病之間有密切關(guān)系，科研人員從多方面證實了兩者之間的相互作用，但仍有諸多問題有待研究。 如大多數(shù)益生菌不能持久定殖在腸道，其機制仍不清楚，不同種類益生菌菌種間的組合對慢性肝病的效果沒有系統(tǒng)性評價等[28]。通過糞菌移植傳播腸道病原(如諾如病毒)，或者通過糞菌移植感染未知病原導(dǎo)致慢性病(如丙型肝炎、艾滋病等)，打亂腸道微生物群落平衡(誘導(dǎo)肥胖、糖尿病、動脈粥樣硬化)等都存在潛在風(fēng)險[20]。深入研究益生菌定殖機制，以及實現(xiàn)體外培養(yǎng)有益微生物群落，避免通過糞菌移植感染有害微生物，應(yīng)是益生菌治療需要解決的幾個主要問題。

后生元(postbiotics)和噬菌體(bacteriophage)是近年比較熱門的研究治療肝病的方向，有可能成為未來發(fā)展趨勢。 后生元是益生菌(probiotics)發(fā)酵加工后的多種代謝產(chǎn)物，包括短鏈脂肪酸(SCFAs)、細(xì)胞碎片、功能蛋白、胞外脂多糖、細(xì)胞裂解物、磷壁酸、肽聚糖源胞壁肽、菌毛類結(jié)構(gòu)等[29]。 2019年，ISAPP 給后生元定義為“有益宿主機體健康的滅活微生物和/或微生物體成分”[30]。 而且越來越多證據(jù)顯示后生元是推動益生菌發(fā)揮保健作用的關(guān)鍵[31]。 后生元能調(diào)節(jié)微生物群落，增強腸上皮細(xì)胞的屏障功能，調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)機體代謝，向神經(jīng)系統(tǒng)傳遞信號來調(diào)節(jié)行為和認(rèn)知功能等。后生元相比益生菌有諸多優(yōu)點，如不需要考慮在腸道定殖，是無生命體，穩(wěn)定性高等[30]。

利用噬菌體調(diào)節(jié)腸道菌群也是近年來研究比較熱門的方向。 Duan 等[32]利用糞腸球菌噬菌體殺滅了酒精性肝病小鼠中的糞腸球菌菌群，改善了酒精性肝病。 噬菌體具有感染特異性，只感染特定致病菌而不影響其它共生菌，同樣是治療腸道菌群失調(diào)非常有前景的方向。

5 總結(jié)與展望

腸道微生物群落與肝病之間的密切關(guān)系，提示我們需擺脫肝病只關(guān)注肝的局限研究思路，而應(yīng)轉(zhuǎn)向全面觀察相關(guān)臟器系統(tǒng)的整體觀思路。 腸-肝軸、腸-腦軸等理論的提出即是整體觀最有力的表現(xiàn)。 圍繞腸-肝軸，研究人員開發(fā)了一系列動物模型來探索肝病對腸道、腸道及其微生物群落對肝的相互作用。

隨著整體觀的發(fā)展，我們研究和看待疾病的思路也逐漸轉(zhuǎn)向把機體調(diào)整到平衡狀態(tài)，而不是直接把病原微生物全部殺滅。 例如，艱難梭菌在腸道過度增殖導(dǎo)致的腹瀉，采用糞菌移植的效果就比抗生素效果好。 每一個個體都是一個相對穩(wěn)定的平衡體系，艱難梭菌過量表現(xiàn)的腹瀉只是一個平衡被打破后表現(xiàn)出來的結(jié)果，真正的原因有可能是腸道菌群失調(diào)(制約其過度增殖的微生物群落比例太低)或機體穩(wěn)態(tài)平衡被打破，如果采用抗生素殺滅艱難梭菌，而腸道菌群沒有恢復(fù)平衡，依然會有別的病原微生物群落遞補進來成為優(yōu)勢菌群，導(dǎo)致疾病遷延不愈。 采用健康人的糞便微生物進行糞菌移植，即是借助外力來重建腸道平衡狀態(tài)，健康人腸道微生物群落中有足以制衡艱難梭菌的微生物，腸道菌群逐漸平衡后艱難梭菌占比下降，腹瀉即逐漸痊愈。 病毒細(xì)菌等微生物早于人類億萬年就已存在，滅絕它們不現(xiàn)實也無必要。 我們與微生物共生了很久，雙方互利共贏，它們在維持人類健康過程中發(fā)揮了重要作用。 即便有害微生物，在不同的環(huán)境條件下也可能轉(zhuǎn)變成有益微生物造福人類，它們的存在為人類適應(yīng)自然變化提供了多種可能。