耳蝸力學(xué)：基底膜行波測量技術(shù)進(jìn)展*

張?zhí)煊?王舒琪 任柳杰 李辰龍 姚文娟

耳蝸是聽覺系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)感音換能的核心器官，可對(duì)聲音信息進(jìn)行頻率分離、主動(dòng)放大等預(yù)處理，兼具寬頻率和強(qiáng)度范圍聲音感知、高靈敏低耗能的優(yōu)點(diǎn)。耳蝸精巧的結(jié)構(gòu)、特殊的組織材料特性是其功能實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)?；啄さ男胁ìF(xiàn)象是耳蝸進(jìn)行實(shí)時(shí)頻率分離的載體；外毛細(xì)胞電致運(yùn)動(dòng)則主動(dòng)放大行波響應(yīng)，是提高耳蝸敏感性的關(guān)鍵。自1961年Békésy提出行波理論，開創(chuàng)實(shí)驗(yàn)聽力學(xué)以來，大量學(xué)者致力于研究基底膜振動(dòng)特征、外毛細(xì)胞聽覺放大等問題，以揭示耳蝸高靈敏、寬頻率感音機(jī)制，形成了耳蝸力學(xué)這一多學(xué)科交叉研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。行波現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)測量是耳蝸力學(xué)的關(guān)鍵研究手段，測量技術(shù)的革新促成了耳蝸感音機(jī)制研究的若干次重大突破。

行波測量(基底膜及Corti器振動(dòng)測量)是耳蝸感音機(jī)制研究的最直接方法，分為振動(dòng)模式(pattern)測量法和點(diǎn)測量法兩類。振動(dòng)模式測量法需要大范圍打開耳蝸，以觀察耳蝸基底膜區(qū)域的振動(dòng)形態(tài)。Békésy即采用該方法并首次發(fā)現(xiàn)行波現(xiàn)象[1]，但由于振動(dòng)模式測量法需要破壞耳蝸正常結(jié)構(gòu)，同時(shí)Békésy采用離體標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，因而他測得的基底膜振動(dòng)呈線性，其調(diào)諧響應(yīng)弱于聽神經(jīng)，據(jù)此Békésy認(rèn)為蝸后(如神經(jīng))存在進(jìn)一步的頻率銳化，即所謂“第二濾波器”。點(diǎn)測量法僅測量基底膜上某一點(diǎn)的振動(dòng)，耳蝸損傷較小，是目前耳蝸力學(xué)研究的主流方法。二十世紀(jì)七十年代發(fā)展的莫斯鮑爾技術(shù)(M?ssbauer technique)是第一個(gè)應(yīng)用于基底膜測量的高精度、高靈敏度的技術(shù)手段。利用該技術(shù)Rhode發(fā)現(xiàn)基底膜振動(dòng)具有壓縮非線性，該發(fā)現(xiàn)啟示并引領(lǐng)了耳蝸主動(dòng)機(jī)制研究。上世紀(jì)八十至九十年代，激光多普勒測振儀(laser doppler vibrometer，LDV)以其非接觸式測量、高精度和高空間分辨率的優(yōu)點(diǎn)，加之商業(yè)化LDV的廣泛應(yīng)用，成為中、內(nèi)耳力學(xué)研究的最重要測量技術(shù)之一。但是，應(yīng)用LDV進(jìn)行行波測量需要在耳蝸骨壁鉆孔以暴露基底膜，仍會(huì)影響耳蝸正常生理活動(dòng)，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。盡管LDV可實(shí)現(xiàn)耳蝸蝸底高頻區(qū)基底膜振動(dòng)測量，但對(duì)于蝸頂?shù)皖l區(qū)的測量存在困難。近年來體積相干光斷層掃描測振技術(shù)(volumetric optical coherence tomography vibrometry，VOCTV，也稱相敏OCT，phase-sensitive OCT)以其高空間分辨率、穿透式測量的優(yōu)點(diǎn)，可部分彌補(bǔ)上述技術(shù)的不足，尤其是在耳蝸低頻區(qū)測振、Corti器微觀結(jié)構(gòu)振動(dòng)測量方面取得突破性進(jìn)展[2～4]。

本文闡述自Békésy以來，耳蝸力學(xué)領(lǐng)域行波測量技術(shù)的沿革、各自優(yōu)缺點(diǎn)及主要研究成果。這些技術(shù)和成果推動(dòng)了行波理論的不斷完善，即對(duì)耳蝸感音力學(xué)機(jī)制的深入理解。如何開發(fā)和應(yīng)用新技術(shù)進(jìn)一步揭示耳蝸高效感音的機(jī)制，這些新技術(shù)及成果又如何應(yīng)用于臨床實(shí)踐，是未來耳蝸力學(xué)研究的兩大主題。

1 莫斯鮑爾技術(shù)

莫斯鮑爾技術(shù)應(yīng)用原子核輻射的γ射線無反沖共振吸收的莫斯鮑爾效應(yīng)。原子核共振過程受能量調(diào)節(jié)，震源運(yùn)動(dòng)能引起可檢測的多普勒頻移。利用該效應(yīng)可實(shí)現(xiàn)高精度的振動(dòng)測量。

Rhode(1971)成功利用莫斯鮑爾測振技術(shù)在活體松鼠猴耳蝸中觀察到基底膜振動(dòng)具有壓縮非線性特性。Sellick(1982)及Le Page(1980)等在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)基底膜具有尖銳的調(diào)諧反應(yīng)，該反應(yīng)與聽神經(jīng)反應(yīng)一致，與Békésy測量結(jié)果不同。綜合Kemp(1978)發(fā)現(xiàn)的耳聲發(fā)射現(xiàn)象，否定了第二濾波器假說，證明“耳蝸主動(dòng)機(jī)制”的存在，是耳蝸力學(xué)研究的又一里程碑式突破。

然而莫斯鮑爾技術(shù)具有一定的局限性，如：①測量需在基底膜上放置放射源，改變基底膜質(zhì)量，造成基底膜損傷，導(dǎo)致測試時(shí)間窗較窄，影響測試結(jié)果; ②γ射線具有極強(qiáng)的非線性，在測量過程中會(huì)對(duì)基底膜振動(dòng)的諧波成分造成數(shù)據(jù)干擾; ③測量時(shí)需要使用放射物質(zhì)，難以推廣應(yīng)用。隨后莫斯鮑爾技術(shù)被基于干涉原理的激光多普勒測振技術(shù)取代。

2 激光多普勒測振技術(shù)

激光多普勒測振(LDV)技術(shù)應(yīng)用了光學(xué)多普勒效應(yīng)和光束干涉原理。由于激光具有良好的線性特性及對(duì)微小速度變化的高度敏感性，LDV成為耳力學(xué)研究的又一理想技術(shù)，其測量精度可達(dá)到納米級(jí)。由于中、內(nèi)耳結(jié)構(gòu)微小、復(fù)雜，在振動(dòng)測量研究中，LDV常需與聲激勵(lì)系統(tǒng)、隔振臺(tái)及解剖顯微鏡耦合使用。

Tonndorf和Khanna(1968)利用LDV技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)鼓膜振動(dòng)的測量。但受激光質(zhì)量、光學(xué)元件的制造工藝和信號(hào)處理等因素的影響，早期LDV無法進(jìn)行耳蝸基底膜振動(dòng)的精確測量。1982年Khanna對(duì)激光光源進(jìn)行改進(jìn)，設(shè)計(jì)了激光零差測振系統(tǒng)，首次實(shí)現(xiàn)LDV基底膜振動(dòng)的測量。

大部分基于LDV的行波振動(dòng)測量部位多局限于基底膜高頻區(qū)?？傮w而言，不同物種耳蝸高頻區(qū)基底膜響應(yīng)規(guī)律相似，即壓縮非線性特征在最佳頻率處顯著，其余位置呈線性，再一次證明基底膜響應(yīng)具有極精細(xì)的頻率選擇性。利用LDV對(duì)蝸頂?shù)皖l區(qū)基底膜振動(dòng)測量較為困難，有限的研究結(jié)果提示低頻區(qū)基底膜壓縮非線性特性可能不如高頻區(qū)敏銳。但進(jìn)行低頻區(qū)基底膜振動(dòng)測量時(shí)需要對(duì)前庭膜開孔，導(dǎo)致內(nèi)外淋巴液混合，破壞耳蝸正常生理環(huán)境，對(duì)毛細(xì)胞功能造成影響。而Khanna(1989)通過研究外毛細(xì)胞受損時(shí)基底膜調(diào)諧變化，證明正常活性的外毛細(xì)胞是耳蝸實(shí)現(xiàn)頻率分離的基礎(chǔ)，因此低頻區(qū)耳蝸響應(yīng)的LDV測量結(jié)果不足以反映正常生理狀態(tài)下的基底膜調(diào)諧規(guī)律。

除對(duì)基底膜響應(yīng)的壓縮非線性特征進(jìn)一步探究外，利用LDV還可對(duì)蝸隔各部分的振動(dòng)形式分別進(jìn)行測量。由于Corti器坐落于基底膜上，在耳蝸力學(xué)研究中兩者密不可分，有時(shí)將它們視為整體，統(tǒng)稱為蝸隔(cochlear partition)。蝸隔的振動(dòng)極為復(fù)雜，以徑向?yàn)橹?，在Corti器附近振動(dòng)方向垂直網(wǎng)狀板。Hensen細(xì)胞區(qū)振幅最大，但相位稍滯后于外毛細(xì)胞區(qū)。Greenwood(1996)對(duì)不同物種耳蝸各回基底膜振動(dòng)進(jìn)行測量，通過對(duì)比低、中、高頻區(qū)基底膜振動(dòng)特點(diǎn)，總結(jié)基底膜長度和特征頻率對(duì)數(shù)的線性關(guān)系，對(duì)兩棲類、哺乳類動(dòng)物擁有超寬聽覺動(dòng)態(tài)范圍(強(qiáng)度/頻率)的機(jī)制進(jìn)行探究，通過分析哺乳類動(dòng)物聽覺演化過程中耳蝸聲音頻率分析功能逐漸加強(qiáng)的原因，更進(jìn)一步的明確了頻率辨別的部位機(jī)制及毛細(xì)胞在其中所起的重要作用。

由于LDV為10～20 dB SPL聲刺激下基底膜響應(yīng)的測量提供可能，關(guān)于耳蝸主動(dòng)機(jī)制的研究取得新的突破性認(rèn)識(shí)，即證偽“逆向行波學(xué)說”。既往學(xué)者多認(rèn)為耳聲發(fā)射現(xiàn)象源于基底膜的逆向行波，2004年Ren(任田英)對(duì)于耳聲發(fā)射現(xiàn)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測量，實(shí)驗(yàn)中僅觀測到基底膜的順向行波，據(jù)此否定了逆向行波假說；盡管目前學(xué)界對(duì)此結(jié)果仍存有爭議，由于Ren在研究中觀察到鐙骨提前振動(dòng)的現(xiàn)象，據(jù)此Ren提出耳聲發(fā)射的主要途徑是耳蝸液體中的壓力波。此外，有學(xué)者對(duì)LDV進(jìn)行技術(shù)改良，如Cooper(1999)改進(jìn)了反射光與入射光分離的技術(shù)；Jacob(2009)將LDV與激光掃描共聚焦顯微鏡的耦合，為耳蝸微機(jī)械力學(xué)的研究提供更好的穩(wěn)定性和可操作性。

同樣，LDV技術(shù)也存在某些不足，如測量時(shí)必須在耳蝸骨壁上開孔(約0.2 mm)以暴露待測基底膜，因此需要使用玻璃片封閉窗口等方法減少內(nèi)外淋巴液的流失，即便如此耳蝸開孔仍會(huì)造成內(nèi)外淋巴液混合和毛細(xì)胞損傷[5]，影響測量結(jié)果，限制了內(nèi)耳病理狀態(tài)下基底膜振動(dòng)的研究。

3 體積相干光斷層掃描技術(shù)

體積相干光斷層掃描測振技術(shù)(VOCTV)是OCT的改進(jìn)。OCT應(yīng)用寬帶光的干涉現(xiàn)象進(jìn)行成像，通過測量光束發(fā)射至反射的延擱時(shí)間來定位光的反射深度，使不同深度組織結(jié)構(gòu)在圖像上進(jìn)行映射和解析(Ren,2001)。臨床上OCT已廣泛用于多種器官如眼球、冠狀動(dòng)脈、支氣管、食管和皮膚的無創(chuàng)及微創(chuàng)診斷成像[6,7]。因OCT可清晰地對(duì)耳蝸各亞顯微結(jié)構(gòu)如蓋膜、前庭膜及Corti器進(jìn)行成像和觀測[2,3,8]，滿足對(duì)耳蝸基底膜各結(jié)構(gòu)振動(dòng)的空間特征和行波的進(jìn)一步研究需要，參考LDV測振原理，經(jīng)改良探測光束、數(shù)據(jù)采集設(shè)計(jì)及運(yùn)算方法，制成具有多普勒測振功能的VOCTV，可對(duì)耳蝸基底膜的振動(dòng)進(jìn)行穿透式、非接觸的無創(chuàng)測量。

Choudhury于2006年首次成功利用VOCTV對(duì)開放的豚鼠耳蝸基底膜振動(dòng)進(jìn)行測量。同年Hong(2006)及其團(tuán)隊(duì)亦報(bào)道利用VOCTV實(shí)現(xiàn)離體耳蝸基底膜、蓋膜、前庭膜及外毛細(xì)胞的振動(dòng)測量。早期的VOCTV測振研究受信噪比及穿透深度限制，實(shí)驗(yàn)對(duì)象以離體耳蝸為主，后經(jīng)儀器改進(jìn)，在體耳蝸基底膜振動(dòng)的測量研究逐漸開展。VOCTV技術(shù)使在保持耳蝸完整狀態(tài)下對(duì)基底膜振動(dòng)的測量成為可能，消除了此前耳蝸開窗術(shù)對(duì)基底膜功能和狀態(tài)的影響，成為耳蝸力學(xué)研究技術(shù)的一個(gè)重要突破[5]。利用VOCTV對(duì)耳蝸低頻區(qū)基底膜振動(dòng)測量的研究結(jié)果提示嚙齒類動(dòng)物耳蝸低頻區(qū)壓縮非線性程度較低，具有低通特性，頻率選擇性不如高頻區(qū)敏銳[9～12]。此外，VOCTV的分辨率滿足了對(duì)耳蝸各亞顯微結(jié)構(gòu)相對(duì)運(yùn)動(dòng)觀測的需要，實(shí)現(xiàn)了對(duì)各結(jié)構(gòu)間聲波傳遞規(guī)律的探索，如蓋膜行波現(xiàn)象的觀測、蓋膜與前庭膜間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)[3,8]、網(wǎng)狀板和基底膜間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)，揭示Corti器的濾波原理和耳蝸主動(dòng)機(jī)制[8,13,14]，進(jìn)一步證實(shí)外毛細(xì)胞在其中所起的重要作用[15]。為探究各結(jié)構(gòu)三維空間上的運(yùn)動(dòng)特性，Lee等團(tuán)隊(duì)利用基因敲除技術(shù)制造前庭膜、蓋膜及外毛細(xì)胞纖毛連接松解的模型小鼠，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Corti器及前庭膜軸向運(yùn)動(dòng)的測量[3]。

由于VOCTV測量保持耳蝸的完整性，使內(nèi)耳病理狀態(tài)下基底膜振動(dòng)測量成為可能，對(duì)于內(nèi)耳病理狀況的評(píng)估具有重要的應(yīng)用前景。Xia(2018)通過基因敲除技術(shù)制造第三列外毛細(xì)胞缺失小鼠，對(duì)該病理狀態(tài)下Corti器振動(dòng)方式進(jìn)行探究，證實(shí)了VOCTV技術(shù)在耳蝸病理機(jī)制探究中的重大潛力。

VOCTV技術(shù)的主要不足是穿透深度有限，這限制了VOCTV在耳蝸力學(xué)振動(dòng)測量領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。VOCTV的成像空間分辨率和穿透深度相互制約，如橫向分辨率為10 μm時(shí)(小鼠Corti器高度約100 μm)，最新的VOCTV穿透深度僅為1.5 mm(表1歸納了目前研究中常用的VOCTV儀器型號(hào)、穿透深度及分辨率)。因此，VOCTV在體基底膜測振的實(shí)驗(yàn)對(duì)象多為耳蝸骨質(zhì)較薄的嚙齒類動(dòng)物[3,4,8～11]，且需耦合使用如轉(zhuǎn)角鏡等一些輔助機(jī)械[16]。目前，VOCTV技術(shù)仍在不斷改進(jìn)發(fā)展中，其分辨率和穿透深度都有望進(jìn)一步提高。

表1 研究中常用的VOCTV儀器基本參數(shù)

4 展望

自Békésy提出行波理論獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎(jiǎng)(1961年)以來，隨高精度測量技術(shù)的發(fā)展，研究者對(duì)耳蝸的機(jī)械特性及主動(dòng)增益有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，LDV與VOCTV在內(nèi)耳力學(xué)振動(dòng)測量領(lǐng)域中的應(yīng)用更成功地對(duì)生理狀態(tài)下耳蝸感音機(jī)制進(jìn)行深入解析，有望在未來實(shí)現(xiàn)病理狀態(tài)下耳蝸響應(yīng)的研究，協(xié)助臨床明確內(nèi)耳疾病的病理機(jī)制，啟發(fā)新的診斷技術(shù)研發(fā)。未來仍然需要對(duì)基底膜行波現(xiàn)象的高精度和高空間分辨率測量、對(duì)Corti器亞顯微結(jié)構(gòu)的相互作用與影響等進(jìn)行分析。①Corti器的三維振動(dòng)測量。Corti器的復(fù)雜三維運(yùn)動(dòng)的測量有助于對(duì)比分析Corti器各部分振動(dòng)響應(yīng)差異，探究毛細(xì)胞在耳蝸頻率辨別中所起的作用。進(jìn)行Corti器三維運(yùn)動(dòng)的觀測需對(duì)基底膜各部分結(jié)構(gòu)進(jìn)行較清晰的成像，以便在圖像中進(jìn)行辨認(rèn)，因此對(duì)VOCTV的分辨率要求較高?，F(xiàn)有的VOCTV不能滿足測量需要，需對(duì)測量儀器進(jìn)行改進(jìn)與完善，目前，對(duì)Corti器的三維運(yùn)動(dòng)觀測尚處于起步階段[19]。②纖毛-蓋膜兩者間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)。蓋膜下液體的流動(dòng)時(shí)可形成剪切力，刺激外毛細(xì)胞纖毛，引起耳蝸內(nèi)力-電信號(hào)的轉(zhuǎn)換。外毛細(xì)胞電致運(yùn)動(dòng)是耳蝸主動(dòng)機(jī)制的關(guān)鍵。但對(duì)于三排外毛細(xì)胞所司功能差異、聲刺激引起外毛細(xì)胞活化的具體機(jī)制及蓋膜在耳蝸主動(dòng)放大功能中所起到的作用尚待進(jìn)一步探討[20～23]，以建立內(nèi)耳疾病中外毛細(xì)胞纖毛的損傷情況和聽力損失程度二者間的聯(lián)系，對(duì)聽力損失進(jìn)行詳細(xì)分類，使患者可以接受更有針對(duì)性的治療，恢復(fù)或保留殘存聽力，改善疾病預(yù)后。但目前尚無可以進(jìn)行上述研究的有效手段，有賴于未來新型測量儀器的開發(fā)。