基于iTRAQ多重標(biāo)記串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)系統(tǒng)性篩選乳腺癌患者血清蛋白表達(dá)的差異分析

劉艷翠　　張欣　　李文媛　　孫成　　孫平　　趙微

[摘要] 目的 觀察串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在乳腺癌血清蛋白表達(dá)中的差異。方法? 選取2020年2月～2021年2月黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬二院收治的乳腺癌新輔助化療患者20例作為研究組，包含10例化療有效患者及10例化療無效患者，同時選取8名健康者作為對照組。采集所有患者的肘靜脈血，分別采用高通量miRNA、iTRAQ表達(dá)譜測序技術(shù)，從“組學(xué)”的角度對乳腺癌新輔助化療不同療效患者miRNA差異表達(dá)譜、外周血單個核細(xì)胞蛋白組進行研究。隨后，先進行Pathway通路分析，該過程在蛋白質(zhì)層面進行，然后找出sRNA的成熟體序列，在此過程中嚴(yán)格根據(jù)miRbase18數(shù)據(jù)庫。將已知的cDNA序列整理為一行，對得到的sRNA對應(yīng)靶基因進行預(yù)測，Pathway分析靶基因，最后將同一Pathway通路中的sRNA靶基因及蛋白質(zhì)尋找出來。結(jié)果? 研究組和對照組共篩選出19個差異表達(dá)蛋白，選取其中具有較大表達(dá)差異的肝細(xì)胞生長因子（HGF）進行驗證。iTRAQ標(biāo)記圖譜顯示，研究組和對照組的血清HGF表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。研究組Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者的血清HGF表達(dá)水平逐漸升高（P<0.05），均高于對照組（均P<0.05），符合iTRAQ標(biāo)記圖譜鑒定結(jié)果。結(jié)論? 串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)用于篩選發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞HGF表達(dá)水平升高具有顯著效果，可有效指導(dǎo)臨床診治乳腺癌的工作，將有效參考提供給靶向治療藥物的開發(fā)。

[關(guān)鍵詞] iTRAQ多重標(biāo)記串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù);系統(tǒng)性篩選;乳腺癌;血清蛋白表達(dá)

[中圖分類號] R737.9? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）16-0033-03

Analysis on serum protein expression differences in breast cancer patients systematically screened by iTRAQ-based tandem mass spectrometry

LIU Yancui1 ZHANG Xin2? LI Wenyuan1 SUN Cheng1 SUN Ping1 ZHAO Wei1

1.Teaching and Research Room of Anatomy， Mudanjiang Medical University of Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China; 2.Department of Ultrasound， the Second Affiliated Hospital of Mudanjiang Medical University of Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China

[Abstract] Objective? To analyze the effectiveness of isobaric tags for relative and absolute quantitation （iTRAQ）-based tandem mass spectrometry for systematic screening of serum protein expression differences in breast cancer patients. Methods A total of 20 patients with neoadjuvant chemotherapy for breast cancer were selected as the study group， which contained 10 patients with effective chemotherapy and 10 patients with ineffective chemotherapy， and 8 healthy subjects were selected as the control group at the same time. Elbow venous blood was collected from all patients， and high-throughput sequencing in micro-ribonucleic acid （miRNA） expression profiling and iTRAQ technique were used to study the differential miRNA expression profiles and peripheral blood mononuclear cell proteome of patients with different efficacy of neoadjuvant chemotherapy for breast cancer from the perspective of “omics”. Subsequently， the Pathway analysis was performed at the protein level， and then the mature sequences of small RNA （sRNA） were identified， in which the miRbase18 database was strictly followed. The known complementary deoxyribonucleic acid （cDNA） sequences were organized into one line， the target genes corresponding to the obtained sRNA were predicted and analyzed by the Pathway analysis， and finally the sRNA target genes and proteins in the same Pathway were screened out， and the correlation between differential proteins and miRNA target genes was analyzed. Results A total of 19 differentially expressed proteins in the study and control groups were screened out， and hepatocyte growth factor （HGF） with great expression differences was selected for validation. iTRAQ labeling-based profiles showed that there was a statistically significant difference between study group and the control group in serum HGF expression levels （P<0.05）. The Western Blot validated and proved that serum HGF expression levels in patients of stage Ⅰ， stage Ⅱ and stage Ⅲ in the study group were progressively increased （P<0.05）， and were higher than those in the control group （all P<0.05）， which was consistent with the results of iTRAQ labeling-based profile identification. Conclusion iTRAQ-based tandem mass spectrometry for systematic screening of serum protein expression differences in breast cancer patients reveals elevated HGF expression levels in breast cancer cells， which will effectively guide the clinical diagnosis and treatment of breast cancer and provide an effective reference to the development of targeted therapeutic drugs.

[Key words] iTRAQ-based tandem mass spectrometry; Systematic screening; Breast cancer; Serum protein expression

盡管乳腺癌新輔助化療的蛋白質(zhì)組學(xué)研究已在組織和血清水平發(fā)現(xiàn)一系列差異表達(dá)蛋白，且miRNA表達(dá)譜測序技術(shù)的應(yīng)用使得乳腺癌相關(guān)miRNA取得一定的成績，但這些研究僅涉及乳腺癌表達(dá)蛋白檢測和miRNA差異表達(dá)譜，即差異表達(dá)蛋白和miRNA差異表達(dá)的研究是割裂的[1]。目前，尚未見到二者之間相關(guān)聯(lián)的研究。這也為后續(xù)的研究提供了契機。本研究統(tǒng)計分析2020年2月～2021年2月黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬二院乳腺癌新輔助化療患者20例的臨床資料，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取2020年2月～2021年2月黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬二院乳腺癌新輔助化療患者20例作為研究組，包含10例化療有效患者及10例化療無效患者，同時選取8名健康者作為對照組。研究組患者年齡29～57歲，平均（38.26±6.45）歲;TNM分期：Ⅰ期7例（35.00%），Ⅱ期10例（50.00%），Ⅲ期3例（15.00%）。對照組8名健康者均為女性，年齡30～58歲，平均（39.14±6.86）歲。兩組研究對象的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 基于iTRAQ技術(shù)研究乳腺癌患者外周血單個核細(xì)胞蛋白表達(dá)譜? 督促患者空腹至少8 h，采集肘靜脈血6 ml，放置在10 ml EDTA-2K抗凝管中。分離外周血單個核細(xì)胞，此過程嚴(yán)格依據(jù)Feicoll分離液說明書。提取蛋白質(zhì)并定量，采用SDS電泳、蛋白質(zhì)酵解、iTRAQ標(biāo)記、SCX分離、基于Triple TOF 5600分析LC-ESI-MS/MS、Western blot對實驗進行驗證。最后，采用Mascot蛋白質(zhì)鑒定軟件，運用IPI_human v3.87數(shù)據(jù)庫（91464 sequences）檢索和鑒定蛋白[2]。

1.2.2 高通量測序技術(shù)研究乳腺癌新輔助化療患者外周血單個核細(xì)胞miRNA表達(dá)譜? 分離外周血單個核細(xì)胞，此過程嚴(yán)格依據(jù)Feicoll分離液說明書。提取總RNA，對RNA濃度進行檢測，利用Solexa技術(shù)測序進行Small RNA文庫構(gòu)建和測序，分析兩組樣本miRNA差異。驗證Stem-loop qRT-PCR對部分差異表達(dá)miRNA，分析Small RNA數(shù)據(jù)處理和信息。

1.2.3 乳腺癌新輔助化療患者外周血單個核細(xì)胞蛋白質(zhì)組與miRNA關(guān)聯(lián)分析? 將候選miRNA和蛋白選取出來，分別運用The miRanda、TargetScan和PicTar三大miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫找到差異表達(dá)miRNA共有的靶基因，預(yù)測miRNA靶基因，最后進行生物信息學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 iTRAQ標(biāo)記圖譜鑒定結(jié)果

iTRAQ標(biāo)記圖譜顯示，兩組研究對象的血清HGF表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 Western Blot 驗證差異蛋白

研究組Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者的血清HGF表達(dá)水平逐漸升高（P<0.05），均高于對照組（均P<0.05），符合iTRAQ標(biāo)記圖譜鑒定結(jié)果。見表1。

3 討論

新輔助化療（NAC）在早期乳腺癌的治療中能夠促進腫瘤的縮小、手術(shù)切除機會的提升，同時能夠?qū)w內(nèi)療效進行直接評估，因此通常在對化療敏感性的影響因素進行探究的過程中應(yīng)用[3～5]。如果患者經(jīng)新輔助化療將病理學(xué)結(jié)果完全緩解，其預(yù)后更好[6，7]。在蛋白質(zhì)組學(xué)中，定量蛋白質(zhì)組學(xué)占有重要地位[8，9]。基于iTRAQ技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究是近年來發(fā)展起來的新技術(shù)，可在宏觀的角度上系統(tǒng)地從復(fù)雜的蛋白質(zhì)組中探測數(shù)千種蛋白質(zhì)，高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性研究疾病發(fā)展機制和治療機制[10]。iTRAQ技術(shù)包括肽反應(yīng)、報告、平衡3個部分[11]。其中，肽反應(yīng)部分能夠?qū)ι想亩芜M行標(biāo)記，原因為共價連接肽N端與氨基酸側(cè)鏈，該部分能對幾乎所有的蛋白質(zhì)進行標(biāo)記[12];報告部分可有8種，因此iTRAQ試劑能夠?qū)?組樣品進行標(biāo)記[13]。iTRAQ在標(biāo)記完蛋白質(zhì)后通過平衡部分保證其標(biāo)記的肽段質(zhì)核比相同，最終得知樣本蛋白質(zhì)的定量信息[14]。

既往研究結(jié)果表明，乳腺癌與特定蛋白質(zhì)和miRNA具有密切關(guān)系，但同時也表明這些研究均以某一蛋白質(zhì)或某一miRNA作為出發(fā)點進行研究，尚未將蛋白質(zhì)和miRNA作為宏觀整體進行分析[15，16]。新輔助化療治療乳腺癌具有極為復(fù)雜的影響機制[17，18]。因此，miRNA與蛋白質(zhì)的研究應(yīng)綜合起來，才能系統(tǒng)地對乳腺癌新輔助化療療效機制有一個整體的認(rèn)識，同時也有助于治療靶點的篩選[19，20]。本研究結(jié)果表明，研究組和對照組共篩選出差異表達(dá)蛋白19個，選取其中具有較大的表達(dá)差異的肝細(xì)胞生長因子（HGF）進行驗證。iTRAQ標(biāo)記圖譜顯示，兩組血清HGF表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。研究組Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者的血清HGF表達(dá)水平逐漸升高（P<0.05），均高于對照組（均P<0.05），符合iTRAQ標(biāo)記圖譜鑒定結(jié)果，說明iTRAQ技術(shù)能夠幫助臨床充分了解疾病的病理機制，從而有效防控和診治疾病。

綜上所述，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞HGF表達(dá)水平升高具有較高的臨床價值，可對臨床診治乳腺癌工作起到有效指導(dǎo)，且給靶向治療藥物的開發(fā)提供有效參考。

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（收稿日期：2021-07-06）