FSH 對缺血缺氧誘導的小鼠卵巢顆粒細胞凋亡的保護作用

王 菲， 田 媛， 郝 耀， 劉心蕊， 張淑雅， 楊延周， 裴承斌， 王燕蓉， 裴秀英

（寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，生育力保持教育部重點實驗室，寧夏生殖與遺傳重點實驗室，銀川 750004）

目前癌癥診療手段已進入逐步穩(wěn)定的狀態(tài)，但由于放化療導致的卵巢早衰、卵泡激活障礙等卵巢不可逆損傷問題仍然存在[1]。近年來，卵巢凍存及移植作為保存癌癥患者生育力的一種方法，被廣泛應用于腫瘤生殖領域[2]。而凍存卵巢無血管吻合移植術后的缺血缺氧，是移植失敗的主要原因。移植后缺血再灌注將導致卵泡丟失[3]、卵巢顆粒細胞凋亡[4-5]、卵巢血管嚴重受損[6-7]；且移植早期的缺氧及隨后的復氧[8]，使得細胞內(nèi)活性氧（ROS）增加，過量的ROS 產(chǎn)生可誘導蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA 修飾，從而導致細胞損傷[9]。促卵泡刺激素（FSH）在卵泡發(fā)育和顆粒細胞增殖中發(fā)揮重要作用[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，在卵巢凍存過程中添加FSH 能夠提高移植卵巢存活率，抑制缺血缺氧導致的細胞凋亡，增強移植物血流重建。而在缺氧誘導的卵巢顆粒細胞中，F(xiàn)SH 干預可通過上調(diào)缺氧誘導因子（HIF-1α）的表達，進而誘導顆粒細胞自噬，這對顆粒細胞的增殖和卵泡發(fā)育具有保護作用[12]。本研究以小鼠卵巢顆粒細胞為研究對象，在細胞層面模擬卵巢移植早期缺血缺氧狀態(tài)，探討FSH 對缺血缺氧誘導的卵巢顆粒細胞凋亡的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物 選取70 只21 日齡清潔級雌性ICR 小鼠為研究對象，小鼠購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心［許可證號：SCXK（寧）2020-0001］，光照時間周期為12 h 照明/12 h 黑暗，動物室溫度保持在（24±2）℃，濕度保持在40%～50%，定期更換鼠籠、水糧、墊料并消毒。

1.1.2 主要試劑 注射用重組人促卵泡刺激素（BA060658，德國Merck 公司），注射孕馬血清（PMSG，B210125，寧波三生生物科技有限公司），Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒（BB-4101-100T，上海貝博生物科技有限公司），TUNEL 檢測試劑盒（A113-02，南京諾唯贊生物科技有限公司），HE 染色試劑盒（G1121，北京索萊寶科技有限公司），F(xiàn)SHR 兔多克隆抗體（bs-0895R，北京博奧森生物技術有限公司），β-actin兔多克隆抗體（bs-0061R，北京博奧森生物技術有限公司），Bcl-2兔多克隆抗體（Ab-AF6139，江蘇親科生物研究中心有限公司），Bax 兔多克隆抗體（2772，美國CST 公司），F(xiàn)ITC 標記山羊抗兔IgG（ZF-0311，北京中杉金橋生物技術有限公司），辣根酶標記山羊抗兔IgG（ZB-2301，北京中杉金橋生物技術有限公司），DMEM-F12 培養(yǎng)基（SH30023.01，HyClone 公司），胎牛血清（1925624，BI 公司），DAPI 溶液（C0065，北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代卵巢顆粒細胞的分離培養(yǎng)及鑒定 10只21 日齡雌性ICR 小鼠，每只腹腔注射PMSG 10 IU·mL-1，42 h 后脫頸處死小鼠，在無菌環(huán)境下迅速剝離卵巢并放入PBS 緩沖液中，用PBS清洗3 次以后置于DMEM/F12（含10%胎牛血清+1%青鏈霉素）培養(yǎng)液中，在體視鏡下，用1 mL 注射器針頭固定并刺破卵巢表面的次級卵泡，使顆粒細胞釋放于DMEM/F12 培養(yǎng)液中。將含有顆粒細胞的培養(yǎng)液用200 目的細胞篩過濾，濾液以1 000 r·min-1于4 ℃離心5 min 后棄上清，加入新的培養(yǎng)基吹打混勻，按1.2×106個/mL 接種于6 孔板中，置于37 ℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)24 h，鏡下觀察是否污染及細胞的生長情況，去除未貼壁細胞，此后隔日換液1 次。細胞長至60%～70%時HE 染色觀察細胞形態(tài)，用FSHR 細胞免疫熒光染色鑒定所分離的顆粒細胞的純度，細胞純度=陽性細胞數(shù)量/計數(shù)細胞總數(shù)×100%，純度達到90%以上進行后續(xù)實驗。

1.2.2 實驗分組 將60 只21 日齡ICR 雌鼠分離培養(yǎng)的顆粒細胞分為6 組。對照組：正常培養(yǎng)的顆粒細胞；單純?nèi)毖毖踅M：顆粒細胞正常培養(yǎng)48 h 后，換成無血清培養(yǎng)基并置于缺氧培養(yǎng)箱（94%N2+5%CO2+1%O2）中培養(yǎng)24 h；缺血缺氧FSH 干預組：顆粒細胞正常培養(yǎng)48 h 后，換成無血清培養(yǎng)基并添加不同濃度的FSH（0.1、0.2、0.4、0.6 IU·mL-1），置于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 細胞免疫熒光 將細胞懸液接種在含有細胞爬片的24 孔板中，待其生長至60%～70%，棄去培養(yǎng)液，PBS 洗3 次，3 min/次；4%多聚甲醛室 溫 固 定15 min，PBS 洗3 次，3 min/次；0.1%Triton X-100 室溫通透3 min，PBS 洗3 次，3 min/次；5%山羊血清37 ℃封閉30 min，PBS 洗3 次，3 min/次；將FSHR 抗體（1∶200）稀釋后滴加在爬片上，4 ℃孵育過夜。次日將細胞爬片室溫復溫1 h，PBS 洗3 次，3 min/次；滴加FITC 標記的熒光二抗（山羊抗兔），37 ℃避光孵育30～40 min（后續(xù)操作均在避光的條件下進行），PBS 洗3 次，8 min/次；加DAPI 染核液染色5 min，PBS 洗3次，10 min/次；最后加入抗熒光淬滅劑封片后用熒光顯微鏡進行拍照。

1.2.4 細胞HE 染色 將細胞懸液接種在含有細胞爬片的24 孔板中，待其生長至60%～70%，棄去培養(yǎng)液，PBS 洗3 次，3 min/次；4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS 洗3 次，3 min/次；蘇木素染色2 min，自來水沖洗10 s；分化液分化2 s，自來水沖洗20 s；反藍液反藍1 min，自來水沖洗20 s；伊紅染色1 min，自來水沖洗10 s；脫水、透明并封片后用DP Ctroller 3.1.1.267 圖像采集系統(tǒng)明場拍照。

1.2.5 流式細胞術檢測凋亡 將各組細胞消化收集至離心管，400×g 離心5 min 后棄培養(yǎng)基；預冷的PBS 洗滌細胞2 次，用400 μL 1× Annexin V重懸細胞后加入5 μL Annexin V-FITC 染色液，于4 ℃避光孵育15 min；隨后加入10 μL PI 染色液于4 ℃孵育5 min，立即用流式細胞儀進行檢測。

1.2.6 TUNEL 檢測細胞凋亡 細胞爬片的準備及固定和通透步驟與1.2.3（細胞免疫熒光）步驟一致。隨后滴加100 μL 1×Equilibration Buffer，室溫平衡孵育30 min；然后滴加50 μL TdT 孵育緩沖液，濕盒內(nèi)37 ℃避光孵育60 min，PBS 洗2次，5 min/次；2 μg·mL-1的DAPI 染核液避光復染5 min，PBS 洗3 次，5 min/次；滴加抗熒光淬滅劑封片后用熒光顯微鏡在（620±20）nm 的熒光下觀察Bright Red 紅色熒光，在460 nm 的熒光下觀察DAPI 藍色熒光。于高倍鏡下隨機選取3 個視野，統(tǒng)計凋亡細胞數(shù)量，計算凋亡率；凋亡率=（凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%。

1.2.7 Western blot 檢測凋亡相關蛋白 用蛋白裂解液將細胞裂解后，13 000 r·min-1、4 ℃離心15 min 取上清；用BCA 法測定濃度并定量；取30 μg 蛋白樣品按照常規(guī)方法進行SDS-PAGE凝膠電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h 后分別加入一抗Bcl-2、Bax 在4 ℃孵育過夜；次日用TBST 清洗后加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h；洗膜后滴加化學發(fā)光液，于Bio-Rad 公司的Chemi DOCTMXRS+化學發(fā)光系統(tǒng)中曝光拍照。用Image J 軟件測量條帶灰度值，目的條帶與內(nèi)參β-actin 蛋白條帶灰度值之比即為該蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t 檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠原代卵巢顆粒細胞的分離培養(yǎng)及鑒定

剛分離的小鼠原代卵巢顆粒細胞呈圓形，具有一定的折光性；培養(yǎng)2 h 后，細胞開始貼壁生長；體外培養(yǎng)24 h 后，細胞呈梭形或多邊形；培養(yǎng)48 h 后，細胞呈單層生長并伸出偽足（圖1A）。卵巢顆粒細胞特異性標記物FSHR 免疫熒光鑒定結(jié)果顯示，F(xiàn)SHR 在細胞質(zhì)和細胞膜均有表達且呈綠色細小顆粒狀（圖1B）。本實驗得到的細胞純度為（93.54±2.3）%，達到后續(xù)實驗要求。HE染色顯示顆粒細胞呈多角梭形，大小均一，形態(tài)完整，邊緣清晰，胞質(zhì)內(nèi)含有許多顆粒（圖1C）。Western blot 結(jié)果顯示，F(xiàn)SHR 在小鼠卵巢顆粒細胞中高表達，在對照組的小鼠胚成纖維細胞中不表達（圖1D）。

圖1 小鼠原代卵巢顆粒細胞的培養(yǎng)及鑒定

2.2 TUNEL 檢測細胞凋亡

經(jīng)TUNEL 染色后檢測各組細胞凋亡結(jié)果顯示：單純?nèi)毖毖踅MTUNEL 陽性細胞數(shù)最多，細胞凋亡率最高，高于對照組及其他干預組（P 均<0.01）；在添加了不同濃度的FSH 進行干預后，細胞凋亡率不同程度地下降，其中0.4、0.6 IU·mL-1FSH 干預組TUNEL 陽性細胞數(shù)較其他干預組減少，細胞凋亡率較其他干預組降低（P 均<0.01），證明FSH 可以抑制缺血缺氧損傷導致的卵巢顆粒細胞凋亡，見圖2。

圖2 TUNEL 檢測細胞凋亡（×200）

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡

與對照組相比，其他各組的細胞凋亡率均增加（P 均<0.01）；0.4 IU·mL-1FSH 干預組細胞凋亡率低于單純?nèi)毖毖踅M和0.1 IU·mL-1FSH 干預組（P 均<0.05），見圖3。

圖3 流式細胞術檢測細胞凋亡

2.4 Western blot 檢測Bcl-2、Bax 蛋白表達量

與對照組相比，其余各組Bcl-2 蛋白表達量均降低，0.2、0.4、0.6 IU·mL-1FSH 干預組Bcl-2蛋白表達量均高于單純?nèi)毖毖踅M，且0.4 IU·mL-1FSH 干預組Bcl-2 蛋白表達量高于其他3 個干預組（P 均<0.01）。與對照組相比，其余各組Bax蛋白表達均上調(diào)，0.1、0.2 IU·mL-1FSH 干預組Bax 蛋白表達量高于單純?nèi)毖毖踅M，0.4、0.6 IU·mL-1FSH 干預組Bax 蛋白表達量低于其他兩個干預組（P 均<0.05）。與對照組相比，其他各組Bcl-2/Bax 比值均降低，0.4、0.6 IU·mL-1FSH 干預組的Bcl-2/Bax 比值均高于單純?nèi)毖毖踅M，其中0.4 IU·mL-1FSH 干預組Bcl-2/Bax 比值高于其他干預組（P 均<0.01），見圖4。

圖4 Western blot 檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax 的表達

3 討論

卵巢凍存及移植是兒童、青少年及不能推遲放化療的婦女保留生育能力的最有效的選擇之一，被廣泛應用于腫瘤生殖領域[13]。在卵巢無血管吻合移植術后，早期缺血缺氧將導致大量原始卵泡丟失[5]，延遲的血流重建及缺氧復氧后大量活性氧的聚集[8]使卵母細胞、顆粒細胞、膜脂凋亡及損傷[3，14]。為了降低卵巢凍存及移植過程中的缺血缺氧損傷，研究者試圖通過添加一些保護因子，以減少凍存及移植對卵巢帶來的損害。有研究[14]表明，白藜蘆醇可以通過抗炎和抗氧化機制提高自體卵巢移植的療效；堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）及血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）聯(lián)合使用可促進移植卵巢的卵泡存活、血管生成和移植小鼠動情周期的恢復[15]。FSH 作為參與卵巢的卵泡發(fā)育、卵母細胞成熟、排卵以及黃體生成等過程的一種促性腺激素[10]，也被廣泛應用于卵巢凍存及移植過程中。研究[16-17]表明，在卵巢凍存過程中添加一定量的FSH，能提高卵泡存活率并減少卵巢顆粒細胞凋亡，增強移植卵巢血供；與此同時，F(xiàn)SH 與卵巢顆粒細胞上的FSHR 結(jié)合，通過激活PI3K-AKT 途徑，能夠抑制竇狀卵泡中顆粒細胞的凋亡并防止卵泡閉鎖[18-19]。在牦牛卵巢顆粒細胞中，F(xiàn)SH 可通過對FOXO3a 及凋亡相關基因Fas、Fas L、Bax、Bcl-2、Bim、BCL-xl、Caspase-3 mRNA 表達水平的調(diào)節(jié)來阻止顆粒細胞的凋亡，進而抑制卵泡閉鎖[20]。本課題組前期研究[21]結(jié)果表明，在凍存卵巢經(jīng)腎背膜移植后2 d，凋亡主要集中在次級卵泡及閉鎖卵泡的顆粒細胞中。卵巢顆粒細胞的凋亡通常被認為是卵泡閉鎖的主要原因[22-25]。因此本研究聚焦卵巢顆粒細胞，在體外模擬卵巢凍存及移植早期缺血缺氧對卵巢顆粒細胞的損傷，探究FSH 對因缺血缺氧引起的卵巢顆粒細胞凋亡的保護作用。

細胞凋亡，是機體應對各種外源性損傷及應激的一種獨特的、重要的“程序性”細胞死亡模式，它通過清除體內(nèi)受損及機體不需要的細胞，使體內(nèi)細胞數(shù)量不斷保持平衡[26]。細胞凋亡主要有兩條途徑：外在途徑，即死亡受體途徑；內(nèi)在途徑，即線粒體途徑。啟動細胞凋亡的外在途徑涉及細胞外信號與細胞膜上死亡受體的相互作用，最典型的配體和相應的死亡受體包括FasL/FasR、TNF-α/TNFR1、Apo3L/DR3、Apo2L/DR4 和Apo2L/DR5，繼而引發(fā)Caspase-8 的激活，細胞凋亡的執(zhí)行命令就會被觸發(fā)。而內(nèi)源性途徑是一種由線粒體相關刺激信號引起的，不依賴受體介導的細胞凋亡方式，其中Bcl-2 蛋白家族通過控制線粒體膜的通透性來調(diào)節(jié)線粒體中細胞色素c的釋放，隨后細胞色素c 與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）進一步作用形成復合物并誘導凋亡小體的產(chǎn)生。目前，在Bcl-2 家族中共鑒定出了25個基因，包括促凋亡蛋白Bcl-10、Bax、Bak、Bid、Bad、Bim、Bik 和Blk 等及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x、Bcl-XL、Bcl-XS、Bcl-w 和BAG 等[27-28]。本研究結(jié)果表明，小鼠原代卵巢顆粒細胞在缺血缺氧刺激下，細胞凋亡增加，而在不同濃度的FSH 干預下，細胞凋亡被抑制，其中0.4 IU·mL-1FSH 抑制凋亡效果最為明顯，推測FSH 在缺血缺氧條件下，可通過凋亡內(nèi)在途徑增加抗凋亡蛋白Bcl-2的生成，減少促凋亡蛋白Bax 的產(chǎn)生，Bcl-2 與Bax的比值通常決定細胞命運[29-30]，故而可抑制卵巢顆粒細胞的凋亡。

綜上所述，F(xiàn)SH 能夠抑制缺血缺氧導致的卵巢顆粒細胞凋亡，降低細胞凋亡率，增強細胞的抗凋亡能力。FSH 抑制顆粒細胞凋亡的機制可能通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，下調(diào)凋亡蛋白Bax 的表達，抑制細胞的氧化損傷[31-33]。這些結(jié)果可為提高凍存移植卵巢內(nèi)卵泡的存活、降低顆粒細胞的凋亡提供新的思路。