轉(zhuǎn)基因人源化ACE2 裸小鼠模型的建立

孫路，付函君，劉云鵬，武婧，林凱麗，石桂英，王敬竹，孫井江，高虹

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，北京 100021)

宿主血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 2 (angiotensinconverting enzyme 2，ACE2)是一種鋅金屬蛋白酶，在肺、腸胃及大腦等組織中廣泛表達(dá)[1]。 ACE2 是SARS-CoV2 及 SARS-CoV 的受體，在研究 SARS 發(fā)病機(jī)制和抗病毒藥物的評價具有重要作用，也是本次新型冠狀病毒的藥物治療及疫苗研發(fā)靶點(diǎn)[2-5]。早在2003 年，研究者建立了人源化ACE2(hACE2)轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型[6]。 由于裸小鼠具有T 細(xì)胞缺乏的免疫缺陷等特點(diǎn)，本研究試圖建立一種攜帶hACE2 基因的免疫缺陷嚙齒類模型，為研發(fā)抗SARS-Cov2 病毒藥物和疫苗提供具有免疫缺陷的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

6 只 SPF 級 BALB/c-Nude 裸小鼠，雄性，10 周齡，23 ～25 g，購買于北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2019-0008】。 SPF 級 C57BL/6J野生型小鼠，10 周齡，23 ～ 25 g，6 只；SPF 級BALB/c-Nude 裸小鼠，10 周齡，23 ～ 25 g，6 只，購買于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2019-0010】。 SPF 級 K18-hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠，雌性，10 周齡，23 ～ 28 g，10 只，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物所【SCXK(京)2019-0011】提供。

實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物所動物屏障環(huán)境【SYXK(京)2019-0014】，設(shè)施溫度為21 ～26℃、相對濕度為40% ～70%、最小靜壓差 ≤10 Pa、動物光照為15 ～20 lx。 實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于該設(shè)施獨(dú)立通風(fēng)籠(IVC)中，實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)方法嚴(yán)格按照GB14925-2010 執(zhí)行，實(shí)驗(yàn)動物操作按照《實(shí)驗(yàn)動物使用及實(shí)驗(yàn)規(guī)程國家標(biāo)準(zhǔn)》執(zhí)行。 所有操作均通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物所實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查委員會的批準(zhǔn)(GH20017)。

1.1.2 主要儀器

本研究中主要儀器為全自動血液分析儀(西門子SG9000/ADV7A2120i)、流式細(xì)胞儀(BD LSRII Fortessa)、離心機(jī)(Thermo Pico17)、動物多功能麻醉機(jī)(合浦工貿(mào)HOPE-MED 8160)、小鼠獨(dú)立回風(fēng)飼養(yǎng)系統(tǒng)IVC(蘇州顧創(chuàng)FM1-108)、分析天平(賽多利斯GL323i-ISCN)。

1.2 方法

1.2.1 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠的建立

hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠的培育方式如圖1。 首先，采用雌性hACE2+/-小鼠與雄性BALB/c-Nude 裸小鼠按照1 ∶1 的比例雜交獲得F1 代小鼠；篩選F1代雌性hACE2+/-小鼠與雄性BALB/c-Nude 裸小鼠按照 1 ∶1 的比例回交獲得 F2 代；篩選 F2 代hACE2+/-小鼠中雄性裸小鼠與雌性hACE2+/-有毛小鼠互交獲得F3 代，在F3 代中獲得穩(wěn)定遺傳的hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠。 各代仔鼠出生21 d 后斷奶分籠飼養(yǎng)。

圖1 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠培育方案Note. Gg. hACE2 heterozygosis. GG. hACE2 homozygote. nunu. Nude homozygote.Figure 1 Cultivation scheme of hACE2 transgenic nude mice

1.2.2 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠的篩選

對各代6 ～7 日齡小鼠進(jìn)行剪趾順序編號，取2～5 mm 鼠尾于1.5 mL EP 管中，通過高鹽法提取DNA，通過PCR 反應(yīng)擴(kuò)增DNA，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行 DNA 鑒定(PCR 引物為 h-ACE2-MA-s1:5’-GGACAAGTTTAACCACGAAGCC-3 ’； h-ACE2-MA-as1:5’-CAGCTGAAGCTTGACTGTGAGAT-3’)。 根據(jù)以上結(jié)果篩選出hACE2 基因?yàn)殛栃缘膆ACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)中，取 2 月齡、5 月齡的 F3 代 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠(Nude-hACE2)6 只作為實(shí)驗(yàn)組；取2 月齡、5 月齡的 C57BL/6J 野生型小鼠(C57BL/6JWT)、K18-hACE2 小鼠(hACE2)、BALB/c-Nude 裸小鼠(BALB/c-Nude)各6 只作為對照組。

1.2.4 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠生理指標(biāo)的測定

(1)hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠表型及生長指標(biāo)的測定:自F2 代雌鼠見栓起，對孕鼠狀態(tài)進(jìn)行記錄。 F3代小鼠出生后對hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠的體重、身長、尾長等生長發(fā)育指標(biāo)進(jìn)行記錄。

(2)hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠臟器系數(shù)的測定:取F3 代hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠(Nude-hACE2)作為實(shí)驗(yàn)組，取 C57BL/6J 野生型小鼠(C57BL/6J-WT)、BALB/c-Nude 裸小鼠(BALB/c-Nude)作為對照組。小鼠稱量體重后，由眼眶靜脈叢采血，隨后進(jìn)行病理解剖觀察，采取肝、脾、腎、心臟、肺、腦等臟器并稱重。 臟器系數(shù)計(jì)算公式:臟器系數(shù)=(mg/g)。 通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與對照組進(jìn)行臟器系數(shù)間差異比較。

(3)hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠血常規(guī)檢測:取F3 代hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠(Nude-hACE2)作為實(shí)驗(yàn)組，取 C57BL/6J 野生型小鼠(C57BL/6J-WT)、K18-hACE2 小 鼠 ( hACE2)、 BALB/c-Nude 裸 小 鼠(BALB/c-Nude)作為對照組。 通過血液分析儀進(jìn)行血樣血細(xì)胞分析，與對照組進(jìn)行差異比較。

(4)hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠免疫指標(biāo)的測定:取F3 代hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠(Nude-hACE2)作為實(shí)驗(yàn)組，取 C57BL/6J 野生型小鼠(C57BL/6J-WT)、K18-hACE2 小鼠(hACE2)、BALB/c-Nude 裸小鼠(BALB/c-Nude)作為對照組。 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測T 細(xì)胞總量占白細(xì)胞總量百分比(CD45+CD3+)，輔助T 細(xì)胞量占T 細(xì)胞總量百分比(CD45+CD3+CD4+)，細(xì)胞毒T 細(xì)胞量占T 細(xì)胞總量百分比(CD45+CD3+CD8+)，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞總量占白細(xì)胞總量百分比(CD45+CD11B+)等指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組數(shù)據(jù)在分析前進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差()表示。 兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠的篩選

F3 代共育有小鼠44 只，通過PCR 反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因型鑒定，hACE2 基因陽性率為50%。 hACE2 基因陽性小鼠中，不同膚色的裸小鼠共占36.3%。

2.2 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠表型

hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠(F0 代)與雄性 BALB/c-Nude 裸小鼠雜交獲得的F1 代小鼠被毛均表現(xiàn)為棕色毛發(fā)；F2 代小鼠被毛共有4 種表型，分別為白色毛發(fā)小鼠、棕色毛發(fā)小鼠、裸色裸小鼠、黑色裸小鼠(見圖 2)。 F3 代表型與 F2 代相同，其中 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠共有2 種表現(xiàn)型，被毛膚色為裸色裸小鼠和黑色裸小鼠。

圖2 F0/F1/F2/F3 代hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠表型Figure 2 Phenotype of hACE2 transgenic mice of F0/F1/F2/F3

F3 代hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠哺乳期生長情況見圖3，新生hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠為粉紅色，雙眼未睜，耳廓與皮膚相連，腳趾粘連在一起，四肢和軀干向腹部蜷縮。 仔鼠在3 日齡前后耳廓張開，7 日齡前后腳趾完全張開、皮膚變厚部分出現(xiàn)褶皺，9 日齡前后下門齒生長，15 日齡前后睜眼，21 日齡前后活動自如，可自行采食飲水。 黑色裸小鼠7 日齡前后膚色由粉紅色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榘岛谏? 周齡時四肢及面部出現(xiàn)暗黑色變淡的現(xiàn)象，16 周齡前后全身顏色退至裸色，其余表型無差異。

圖3 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠哺乳期生長情況Figure 3 Growth of hACE2 transgenic nude mice during lactation

2.3 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠生理指標(biāo)

2.3.1 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠生長發(fā)育指標(biāo)

F3 代 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠由陽性 F2 代hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠互交繁殖獲得。 在實(shí)驗(yàn)期間，F(xiàn)2代母鼠妊娠期為(17.8 ± 1.7)d，哺乳期為21 d。 F2代母鼠共產(chǎn)5 胎次，產(chǎn)仔數(shù)量共計(jì)為44 只，每只產(chǎn)胎(8.8 ± 1.5) 只，其中裸色裸小鼠出生率為54.5%，黑色裸小鼠出生率為6.8%(見表1)。

表1 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠生長發(fā)育指標(biāo)測定結(jié)果Table 1 Measurement results of growth and development indexes of hACE2 transgenic nude mice

hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠身長、尾長測量結(jié)果如下，裸小鼠出生時，裸色裸小鼠身長為(2.58 ±0.13)cm、尾長為(1.30 ± 0.13)cm，黑色裸小鼠身長為(2.85 ± 0.29)cm、尾長為(1.14 ± 0.06)cm。裸小鼠離乳時，裸色裸小鼠身長為(5.72 ± 0.24)cm、尾長為(5.54 ± 0.19)cm，黑色裸小鼠身長為(5.66 ± 0.31)cm、尾長為(4.83 ± 0.37)cm(見圖4)。

圖4 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠哺乳期身長、尾長Figure 4 Body length & tail length of hACE2 transgenic nude mice during lactation

hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠體重測量結(jié)果如下，hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠出生時，裸色裸小鼠體重為(1. 5 ± 0. 1)g，黑色裸小鼠體重為(1. 4 ± 0. 1)g。 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠離乳時，裸色裸小鼠體重為(7. 8 ± 0. 6)g，黑色裸小鼠體重為(7. 7 ±1. 2)g。 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠性成熟時，裸色裸小鼠體重為(7. 8 ± 0. 6)g，黑色裸小鼠體重為(7. 7 ± 1. 2)g。 兩種不同表型的 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠相比較，身長、尾長和體重均無顯著性差異(見圖5)。

圖5 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠0 ～133 日齡體重Figure 5 Weight of hACE2 transgenic nude mice at 0 ～133 days

2.3.2 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠臟器系數(shù)

hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠解剖，該鼠體內(nèi)無胸腺，與BALB/c-Nude 裸小鼠解剖后情況相似，其他器官解剖時眼觀無明顯差異。

根據(jù)hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠體重及臟器系數(shù)結(jié)果比較顯示，2 月齡時，實(shí)驗(yàn)組Nude-hACE2 與對照組BALB/c-Nude 相比，脾系數(shù)出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)，其余各項(xiàng)均無明顯差異。 5 月齡時，實(shí)驗(yàn)組Nude-hACE2 與對照組BALB/c-Nude 相比，肝系數(shù)出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)，其余各項(xiàng)均無明顯差異(見表2 ～ 3)。

表2 C57BL/6J-WT、BALB/c-Nude 與Nude-hACE2 體重及臟器系數(shù)結(jié)果比較(2 月齡)(n = 6)Table 2 Comparison of C57BL/6J-WT， BALB/c-Nude and Nude-hACE2 weight and organ indexes(2 mouths)(n = 6)

2.3.3 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠血常規(guī)

血常規(guī)檢測結(jié)果所示，2 月齡時，實(shí)驗(yàn)組NudehACE2 與對照組 C57BL/6J-WT 相比，NEU、LYM、MONO 出現(xiàn)極顯著性差異(P＜ 0.01)；實(shí)驗(yàn)組Nude-hACE2 與對照組 hACE2 相比，NEU、LYM、MONO 出現(xiàn)極顯著性差異(P＜ 0.01)，BASO、RBC出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)組Nude-hACE2與對照組BALB/c-Nude 相比，LYM 出現(xiàn)極顯著性差異(P＜ 0.01)，HGB、EOS 出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)。 5 月齡時，實(shí)驗(yàn)組 Nude-hACE2 與對照組C57BL/6J-WT 相比，NUE、LYM、MONO、PLT 出現(xiàn)極顯著性差異(P＜0.01)；實(shí)驗(yàn)組Nude-hACE2 與對照組 hACE2 相比，NUE、LYM、MONO 出現(xiàn)極顯著性差異(P＜0.01)；實(shí)驗(yàn)組 Nude-hACE2 與對照組BALB/c-Nude 相比，NUE、LYM 出現(xiàn)極顯著性差異(P＜ 0.01)。 (見表 4 ～ 5)

表3 C57BL/6J-WT、BALB/c-Nude 與Nude-hACE2 體重及臟器系數(shù)結(jié)果比較(5 月齡)(n = 6)Table 3 Comparison of C57BL/6J-WT， BALB/c-Nude and Nude-hACE2 weight and organ indexes(5 mouths)(n = 6)

2.4 hACE2 基因裸小鼠免疫指標(biāo)檢測

流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠血液中CD19、CD3、CD4、CD8、CD11B 以及NK 細(xì)胞占比的結(jié)果如表4 所示。2 月齡時，實(shí)驗(yàn)組Nude-hACE2 與對照組C57BL/6JWT、hACE2 相比，CD45+CD3+、CD45+CD3+CD4+、CD45+CD3+CD8+和CD45+CD11B+出現(xiàn)極顯著性差異(P＜0.01)；實(shí)驗(yàn)組 Nude-hACE2 與對照組C57BL/6J-WT、hACE2 相比，CD45+NK+出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)組 Nude-hACE2 與對照組BALB/c-Nude 相比均無顯著性差異(見圖6)。 5 月齡時，實(shí)驗(yàn)組Nude-hACE2 與對照組C57BL/6J-WT、hACE2 相比，CD45+CD3+、CD45+CD3+CD4+和CD45+NK+均出現(xiàn)極顯著性差異(P＜0.01)，CD45+CD11B+均出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)組Nude-hACE2 與對照組BALB/c-Nude 相比各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著性差異(見圖7)。

圖6 C57BL/6J-WT、hACE2、BALB/c-Nude 與 Nude-hACE2 血細(xì)胞免疫水平比較(2 月齡)Figure 6 Comparison of immune levels between C57BL/6J-WT， hACE2， BALB/c-Nude and Nude-hACE2 (2 mouths)

圖7 C57BL/6-WT、hACE2、BALB/c-Nude 與 Nude-hACE2 血細(xì)胞免疫水平比較(5 月齡)Figure 7 Comparison of immune levelsbetween C57BL/6J-WT， hACE2， BALB/c-Nude and Nude-hACE2 (5 mouths)

表4 C57BL/6J-WT、hACE2、BALB/c-Nude 與 Nude-hACE2 血常規(guī)結(jié)果比較(2 月齡)(n = 6)Table 4 Comparison of blood routine results between C57BL/6J-WT， hACE2， BALB/c-Nude and Nude-hACE2(2 mouths)(n = 6)

表5 C57BL/6J-WT、hACE2、BALB/c-Nude 與 Nude-hACE2 血常規(guī)結(jié)果比較(5 月齡)(n = 6)Table 5 Comparison of blood routine results between C57BL/6J-WT， hACE2， BALB/c-Nude and Nude-hACE2(5 mouths)(n = 6)

3 討論

本研究成功建立了 BALB/c-Nude 為背景的hACE2 轉(zhuǎn)基因免疫缺陷裸小鼠動物模型。

hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠(Nude-hACE2)表現(xiàn)為無毛裸小鼠，生長發(fā)育情況與BALB/c-Nude 裸小鼠相近。 通過病理解剖觀察，hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠與BALB/c-Nude 裸小鼠相同，均缺少胸腺組織。 胸腺作為機(jī)體重要的淋巴組織，來自骨髓的淋巴干細(xì)胞在胸腺中分化為T 細(xì)胞，成熟的T 細(xì)胞再分化為輔助T 細(xì)胞和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞，隨后輸出胸腺，進(jìn)入外周淋巴器官。 hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠胸腺的缺少導(dǎo)致其無法正常分化T 細(xì)胞，進(jìn)而造成機(jī)體細(xì)胞免疫缺陷。 血常規(guī)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠血液血細(xì)胞分布情況與BALB/c-Nude 裸小鼠相近，與 C57BL/6J 野生型小鼠、hACE2 小鼠比較，LYM 偏低主要與hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠先天性免疫缺陷有關(guān)；NEU、MONO 偏高則可能是由于在環(huán)境中飼養(yǎng)中因免疫缺陷造成的某些細(xì)菌感染有關(guān)。

免疫指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠的CD45+CD3+、CD45+CD3+CD4+以及CD45+CD3+CD8+低于C57BL/6J 野生型小鼠，hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠的CD45+CD3+、CD45+CD3+CD4+以及CD45+CD3+CD8+均與 BALB/c-Nude 裸小鼠相近，反映hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠體內(nèi)T 細(xì)胞無法正常表達(dá)且在免疫水平上與BALB/c-Nude 裸小鼠具有很高的相似性，無胸腺導(dǎo)致缺乏成熟的T 細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能的缺失。

衰老對免疫系統(tǒng)有著深遠(yuǎn)的影響，免疫系統(tǒng)的固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答都隨著年齡增長而呈現(xiàn)功能下降[7-8]。 在老齡化過程中，由于胸腺的萎縮導(dǎo)致小鼠體內(nèi)T 細(xì)胞數(shù)量明顯減少，其分化增殖能力下降，誘生新的T 細(xì)胞記憶反應(yīng)能力也受損，導(dǎo)致T細(xì)胞庫的多樣性減少[9-10]。 根據(jù)不同月齡的免疫指標(biāo)結(jié)果，裸小鼠因具有胸腺退化的缺陷，自身的細(xì)胞免疫功能缺失，故hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠與BALB/c-Nude 裸小鼠相似，免疫能力自始至終都處于較弱的水平且免疫能力不隨年齡增長而發(fā)生改變。 同時，hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠由于其自身的免疫能力低下，在日常飼養(yǎng)的過程中，隨著年齡增加還需對其提供清潔的生活環(huán)境、富含營養(yǎng)的飼料等，防止因環(huán)境問題或飼養(yǎng)不當(dāng)而導(dǎo)致動物產(chǎn)生細(xì)菌感染或死亡。

hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠作為嚙齒類COVID-19 動物模型，可應(yīng)用于SARS-CoV2 發(fā)病機(jī)理、疫苗及治療效果等方面的研究，其主要的優(yōu)勢表現(xiàn)在遺傳背景清晰，繁殖周期短，飼養(yǎng)條件可控以及倫理問題較少[11]。 通過與裸小鼠繁育出的hACE2 轉(zhuǎn)基因裸小鼠不僅具有以上優(yōu)點(diǎn)，還具有裸小鼠先天性細(xì)胞免疫缺陷等特點(diǎn)，作為攜帶hACE2 基因的免疫缺陷動物模型，或許可以為SARS-CoV2 疫苗研究過程中安全性和免疫原性評價等方面提供一些支持。