黃芪多糖對放射性腸炎大鼠腸黏膜損傷的修復作用研究

侯繼院， 單國用， 龔哲， 張春禮

（1.鄭州人民醫(yī)院放療科，河南鄭州 450000；2.鄭州人民醫(yī)院普外科，河南鄭州 450000）

腹部、盆腔放射療法誘發(fā)腸壁急性或慢性病變，稱為放射性腸炎（radiation enteritis），是惡性腫瘤放療后的常見并發(fā)癥[1]。放射性腸炎可累及小腸、結腸和直腸等部位，其中，小腸黏膜損傷預后較其他部位差。目前，臨床治療以手術、對癥治療及營養(yǎng)支持療法為主，但遠期效果并不理想[2-3]；而中醫(yī)藥以可喜療效，毒副作用小，顯示了良好的臨床應用前景。中藥黃芪為豆科植物黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.或內蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge var.mongholicusBge.Hsiao等的根，味甘，性微溫，入脾、肺經，具有補中益氣、固表、利水、托膿、生肌功效，善治癰疽久不潰破、潰久不斂。黃芪多糖（astragalus polysaccharide）是黃芪的主要有效活性成分之一，可緩解潰瘍性結腸炎，降低炎癥反應，改善腸道黏膜屏障功能[4-5]。本病與慢性潰瘍性結腸炎的臨床表現有相似之處，均屬于中醫(yī)“泄瀉”范疇，但黃芪多糖對放射性腸炎大鼠腸黏膜損傷的治療作用尚不明確?；诖?，本研究建立放射性腸炎大鼠模型，采用黃芪多糖進行干預，探討黃芪多糖的修復作用及可能機制，以期為黃芪多糖相關藥物的研發(fā)和放射性腸炎的臨床治療提供實驗依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級8周齡雄性SD 大鼠60只，體質量（280 ± 20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物質量合格證號：SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)條件：溫度20 ～25 ℃，相對濕度45%～55%，明暗循環(huán)時間比1∶1，根據國家實驗動物管理條例進行喂養(yǎng)。本研究經鄭州人民醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 藥品、試劑與儀器黃芪多糖（純度≥95%，批號：A1427），購自成都曼斯特生物科技有限公司；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）特異性抑制劑——復合物C 購自美國Sigma 公司（批號：171261）；硫氰酸熒光素標記的葡聚糖4（FITC-dextran4，FD4）購自美國Sigma Aldrich 公司；白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測試劑盒購自晶美（深圳）生物工程公司；兔抗鼠AMPK抗體、磷酸化AMPK（p-AMPK）抗體、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和磷酸化mTOR（p-mTOR）、β-actin抗體購自美國Upstate公司；山羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標記的IgG購自英國Abcam 公司。高能X 射線直線加速器購自美國Varian 公司；Shimadzu RF-540 熒光分光光度計購自日本島津儀器公司；酶標儀購自芬蘭雷勃公司。

1.3 建立大鼠放射性腸炎模型參照文獻研究[6]方法，隨機選取48只SD 大鼠，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后固定于手術板上，用高能X 射線直線加速器進行全腹照射（從劍突至恥骨聯(lián)合），照射面積8.5 cm × 7.5 cm，其余部位使用5 cm 厚鉛板遮擋，源皮距100 cm，照射劑量9 Gy，射線能量6 MV，放射劑量率300 cGy/min，照射時間約3 min，照射1 次。若大鼠出現脫毛、便血、腹瀉和體質量減輕等癥狀則提示建模成功。剩余12只大鼠作為正常組，置于相似環(huán)境中但不給予放射線照射。

1.4 分組與藥物干預將造模成功的48只SD 大鼠按隨機數字表分為模型組、黃芪多糖組、復合物C組、黃芪多糖+復合物C組，每組12只。造模成功后次日，參照文獻研究[7]用量，黃芪多糖組給予400 mg·kg-1·d-1黃芪多糖灌胃，復合物C組給予2 mL 復合物C 10 μmol/L 灌胃，黃芪多糖+復合物C組先給予400 mg/kg 黃芪多糖灌胃，4 h 后再灌胃2 mL 復合物C 10 μmol/L，每日1 次，連續(xù)7 d；正常組、模型組實驗期間給予等量無菌生理鹽水灌胃。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 大鼠一般情況和疾病活動指數（DAI） 藥物開始干預第1天起，每2 d 稱量大鼠體質量至第7天給藥結束，期間同步觀察大鼠攝食飲水、精神狀態(tài)、排便等生活情況，根據體質量變化、腹瀉、便血及大便性狀進行DAI 評分。評分標準[8]：①腹瀉程度（正常，計0 分；稀便，計2分；水樣腹瀉，計4分）；②便血程度（無出血，計0分；輕度出血，計2分；大出血，計4分）。

1.5.2 熒光素示蹤法檢測小腸黏膜通透性 末次藥物干預24 h后，FD4示蹤法向距離回盲部2.5 cm末段回腸腸腔注入0.1 mL FD4溶液（用生理鹽水稀釋至125 mg/L），0.5 h后取眼球血，分離血漿，應用熒光分光光度計檢測其熒光強度，根據熒光強度計算血漿FD4含量。

1.5.3 ELISA法檢測小腸黏膜組織IL-1β、TNF-α水平 眼球采血完畢，脊椎脫臼法處死大鼠，解剖分離小腸黏膜組織，取部分組織于勻漿器中勻漿，以3000 r/min（離心半徑8 cm）離心15 min，收集上清。酶標板上設置空白孔、標準品孔和樣品孔，空白孔不加樣品和酶標試劑，標準品孔加不同濃度的標準品50 μL，樣品孔先加40 μL 樣品稀釋液，再加10 μL 待測樣品（最終稀釋度為5 倍），晃動混勻，除空白孔外其余每孔加100 μL 酶標試劑，封板后37 ℃溫育1 h。洗滌液清洗5 次，先加50 μL 顯色劑A，再加50 μL 顯色劑B，晃動混勻，37 ℃避光顯色15 min。加50 μL 終止液終止反應，15 min 內以空白孔調零，應用酶標儀于450 nm 波長處測量吸光度（OD）值。根據標準曲線計算樣品IL-1β、TNF-α水平。

1.5.4 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察小腸黏膜組織病理學變化 大鼠處死后以肛門到盲腸為標志點，切取距回盲部5 cm的小腸組織，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，組織切片（厚度約為4 μm），酒精、二甲苯脫蠟，蘇木素、伊紅染色，脫水、透明后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察大鼠小腸黏膜組織病理變化。

1.5.5 透射電鏡觀察小腸組織結構和絨毛超微結構變化 選取小腸組織典型病灶處，預冷的4%戊二醛-1.5%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，丙酮浸透，環(huán)氧樹脂包埋劑包埋，超薄切片機切片（厚度約80 nm），3%醋酸鈾、檸檬酸鉛分別染色5 min，透射電鏡下觀察小腸組織結構和絨毛超微結構變化。

1.5.6 Western Blot 法檢測小腸黏膜組織AMPK通路相關蛋白表達水平 取80 mg 小腸黏膜組織，加入液氮后研磨，提取總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白變性。10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離目的蛋白，80 V恒壓電泳30 min，100 V恒壓電泳約1 h，濕式轉膜儀轉至PVDF 膜，300 mA 恒流轉膜1 h。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別加入AMPK 一抗（1∶500 稀釋）、p-AMPK 一抗（1∶200 稀釋）、mTOR 一抗（1∶500 稀釋）、p-mTOR 一抗（1∶200 稀釋）、β-actin 一抗（1∶1000 稀釋）4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次，每次10 min，再加入HRP 標記二抗（1∶2000 稀釋），室溫孵育1 h。TBST 洗膜3 次，每次10 min，浸入電化學發(fā)光（ECL）液，于暗室中曝光顯影。實驗重復3次。應用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值/內參β-actin蛋白條帶灰度值表示目的蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件對實驗數據進行分析，計量資料以均數± 標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況和DAI變化比較正常組大鼠實驗期間攝食、飲水、精神狀態(tài)及排便情況無明顯異常；模型組大鼠出現脫毛、弓背、精神萎靡、攝食飲水減少、腹瀉、便血、體質量減輕，DAI升高。與模型組比較，黃芪多糖組大鼠腸炎癥狀明顯減輕，從給藥第3天開始，DAI 降低（P＜0.05）；復合物C組腸炎癥狀明顯加重，從給藥第3天開始，DAI升高（P＜0.05）。與黃芪多糖組比較，復合物C組、黃芪多糖+復合物C組腸炎癥狀明顯加重，從給藥第3天開始，DAI 升高（P＜0.05）。與復合物C組比較，黃芪多糖+復合物C組腸炎癥狀明顯減輕，從給藥第3天開始，DAI降低（P＜0.05）。DAI 變化見圖1。結果表明，復合物C可加重放射性腸炎大鼠癥狀，而黃芪多糖可緩解放射性腸炎大鼠腹瀉、便血等相關癥狀。

圖1 各組大鼠一般情況和疾病活動指數（DAI）變化比較Figure 1 Comparison of changes in general condition and DAI between various groups of rats

2.2 各組大鼠腸道黏膜通透性比較與正常組比較，模型組血漿FD4 含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪多糖組血漿FD4含量降低，復合物C組血漿FD4 含量升高（P＜0.05）；與黃芪多糖組比較，復合物C組、黃芪多糖+復合物C組血漿FD4含量升高（P＜0.05）；與復合物C組比較，黃芪多糖+復合物C組血漿FD4含量降低（P＜0.05）。具體結果見表1。結果表明，黃芪多糖可改善放射性腸炎大鼠腸道黏膜通透性。

表1 各組大鼠血漿FD4含量比較Table 1 Comparison of plasma FD4 content among various groups of rats （±s，mg·L-1）

表1 各組大鼠血漿FD4含量比較Table 1 Comparison of plasma FD4 content among various groups of rats （±s，mg·L-1）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與黃芪多糖組比較；④P＜0.05，與復合物C組比較

組別正常組模型組黃芪多糖組復合物C組黃芪多糖+復合物C組F值P值鼠數/只1212121212血漿FD412.74±1.7853.62±5.24①36.89±3.51②61.57±5.68②③50.45±4.73③④225.368＜0.001

2.3 各組大鼠小腸黏膜組織IL-1β、TNF-α 水平比較與正常組比較，模型組小腸黏膜組織IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪多糖組小腸黏膜組織IL-1β、TNF-α水平降低（P＜0.05），復合物C組小腸黏膜組織IL-1β、TNF-α水平升高（P＜0.05）；與黃芪多糖組比較，復合物C組、黃芪多糖+復合物C組小腸黏膜組織IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與復合物C組比較，黃芪多糖+復合物C組小腸黏膜組織IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.05）。具體結果見表2。結果表明，黃芪多糖可減輕放射性腸炎大鼠小腸黏膜組織的炎癥反應。

表2 各組大鼠小腸黏膜組織IL-1β、TNF-α水平比較Table 2 Comparison of the levels of IL-1β and TNF-α in the small intestinal mucosa among various groups of rats （±s，ng·mL-1）

表2 各組大鼠小腸黏膜組織IL-1β、TNF-α水平比較Table 2 Comparison of the levels of IL-1β and TNF-α in the small intestinal mucosa among various groups of rats （±s，ng·mL-1）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與黃芪多糖組比較；④P＜0.05，與復合物C組比較

組別正常組模型組黃芪多糖組復合物C組黃芪多糖+復合物C組F值P值鼠數/只1212121212 IL-1β 4.68±0.197.56±0.34①5.43±0.25②8.29±0.41②③6.42±0.28③④308.547＜0.001 TNF-α 1.34±0.123.67±0.24①1.92±0.18②4.51±0.37②③2.53±0.29③④319.532＜0.001

2.4 各組大鼠小腸黏膜組織病理表現比較正常組大鼠小腸黏膜單層柱狀上皮、黏膜肌層和固有層結構完整，腺體結構清晰，肌層、固有層及漿膜無炎性細胞浸潤；模型組小腸黏膜結構不完整，隱窩和腺體正常結構消失，小腸上皮結構破壞，黏膜及黏膜下層大量炎性細胞浸潤；與模型組比較，黃芪多糖組小腸部分上皮細胞及腺體細胞再生，黏膜結構較完整，炎性細胞浸潤減少，病變程度顯著減輕，復合物C組小腸黏膜結構嚴重破壞，炎性細胞浸潤增多，病變程度顯著加重；黃芪多糖+復合物C組小腸黏膜病變程度較黃芪多糖組加重。具體結果見圖2。結果表明，黃芪多糖可改善放射性腸炎大鼠小腸黏膜組織病理損傷。

圖2 各組大鼠小腸黏膜組織病理表現比較（HE染色，×200）Figure 2 Comparison of pathological features of small intestinal mucosal tissue among various groups of rats（by HE staining，×200）

2.5 各組大鼠小腸組織結構和絨毛超微結構變化比較正常組大鼠小腸上皮細胞微絨毛完整，細胞結構清晰，排列整齊，緊密連接結構無顯著變化；模型組腸上皮細胞空泡變性，大部分杯狀細胞排空，線粒體輕度腫脹，粗面內質網擴張，細胞間質水腫伴炎性細胞浸潤，腸黏膜緊密連接結構減少，細胞間隙增寬；與模型組比較，黃芪多糖組腸黏膜組織損傷顯著減輕，緊密連接結構較完整，間隙擴大程度降低，復合物C組腸黏膜組織損傷顯著加重，緊密連接結構顯著減少；相較于黃芪多糖組，黃芪多糖+復合物C組小腸黏膜組織損傷加重，緊密連接結構減少，細胞間隙增寬。具體結果見圖3。結果表明，黃芪多糖可改善放射性腸炎大鼠小腸超微結構的損傷。

圖3 各組大鼠小腸組織結構和絨毛超微結構變化比較（透射電鏡，×4000）Figure 3 Comparison of changes in Histological structure of small intestine and ultrastructure of villi among various groups of rats（by transmission electron microscopy，×4000）

2.6 各組大鼠小腸黏膜組織AMPK通路相關蛋白表達水平比較與正常組比較，模型組小腸黏膜組織p-AMPK蛋白相對表達量降低，p-mTOR蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪多糖組小腸黏膜組織p-AMPK 蛋白相對表達量升高，p-mTOR 蛋白相對表達量降低（P＜0.05），復合物C組小腸黏膜組織p-AMPK蛋白相對表達量降低，p-mTOR 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與黃芪多糖組比較，復合物C組、黃芪多糖+復合物C組小腸黏膜組織p-AMPK 蛋白相對表達量降低，p-mTOR 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與復合物C組比較，黃芪多糖+復合物C組小腸黏膜組織p-AMPK蛋白相對表達量升高，p-mTOR蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。具體結果見表3、圖4。結果表明，黃芪多糖可調控放射性腸炎大鼠小腸黏膜組織AMPK通路關鍵蛋白的表達。

表3 各組大鼠小腸黏膜組織AMPK通路相關蛋白表達水平比較Table 3 Comparison of the relative expression levels of AMPK pathway-related proteins in the small intestinal mucosa among various groups of rats （±s，n=3）

表3 各組大鼠小腸黏膜組織AMPK通路相關蛋白表達水平比較Table 3 Comparison of the relative expression levels of AMPK pathway-related proteins in the small intestinal mucosa among various groups of rats （±s，n=3）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與黃芪多糖組比較；④P＜0.05，與復合物C組比較

組別正常組模型組黃芪多糖組復合物C組黃芪多糖+復合物C組F值P值p-AMPK蛋白相對表達量0.83±0.050.42±0.03①0.67±0.05②0.35±0.02②③0.55±0.04③④67.557＜0.001 AMPK蛋白相對表達量1.01±0.061.08±0.081.03±0.071.05±0.060.99±0.040.9100.494 p-mTOR蛋白相對表達量0.51±0.040.98±0.06①0.74±0.05②1.15±0.08②③0.86±0.06③④51.924＜0.001 mTOR蛋白相對表達量1.23±0.081.25±0.091.24±0.081.21±0.071.22±0.110.0990.980

圖4 各組p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR的Western Blot電泳圖Figure 4 Western Blot electropherograms of p-AMPK，AMPK，p-mTOR，mTOR in various groups of rats

3 討論

放射性腸炎是由于盆腔、腹膜、腹腔惡性腫瘤放療暴露引發(fā)的腸道炎癥反應，約15%接受放療的患者出現慢性腸道疾病[9-10]。放射性腸炎的病理變化主要包括腸道上皮細胞、腺體細胞、血管內皮細胞等受損，引起腸道黏膜炎性浸潤水腫、壞死及纖維化。臨床上常見腹痛、腹瀉、便血、腸梗阻等癥狀，嚴重者可出現腸穿孔、腸瘺、毒血癥。放射性腸炎的發(fā)病機制主要是腸屏障損傷，包括機械屏障、免疫屏障、微生物屏障和化學屏障等，其中，腸道菌群在電離輻射引起的腸損傷的發(fā)展中起著關鍵作用[11]。腹盆腔放療后未分化細胞過度增生、變性及壞死，使腸絨毛表面的細胞供應中斷，腸道微生物失調引起炎癥反應，導致腸上皮層缺失、腸道通透性增加和腸黏膜屏障功能受損[12]。因此，尋找低毒、溫和、高效可修復腸黏膜損傷的藥物對治療放射性腸炎具有重要意義。

黃芪為常見的“托毒排膿、斂瘡生肌”中藥，主要成分包括多糖、類黃酮和皂苷等，具有免疫調節(jié)、抗炎、抗氧化及抗癌等藥理活性[13]。Dong 等[14]研究表明，黃芪多糖可以通過抑制脂多糖（LPS）刺激誘導的有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）/核因子（NK）-κB 炎癥通路的激活而抑制炎性因子和趨化因子產生，減輕小鼠腸道炎癥反應。Zhao等[15]研究顯示，黃芪多糖可抑制炎癥、加速細胞周期、促進修復因子的分泌從而促進傷口愈合。以上研究均證實黃芪多糖具有抗炎作用。本研究結果顯示，放射性腸炎大鼠經黃芪多糖干預后，腸炎癥狀減輕、DAI降低、腸道黏膜通透性減小、小腸黏膜組織炎性因子IL-1β、TNF-α水平降低，且腸黏膜組織病理損傷程度顯著減輕，提示黃芪多糖可減輕炎癥反應，對放射性腸炎大鼠腸黏膜損傷具有修復作用。

AMPK 是由催化性α 亞基和調節(jié)性β、γ 亞基組成的異源三聚體蛋白，發(fā)生缺血、低糖、缺氧等損傷時，AMPK信號通路迅速被激活，補充細胞的ATP供應，是細胞的能量感受器，AMPK通路激活進一步正向調控參與細胞ATP 供應的其他信號通路，在維持腸道上皮細胞屏障功能中起重要作用[16-17]。mTOR 是AMPK 的下游信號分子，AMPK激活后可通過調控mTOR 的磷酸化水平抑制NFκB 炎性信號通路[18]。Yu 等[19]研究顯示，臭氧可通過激活AMPK 通路抑制組織因子觸發(fā)的腸缺血，修復小鼠腸黏膜損傷并有效改善化療性腸炎。Ma等[20]研究顯示，褪黑素通過激活AMPK 通路防止Th17/Treg 失衡而改善壞死性小腸結腸炎。本研究對放射性腸炎大鼠模型應用黃芪多糖、AMPK通路抑制劑復合物C干預后檢測小腸黏膜組織AMPK通路相關蛋白表達水平，結果顯示，復合物C 下調p-AMPK 表達，上調p-mTOR 表達，抑制了AMPK信號通路的激活，黃芪多糖則呈現相反的作用效果，黃芪多糖、復合物C同時干預后，復合物C對AMPK通路的抑制作用被逆轉，提示黃芪多糖可通過調控AMPK 通路修復放射性腸炎大鼠的腸黏膜損傷。

綜上所述，黃芪多糖對放射性腸炎大鼠腸黏膜損傷有明顯的修復作用，可能與調控AMPK 信號通路相關蛋白的表達有關。本研究結果可為黃芪多糖相關藥物的研發(fā)及應用于放射性腸炎的臨床治療提供基礎數據。