堿基編輯技術(shù)的新進(jìn)展及在耳蝸中的應(yīng)用前景

潘豪來(lái) 倪麗艷 陳波蓓

大多數(shù)感音神經(jīng)性聾與基因突變相關(guān)(Morton等，2006)， 基因靶向治療似乎是一種更精確的治療方式。CrispR/cas9系統(tǒng)已經(jīng)超越鋅指或TALLEN成為基因編輯首選[1]，但是會(huì)切除引導(dǎo)RNA配對(duì)的雙鏈基因序列，剪切產(chǎn)生的雙鏈DNA粘性斷端誘導(dǎo)被編輯的細(xì)胞啟動(dòng)基因修復(fù)程序來(lái)修補(bǔ)這一缺損。然而諸如非同源斷端連接或者同源基因引導(dǎo)修復(fù)均不能完美地將單堿基突變序列修復(fù)為野生型序列[2～5]。近年研究通過(guò)改進(jìn)CrispR/Cas9技術(shù)，即在Cas9酶的基礎(chǔ)上，融合1個(gè)堿基脫氨酶基團(tuán)并降低Cas9酶中剪切酶的活性，研發(fā)一種酶可以人為誘導(dǎo)單個(gè)突變基因復(fù)原而不切除DNA雙鏈，該項(xiàng)研究技術(shù)即為堿基編輯(base editing)[6]。腺苷酸堿基編輯酶(adenosine base-editing enzyme, ABE)和胞嘧啶堿基編輯酶(cytidine base-editing enzyme, CBE)是其代表，它們分別誘導(dǎo)A-T序列轉(zhuǎn)化為G-C和C-G轉(zhuǎn)化為T(mén)-A。堿基編輯能最大程度減小對(duì)目標(biāo)堿基周?chē)蛄械膿p傷，其產(chǎn)物大多數(shù)情況下都可預(yù)測(cè)，因此它是治療以單堿基突變且常染色體隱性遺傳為主的遺傳性感音神經(jīng)性聾的合適措施。

理論上ABE和CBE能治愈超過(guò)60%的人類(lèi)致病基因[7]。但在實(shí)際應(yīng)用中，總會(huì)有非目標(biāo)靶點(diǎn)的堿基修飾發(fā)生，即初代堿基編輯酶會(huì)無(wú)差別編輯前間區(qū)序列(protospacer)中約為4～5個(gè)堿基寬度的編輯窗口內(nèi)的任意相鄰腺苷酸或胞嘧啶脫氧核糖核酸[8,9]。因此，初代酶只能應(yīng)用于前間區(qū)序列中僅有一個(gè)腺苷酸或胞嘧啶脫氧核糖核酸的情況。但大多數(shù)人類(lèi)先天性感音神經(jīng)聾致病基因中，都有數(shù)個(gè)腺苷酸或胞嘧啶脫氧核糖核酸位于前間隔序列編輯窗內(nèi)。研究報(bào)道編輯非目標(biāo)位點(diǎn)的堿基可能引起宿主破壞性的結(jié)果[10]。同時(shí)，堿基編輯需要目標(biāo)序列周?chē)嬖谇伴g隔序列臨近序列(protospacer adjacent motif， PAM)。以初代CBE為例，若目標(biāo)靶點(diǎn)周?chē)鷽](méi)有序列為NGG的PAM，其編輯效率將極低。

提高堿基編輯的生物活性也是一大難題。目前不存在能完全糾正靶點(diǎn)的堿基編輯酶，且存在某一特定堿基編輯酶變體可能在某個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)活性較高，但是在另一位點(diǎn)作用時(shí)活性相對(duì)下降的情況。因此，對(duì)于堿基編輯酶的進(jìn)一步研發(fā)升級(jí)，提高堿基編輯酶的精確性及生物活性是該項(xiàng)研究的主攻方向。本綜述旨在介紹近期關(guān)于提高堿基編輯的準(zhǔn)確性及效率的相關(guān)進(jìn)展；同時(shí)由于耳蝸是一個(gè)相對(duì)孤立、與周?chē)M織關(guān)聯(lián)較少的器官；耳蝸?zhàn)⑸浠蚓庉嬈饕苍缫颜归_(kāi)研究，本文將對(duì)堿基編輯在耳蝸基因突變疾病治療中的應(yīng)用前景展開(kāi)綜述。

1 最新進(jìn)展

1.1噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化器(phage-assisted continuous evolution, PACE) PACE最早應(yīng)用于進(jìn)化CrispR/Cas9體系，近期科學(xué)家們嘗試將其應(yīng)用于堿基編輯，即攜帶副質(zhì)粒(accessory plasmid, AP)的大腸桿菌排列成隊(duì)持續(xù)通過(guò)裝有攜帶選擇質(zhì)粒(selection plasmid, SP)噬菌體的容器。SP中攜帶被需要的堿基編輯原件，只有噬菌體成功轉(zhuǎn)染大腸桿菌，即SP轉(zhuǎn)染AP，才能引起AP發(fā)生堿基突變，進(jìn)而誘導(dǎo)宿主大腸桿菌增殖速度加快。被成功轉(zhuǎn)染的大腸桿菌增殖速度大于大腸桿菌通過(guò)容器的速度從而被保留在容器中，幾個(gè)周期后，容器中留下被純化的轉(zhuǎn)染后大腸桿菌[10]，其生產(chǎn)的堿基編輯酶能較完美地在后續(xù)特定堿基編輯條件下發(fā)揮作用。通過(guò)人工干預(yù)PACE的轉(zhuǎn)染條件，不僅可提高堿基編輯的生物活性，還能擴(kuò)充Cas9的應(yīng)用范圍，例如應(yīng)用PACE技術(shù)產(chǎn)生的xCas9可識(shí)別的PAM不僅僅是NGG，其還能識(shí)別NG、GAA、GAT[11]，從原理上來(lái)說(shuō)，不能再限制堿基編輯的應(yīng)用范圍。

在實(shí)際堿基編輯應(yīng)用中，初代CBE的亞型APOBEC1在目標(biāo)位點(diǎn)為T(mén)C時(shí)，編輯效率明顯高于其他情況[8,12]。而通過(guò)PACE改造，善于編輯GC序列的編輯器得以誕生[10]。因此，可以預(yù)見(jiàn)今后堿基編輯技術(shù)的進(jìn)一步改進(jìn)升級(jí)將越來(lái)越依賴(lài)于強(qiáng)大的PACE技術(shù)。且PACE對(duì)實(shí)驗(yàn)室硬件要求低，未來(lái)若成功研發(fā)PACE商業(yè)試劑盒，將進(jìn)一步簡(jiǎn)化并推廣該技術(shù)。

1.2化學(xué)修飾 不同于PACE技術(shù)，人工干預(yù)直接修飾堿基編輯酶的氨基酸組成或蛋白結(jié)構(gòu)同樣能縮窄堿基編輯窗口或者提高編輯酶活性[12～14]。針對(duì)這一目的，近期研究嘗試將一段富含脯氨酸的片段植入APOBEC1和nCas9之間[15](APOBEC1和CDA1均為編輯酶中負(fù)責(zé)堿基脫氨的基團(tuán))，這一操作能縮短兩個(gè)基團(tuán)之間的空間距離，從而使APOBEC1能更精確地綁定前間隔序列中的目標(biāo)胞嘧啶[16]。然而相同策略應(yīng)用于CDA1-BE卻不能使編輯精確性提高。通過(guò)后期蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，在CDA1與nCas9基團(tuán)之間存在一個(gè)核蛋白輸出信號(hào)序列，該序列對(duì)堿基編輯毫無(wú)作用。據(jù)此，完全去除分割CDA1和nCas9之間的連接序列，CDA1的生物活性和編輯精確性均得到了提高(Patenaude等，2009)。

堿基編輯基團(tuán)與nCas9基團(tuán)之間的連接順序也對(duì)堿基編輯系統(tǒng)的編輯效率產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，將APOBEC1基團(tuán)綁定在nCas9基團(tuán)的N端時(shí)，整個(gè)堿基編輯系統(tǒng)的編輯效率大大提高。但是CDA1無(wú)論綁定在nCas9的C端或者N端，其編輯效率并無(wú)顯著差異[15,16]。

堿基編輯酶誘導(dǎo)非目標(biāo)tRNA序列突變是臨床應(yīng)用前需要攻克的一大難題[17,18]。它引起tRNA突變的可能原因在于ABE中的核苷酸脫氨酶基團(tuán)是一個(gè)異質(zhì)二聚體，由野生型tRNA脫氨酶單體與修飾后tRNA脫氨酶單體組成[19]，前者的同質(zhì)二聚體是自然界本就存在的tRNA編輯酶，因此該野生型單體可能攜帶tRNA編輯酶屬性(Losey等，2006)，tRNA突變將引起腫瘤、自身免疫病等一系列惡性疾病[20～23]。該野生型單體主要起結(jié)構(gòu)性作用，在堿基編輯過(guò)程中并不發(fā)揮生物活性，通過(guò)RNA序列分析發(fā)現(xiàn)，該單體的RNA綁定序列為CUACGAA[24]，因此，去除該野生型單體成為降低堿基編輯酶編輯非目標(biāo)tRNA概率的研究方向，但是單純?nèi)コ撘吧蛦误w引起ABE編輯效率大大降低。通過(guò)蛋白序列分析，科學(xué)家們嘗試修改個(gè)別野生型單體或突變型單體的氨基酸序列[25,26]，這樣確實(shí)減少了非目標(biāo)tRNA編輯，但目標(biāo)位點(diǎn)DNA編輯效率也有不同程度的降低(Losey等，2006)， 因此這類(lèi)ABE亞型應(yīng)謹(jǐn)慎用于要求非目標(biāo)tRNA編輯效率很低的情況。

也有報(bào)道將BE系統(tǒng)作為核糖蛋白微粒導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，其編輯效率低于將BE包裝進(jìn)質(zhì)粒系統(tǒng)后再導(dǎo)入[27]，這可能是前者直接將可翻譯成BE酶的mRNA暴露于宿主細(xì)胞，進(jìn)而啟動(dòng)了宿主細(xì)胞清除異體mRNA的程序。因此有人嘗試將此mRNA中的尿嘧啶進(jìn)行5端甲基修飾，修飾后的BE-mRNA可不引起宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而達(dá)到令人滿(mǎn)意的編輯效果[28]。

蛋白修飾雖然效果更直接，但是其操作需要較扎實(shí)的生物化學(xué)知識(shí)基礎(chǔ)，化學(xué)修飾方法多樣(甲基化、蛋白融合、氨基酸替換等)，沒(méi)有統(tǒng)一的方法可以遵循，其最終產(chǎn)物是否符合預(yù)期，仍需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。但是在PACE無(wú)法產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，化學(xué)修飾不失為一個(gè)可行的備選。

1.3將BE與其他物種的Cas9融合 BE系統(tǒng)識(shí)別PAM特異性主要依賴(lài)于nCas9基團(tuán)，不同于傳統(tǒng)的源于化膿性鏈球菌的Cas9，葡萄球菌來(lái)源的Cas9識(shí)別的PAM序列為NNGRRT。因此在目標(biāo)序列周?chē)鷽](méi)有NGG-PAM而存在其他菌屬Cas9可識(shí)別的PAM時(shí)，將BE酶與該菌屬Cas9融合不失為一種高效的策略。但這種載體的攜帶能力有限：腺相關(guān)病毒攜帶能力約為4.5 kb；化膿性鏈球菌Cas9大小約為4.2 kb，這幾乎已占滿(mǎn)載體的可用空間；葡萄球菌Cas9僅有3 kb大小，剩余充分的可用空間有利于后續(xù)蛋白修飾進(jìn)一步提高蛋白活性，融合葡萄球菌Cas9的BE編輯效率與傳統(tǒng)BE相當(dāng)[29～31]。據(jù)此原理，嗜熱鏈球菌Cas9、腸彎曲桿菌Cas9、腦膜炎奈瑟菌Cas9也相繼問(wèn)世，從而拓寬了基因編輯的應(yīng)用范圍[32～34]。

準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)，該方法屬于蛋白修飾的一個(gè)分支。但是其操作流程相對(duì)固定，且理論體系也較簡(jiǎn)單。但是目前市面上并無(wú)除化膿性鏈球菌Cas9-BE以外的其他菌屬來(lái)源的BE。其后續(xù)是否會(huì)大規(guī)模生產(chǎn)取決于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)?zāi)芊耱?yàn)證這些菌屬來(lái)源的BE具有相同可靠的堿基編輯效力。

2 堿基編輯在耳蝸中的初期應(yīng)用

基因突變是引起先天性感音神經(jīng)性聾的主要病因之一。由于掌管聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)的感覺(jué)細(xì)胞被包裹于顳骨的骨迷路中，因此耳蝸局部注射的基因編輯制劑能局限于骨迷路中。既往有大量報(bào)道應(yīng)用耳蝸?zhàn)⑸湔{(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或者凋亡因子表達(dá)水平的基因制劑的研究，但這些制劑并不針對(duì)原發(fā)的基因突變。而對(duì)于針對(duì)突變基因的Crispr/Cas9基因修飾，由于其后續(xù)依賴(lài)的同源基因修復(fù)需要宿主細(xì)胞處于有絲分裂間期，而毛細(xì)胞或螺旋神經(jīng)元均為永久細(xì)胞，不再發(fā)生有絲分裂，因此該方法在糾正耳蝸基因突變方面相當(dāng)?shù)托5]。而且由于常染色體隱性遺傳占耳聾相關(guān)基因疾病的多數(shù)(75%～80%)，單純切除突變基因而沒(méi)有正常等位基因代償并不能有效糾正耳聾表型[35]。因此堿基編輯可能是目前攻克耳蝸基因突變疾病的武器，它能像Crispr/Cas9系統(tǒng)一樣精準(zhǔn)錨定目標(biāo)序列，同時(shí)在不引起雙鏈斷裂前提下使突變堿基復(fù)原。近期已經(jīng)有早期基礎(chǔ)研究嘗試將堿基編輯應(yīng)用于耳蝸相關(guān)實(shí)驗(yàn)中?？茖W(xué)家們嘗試應(yīng)用CBE在耳蝸特異表達(dá)vGlut3、Otoferlin和Prestin蛋白的外顯子中導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄終止密碼子，從而阻斷毛細(xì)胞特異蛋白表達(dá)，并最終分別成功構(gòu)建耳蝸毛細(xì)胞退化模型[36]。 另一項(xiàng)研究應(yīng)用堿基編輯技術(shù)在Wnt通路相關(guān)蛋白序列中導(dǎo)入S33F突變、從而引起Wnt通路上調(diào)，進(jìn)而成功誘導(dǎo)支持細(xì)胞向毛細(xì)胞異生[37]。耳蝸堿基編輯的初期研究結(jié)果令人滿(mǎn)意，未來(lái)基于臨床耳聾治療的相關(guān)研究將進(jìn)一步揭示堿基編輯的治療潛力。

3 展望

隨著新型堿基編輯酶變體不斷被研發(fā)，在針對(duì)不同特定情況時(shí)，堿基編輯酶的選擇也越來(lái)越多。針對(duì)不同情況的堿基編輯酶變體的不斷增加，制定一套統(tǒng)一的堿基編輯酶使用指南越來(lái)越有必要，依此簡(jiǎn)化并進(jìn)一步推廣堿基編輯的臨床應(yīng)用。

在耳蝸中的應(yīng)用方面，盡管目前沒(méi)有明確證據(jù)證明堿基編輯能有效治愈先天性感音神經(jīng)性聾，但是理論上來(lái)講，堿基編輯能有效治療耳聾基因病，主要理論依據(jù)有：①耳聾基因病中主要的突變類(lèi)型為常染色體隱性遺傳，等位基因上均為突變型，不存在正常模板序列，因此不需要依賴(lài)野生型模板，直接對(duì)該突變位點(diǎn)進(jìn)行編輯；②堿基編輯酶在不引起DNA雙鏈斷裂的基礎(chǔ)上對(duì)目標(biāo)堿基進(jìn)行編輯，從而最大程度上減少了對(duì)本來(lái)正常序列DNA的破壞，避免副產(chǎn)物的產(chǎn)生；③堿基編輯不依賴(lài)于DNA修復(fù)能力，后者在諸如毛細(xì)胞等高分化細(xì)胞中活性很低。同時(shí)，耳蝸局部注射基因制劑能有效降低基因制劑作用于其他器官?gòu)亩a(chǎn)生副作用的可能性。在目前有限的耳蝸堿基編輯技術(shù)應(yīng)用中，核糖核蛋白作為轉(zhuǎn)運(yùn)載體的優(yōu)先度高于腺相關(guān)病毒，因?yàn)榍罢呖捎行П苊獠槐匾耐庠碊NA雜交進(jìn)入宿主基因組[37,38]，而且此方法可明顯降低非目標(biāo)堿基編輯效率[38]。因此，近期針對(duì)提高堿基編輯系統(tǒng)精確性及生物活性的研究可能讓堿基編輯技術(shù)為耳蝸病變的治療帶來(lái)良好的效果。