阿霉素促進(jìn)過(guò)表達(dá)GSDME 的乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞發(fā)生焦亡

黃曉瑩， 唐振寧， 劉奇?zhèn)?/p>

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院腫瘤外三科，銀川 750004）

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤之一，是全球女性第一大癌癥死亡原因[1]。細(xì)胞焦亡是在細(xì)胞凋亡和壞死后發(fā)現(xiàn)的一種新的程序性、炎癥性細(xì)胞死亡形式，它的特征是細(xì)胞腫脹，從細(xì)胞中吹出大氣泡。細(xì)胞焦亡作為一種促炎型死亡，可抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究[2]表明，細(xì)胞焦亡與其相關(guān)信號(hào)通路中各種炎性介質(zhì)的釋放、腫瘤的發(fā)生及其耐藥密切相關(guān)。

Gasdermin E（GSDME）是Gasdermin 家族的一員，在細(xì)胞焦亡和繼發(fā)性壞死的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。焦亡相關(guān)的Caspase-3 在化療藥物、腫瘤壞死因子、病毒感染等激活下可特異性切割GSDME，從而導(dǎo)致細(xì)胞焦亡。此外，GSDME 被認(rèn)為是一種抑癌劑，與結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌和胃癌有關(guān)[3]。阿霉素（DOX）是臨床常用的化療藥物，有關(guān)DOX 處理乳腺癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡的研究較少，本課題采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)使乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞中GSDME 高表達(dá)，探討DOX處理過(guò)表達(dá)GSDME 乳腺癌細(xì)胞是否促進(jìn)焦亡發(fā)生，以期為研究有抑制細(xì)胞焦亡作用的化療藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，DOX 購(gòu)自美國(guó)APExBIO 公司，慢病毒包裝由自天津舍為斯科技有限公司完成，抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、CCK-8 法試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇的乳腺癌細(xì)胞加L15培養(yǎng)基（10%胎牛血清、100 IU·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素）培養(yǎng)于T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2的濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞每2～3 d進(jìn)行一次傳代。

1.2.2 GSDME 的基因克隆 用Trizol 法提取細(xì)胞中RNA，檢測(cè)RNA 的純度。合成PCR 引物后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過(guò)PCR 擴(kuò)增獲取目的基因序列，Ecor I 限制性內(nèi)切酶酶切并純化后插入慢病毒表達(dá)載體中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.2.3 應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)提高乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞GSDME 表達(dá) 將構(gòu)建的Vector 質(zhì)粒和OE-GSDME 轉(zhuǎn)化Ecoli DH5α，挑取單克隆并提取質(zhì)粒，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，收集足夠的慢病毒液，轉(zhuǎn)染前一天將正常培養(yǎng)的細(xì)胞棄掉舊培養(yǎng)基，用1 mL 的PBS 溶液洗滌2 次后加入Trypsin液1 mL 放置于37 ℃、5%CO2溫箱內(nèi)消化1 min 后加入培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移至離心管中，1 000 r·min-1離心5 min；棄上清，收集細(xì)胞沉淀，用適量細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按2×105個(gè)/孔的密度加入六孔板中；將接種細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照每孔940 μL 的培養(yǎng)基加入20 μL 的病毒液；混勻后將孵育好的混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)板；12～16 h 后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72 h 后通過(guò)熒光觀察感染效率。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)GSDME 過(guò)表達(dá) 從未經(jīng)任何處理的空白對(duì)照組（MDA-MB-231）、空載體對(duì)照組（NC）和轉(zhuǎn)染高表達(dá)組（OE-GSDME）各個(gè)細(xì)胞樣本中吸出培養(yǎng)基，用PBS 洗滌細(xì)胞并吸凈，加入蛋白裂解液刮下細(xì)胞；冰浴靜置30 min，期間超聲破碎處理3 次，以完成細(xì)胞充分裂解，4 ℃低溫離心機(jī)12 000 r·min-1離心15 min，收集上清提取總蛋白。采用BCA 蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度，加入DTT 緩沖液，恒溫金屬浴95 ℃煮5 min 使蛋白變性，轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉1 h 后加入一抗，孵育過(guò)夜后洗滌加入二抗，在室溫下?lián)u床孵育1 h 后顯色曝光，使用Image J 軟件分析條帶的灰度值，每個(gè)樣本獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 CCK-8 法檢測(cè)DOX 對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞增殖的影響 根據(jù)不同藥物濃度進(jìn)行分組，按照0、2、4、6、8、10、12、14 μg·mL-1的藥物濃度處理NC 組和OE-GSDME 組，繼續(xù)放入CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。細(xì)胞經(jīng)藥物處理24 h后，吸除各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清，PBS 清洗各孔細(xì)胞；每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h；測(cè)定在450 nm 處的吸光度值。

1.2.6 流式檢測(cè)細(xì)胞焦亡 分別收集NC 組和OE-GSDME 組細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)，分別向兩組加入DOX，藥物處理時(shí)間為24 h。用0.25%胰酶消化細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min 收集細(xì)胞沉淀；用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞沉淀2 次，制備成1×106/mL 濃度的細(xì)胞懸液；取100 μL 細(xì)胞懸液，加入100 μL 凋亡檢測(cè)Regent；輕柔混勻，室溫避光孵育20 min 后進(jìn)行流式檢測(cè)。以Annexin V-FITC+/PI+雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率作為焦亡率[4-8]。

1.2.7 LDH 釋放實(shí)驗(yàn) 向NC 組和OE-GSDME組分別加入4 μg·mL-1DOX 處理細(xì)胞，繼續(xù)放入CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。設(shè)置一個(gè)最大LDH 釋放組，檢測(cè)前45 min 加入裂解液，充分裂解細(xì)胞，以評(píng)估LDH 最大活性；設(shè)置培養(yǎng)基孔，作為背景值；24 h 后從每孔中取出50 μL 轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的96 孔板中。每孔中加入50 μL 底物混合物，避光，室溫孵育30 min；每孔中加入50 μL 的終止液，1 h 后測(cè)量490 nm 處吸光值；從樣品讀數(shù)中減去背景值；細(xì)胞毒性百分比=（實(shí)驗(yàn)孔LDH釋放的OD490 值/最大LDH 釋放的OD490 值）×100% 。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 9.12 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析和作圖，計(jì)量資料組間比較采用t 檢驗(yàn)，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSDME 過(guò)表達(dá)慢病毒高效感染MDA-MB-231 細(xì)胞

構(gòu)建OE-GSDME 慢病毒載體，轉(zhuǎn)染GSDME低表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，可見病毒包裝系統(tǒng)中的GFP 發(fā)出的綠色熒光，證明慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功，見圖1。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞（×40）

2.2 成功構(gòu)建GSDME 過(guò)表達(dá)

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OE-GSDME 組GSDME 蛋白的表達(dá)量高于MDA-MB-231 和NC組，見圖2。

圖2 各組GSDME 表達(dá)水平比較

2.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn)篩選藥物濃度

結(jié)果顯示，DOX 處理OE-GSDME 組、NC 組24 h 后的IC50分別為5.1 μmol·mL-1和9.6 μmol·mL-1，見圖3。

圖3 DOX 干預(yù)24 h 后CCK-8 法測(cè)定兩組細(xì)胞存活率

2.4 LDH 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

用約為半數(shù)抑制濃度DOX（4 μg·mL-1）分別處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞和空載體細(xì)胞，光鏡觀察、流式細(xì)胞術(shù)和LDH 釋放水平檢測(cè)結(jié)果顯示，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，其中NC 組及OE-GSDME 組未加藥時(shí)焦亡率分別為8.37%、8.30%，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；NC+DOX 組焦亡率（17.40%）低于OE-GSDME+DOX 組（39.08%）（P<0.01）；OE-GSDME 組LDH 釋放率高于NC組（P<0.01），見圖4。

圖4 DOX（4 μg·mL-1）干預(yù)NC 組和OE-GSDME 組24 h 后流式細(xì)胞術(shù)和LDH 釋放結(jié)果

2.5 高倍鏡下細(xì)胞形態(tài)的變化

加入DOX 后細(xì)胞發(fā)生腫脹，在DOX 的作用下使乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞發(fā)生焦亡，見圖5。

圖5 DOX（4 μg·mL-1）干預(yù)NC 組和OE-GSDME 組24 h 后顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)（×200）

3 討論

Gasdermin 家族蛋白（GSDMs）多表達(dá)于胃腸道和皮膚的上皮組織，GSDMs 可能參與了上皮細(xì)胞發(fā)育、凋亡、炎癥、癌變及免疫相關(guān)性疾病等多個(gè)生理和病理過(guò)程[9]。細(xì)胞焦亡是一種炎癥型細(xì)胞溶解的死亡方式，需要Gasdermin 蛋白介導(dǎo)破壞細(xì)胞，以細(xì)胞的腫脹和溶解釋放許多促炎因子為特征。炎性小體、Caspase 和Gasdermin 家族在焦亡中起關(guān)鍵作用。

細(xì)胞焦亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及藥物治療腫瘤產(chǎn)生的耐藥性密切相關(guān)[10]。作為Gasdermin 家族的一員，GSDME 在細(xì)胞凋亡和繼發(fā)性壞死的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[11]。GSDME 的N 端位于外顯子2 和6 區(qū)域，C 端可以作為調(diào)節(jié)器通過(guò)折疊調(diào)節(jié)N 端結(jié)構(gòu)域從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性避免細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。GSDME 在ER+/腔A 型乳腺癌中的表達(dá)主要與單核系和巨噬細(xì)胞有關(guān)，可能促進(jìn)人乳腺癌的腫瘤內(nèi)免疫應(yīng)答[13]。人類乳腺癌細(xì)胞MCF 7 微陣列分析表明，GSDME 啟動(dòng)子區(qū)的DNA 甲基化引起GSDME 沉默，去甲基化劑可完全恢復(fù)P53 誘導(dǎo)的GSDME 的表達(dá)[14]。GSDME甲基化被認(rèn)為會(huì)增加乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[15]。因此，越來(lái)越多的研究關(guān)注了GSDME 與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)證明，GSDME 通過(guò)P53 信號(hào)通路促進(jìn)了依托泊苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。除此之外，許多抗癌藥物通過(guò)由BCL 2 家族蛋白控制的線粒體途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。BCL 2 家族成員BAK 和BAX 在激活后可在線粒體外膜（MOM）形成孔隙，導(dǎo)致線粒體膜間成分釋放，導(dǎo)致Caspase級(jí)聯(lián)激活[16-18]。GSDME 在不同的細(xì)胞類型和組織中的表達(dá)水平不同。高水平的GSDME 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞焦亡，而低水平的細(xì)胞在化療后會(huì)發(fā)生凋亡[19]，與本研究結(jié)果一致。研究[20]表明，米立酮通過(guò)調(diào)節(jié)ROS/絲裂原激活和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（MEK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK 1/2）途徑抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，化療所致的細(xì)胞焦亡是由BAK/Bax-Caspase-3-GSDME 途徑介導(dǎo)的，而且BAK 或BAX 單獨(dú)介導(dǎo)了這一過(guò)程。更重要的是，GSDME 在化療所致的細(xì)胞焦亡過(guò)程中為烷基化，而藥物聯(lián)合可以抑制這一過(guò)程[21]。本研究結(jié)果顯示，順鉑和紫杉醇均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡，與紫杉醇相比，順鉑可引起的細(xì)胞焦亡更明顯，引起Caspase-3 的活化和GSDME-NT 生成水平更高[22]。在NHEK 和HPlEpC 細(xì)胞中，敲除GSDME 基因可將化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡轉(zhuǎn)化為凋亡，從而使化療藥物通過(guò)GSDME 介導(dǎo)的焦亡作用而殺死某些正常細(xì)胞[23]。大多數(shù)癌細(xì)胞GSDME表達(dá)量低，用脫氧胞苷逆轉(zhuǎn)GSDME 沉默，使細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感[24-26]。因此，GSDME 被認(rèn)為是一種與多種癌癥有關(guān)的抑癌劑。

綜上所述，DOX 促進(jìn)過(guò)表達(dá)GSDME 的乳腺癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡，闡明了在乳腺癌中化療藥物DOX 和過(guò)表達(dá)GSDME 的相關(guān)性，進(jìn)一步研究探明GSDME 介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生焦亡的機(jī)制，對(duì)于乳腺癌的治療以及對(duì)于抗乳腺癌相關(guān)藥物開發(fā)具有進(jìn)一步的指導(dǎo)意義，同時(shí)為乳腺癌免疫治療提供新的靶點(diǎn)奠定了新的研究基礎(chǔ)。