天然酵母菌利用海藻酸生成乙醇的代謝機(jī)理研究

張 雯 李 晨 章俊杰 張?jiān)?/p>

(1.浙江樹(shù)人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院,杭州 310015;2.北京化工大學(xué) 圖書(shū)館,北京 100029)

引 言

生物乙醇作為一種可再生的液體清潔能源,近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。相對(duì)于太陽(yáng)能、水能、風(fēng)能等其他可再生能源,生物乙醇可以直接與汽油混合作為汽車(chē)液體能源使用,這對(duì)緩解石油資源緊張、減少燃燒過(guò)程中污染物(碳?xì)浠衔?、一氧化碳、氮氧化物?的排放具有重要意義[1]。然而,生物乙醇的大規(guī)模生產(chǎn)在近年的工業(yè)實(shí)踐中遇到了各種各樣的問(wèn)題,例如以美國(guó)為代表的“玉米乙醇”、以巴西為代表的“甘蔗乙醇”存在“與人爭(zhēng)糧、與糧爭(zhēng)地”的問(wèn)題,因此生物乙醇的生產(chǎn)在全球糧食安全堪憂(yōu)的背景下缺乏發(fā)展的動(dòng)力。纖維素燃料乙醇以資源豐富的秸稈、甘蔗渣和木屑等為原料進(jìn)行生產(chǎn)可以避免上述問(wèn)題,但是較低的乙醇產(chǎn)量以及較高的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境成本迫使人們理性地看待其大規(guī)模發(fā)展[2]。

由于目前糧食與木質(zhì)纖維素在能源化利用過(guò)程中存在諸多問(wèn)題,人們開(kāi)始尋找其替代原料。海藻是可以通過(guò)光合作用產(chǎn)生能量的自養(yǎng)型海洋生物,目前部分海藻可進(jìn)行人工養(yǎng)殖。海藻養(yǎng)殖不占用陸地資源,不存在“與糧爭(zhēng)地”的問(wèn)題;海藻中的糖可通過(guò)簡(jiǎn)單處理而釋放,預(yù)處理成本較纖維素原料低;海藻生長(zhǎng)迅速,通過(guò)光合作用固定二氧化碳,可有效減輕溫室效應(yīng),抑制海水酸化[3]。海藻資源的乙醇能源化應(yīng)用不僅能夠規(guī)避傳統(tǒng)生物乙醇生產(chǎn)的不足,而且還可以帶動(dòng)我國(guó)海域藻類(lèi)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)及海洋生物能源產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

大型海藻中,褐藻可以作為發(fā)酵產(chǎn)乙醇較理想的原料,原因在于:褐藻在人工養(yǎng)殖中的生物量大,技術(shù)成熟;糖含量高(至少50%(基于褐藻干重)),預(yù)處理方法簡(jiǎn)單。但是,目前以褐藻為原料生產(chǎn)生物乙醇存在較大的困難。褐藻中的糖大部分為海藻酸,它是糖醛酸二聚合物的線性高聚物,由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid,簡(jiǎn)稱(chēng)M)和α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronic acid,簡(jiǎn)稱(chēng)G)單元通過(guò)α-1,4-糖苷鍵連接而成,由于海藻酸含有羧基,因此常以海藻酸鹽的形式存在。目前廣泛使用的產(chǎn)乙醇工業(yè)微生物,例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、管囊酵母(Pachysolen tannophilus)和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)等,既不能利用海藻酸也不能同化其降解產(chǎn)物,這個(gè)問(wèn)題成為制約利用褐藻進(jìn)行乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的主要技術(shù)瓶頸。

天然酵母菌中,季也蒙酵母(Meyerozyma guilliermondii)可以利用海藻酸進(jìn)行發(fā)酵生成乙醇,在發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時(shí)間96 h、初始pH為5的條件下,乙醇產(chǎn)率可達(dá)0.154 g/g[4]。季也蒙酵母屬于兼性厭氧微生物,其發(fā)酵條件與傳統(tǒng)的釀酒酵母相似,在工業(yè)應(yīng)用上具有穩(wěn)定性和易操作性[5]。相較于其他海藻酸天然發(fā)酵菌[6-7],季也蒙酵母具有一定的優(yōu)勢(shì):具有較高的乙醇產(chǎn)率和較低的發(fā)酵能耗;所采用的厭氧發(fā)酵過(guò)程不需要改變?cè)械囊掖及l(fā)酵工藝。Wargacki等[8]報(bào)道,以海帶為底物時(shí),季也蒙酵母與基因工程菌(轉(zhuǎn)基因大腸桿菌(transgenicEscherichia coli))的乙醇發(fā)酵產(chǎn)率十分接近。Sudhakar等[9]也證實(shí)利用季也蒙酵母發(fā)酵冬青葉馬尾藻(Sargassum ilicifolium)生產(chǎn)乙醇時(shí),相較于其他常規(guī)酵母(如釀酒酵母),其乙醇產(chǎn)率更高。由此可見(jiàn),這種新型的海藻酸發(fā)酵天然酵母菌具有較好的應(yīng)用潛力,經(jīng)過(guò)優(yōu)化和處理后,乙醇得率會(huì)有更大的提升,有可能成為海藻工業(yè)化生產(chǎn)乙醇的優(yōu)良菌種。

季也蒙酵母作為一種非常規(guī)酵母菌,具有廣泛碳源(如各種糖類(lèi)、脂肪酸,甚至烷烴)的代謝能力,可以生成醇類(lèi)、有機(jī)酸等各種產(chǎn)物,但是其代謝機(jī)理目前并未完全清晰[10]。有研究[11-12]證實(shí),季也蒙酵母可以產(chǎn)生多種酶,如淀粉酶、乙醇脫氫酶、鼠李糖苷酶、菊糖酶等,其碳源代謝過(guò)程中的具體代謝路徑也有多種,如EMP途徑(Embden-Meyerhof-Parnas pathway)、戊糖磷酸途徑(pentose phosphate pathway)、莽草酸途徑(shikimate pathway)、三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle)等。本課題組在之前的研究[5]中證實(shí),在發(fā)酵海藻酸生成乙醇的過(guò)程中季也蒙酵母能同時(shí)產(chǎn)生海藻酸裂解酶和乙醇脫氫酶。然而,其利用海藻酸生成乙醇的代謝機(jī)理尚未探明,能源物質(zhì)形成和積累的機(jī)制還有待研究,尤其是影響乙醇產(chǎn)率的關(guān)鍵代謝步驟尚不明確。因此,本文考察了不同碳源對(duì)季也蒙酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響,監(jiān)測(cè)了乙醇發(fā)酵過(guò)程中重要中間代謝產(chǎn)物含量的動(dòng)態(tài)變化,提出了天然酵母菌轉(zhuǎn)化海藻酸生成乙醇的代謝途徑并進(jìn)行了初步驗(yàn)證,以期為利用褐藻生產(chǎn)生物乙醇提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

季也蒙酵母,實(shí)驗(yàn)室保存;甘露糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)、古洛糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥97%)、乙醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.9%)、丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)、3-磷酸甘油醛標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥97%)、乙醛標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%),Sigma公司;海藻酸鈉、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、丙酮酸、甘露糖醛酸、古洛糖醛酸、乙醛、濃硫酸、碳酸鋇、乙二胺四乙酸(EDTA),均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;超純水,由Milli-Q IQ 7000型純水機(jī)(德國(guó)默克密理博公司)制備。

活化培養(yǎng)基:硫酸銨10.8 g/L,磷酸二氫鉀5.0 g/L,硫酸鎂1.1 g/L,海藻酸鈉10 g/L;發(fā)酵培養(yǎng)基:硫酸銨10.8 g/L,磷酸二氫鉀5.0 g/L,硫酸鎂1.1 g/L,不同碳源,調(diào)節(jié)pH=5。

高效液相色譜儀(LC-10ADVP型)、氣相色譜儀(GC17A型),日本島津公司;恒溫?fù)u床(ISF-7100型),韓國(guó)杰奧特公司。

1.2 天然酵母菌的可代謝底物檢測(cè)

1.2.1 海藻酸鈉的多級(jí)高溫酸解

稱(chēng)取2.0 g海藻酸鈉(精確至0.000 1 g),加入20 mL 70%的濃硫酸,混合均勻后在研缽中研磨,然后加入蒸餾水250 mL,在沸水浴中加熱,于不同時(shí)間(0.5～3 h)取樣,分析酸解產(chǎn)物。

1.2.2 酸解產(chǎn)物分析[13]

將上述海藻酸鈉的多級(jí)高溫酸解產(chǎn)物冷卻至室溫,用碳酸鋇調(diào)節(jié)pH至7左右,離心,沉淀,用蒸餾水洗滌3次。合并上清液與洗滌液,濃縮,經(jīng)DOWEX 1-X8型陰離子交換樹(shù)脂柱層析,用1 mol/L乙酸溶液以2 mL/min的速度進(jìn)行洗脫。收集洗脫液,濃縮,定容至5 mL,使用高效液相色譜儀測(cè)定古洛糖醛酸和甘露糖醛酸的含量。色譜柱為Agilent zorbax sax陰離子交換柱,柱溫40℃,流動(dòng)相為0.5 mol/L乙酸,流速1.0 mL/min。另外用梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到如下線性回歸方程,以此計(jì)算古洛糖醛酸和甘露糖醛酸的濃度。

古洛糖醛酸:Y=67 882X-10 456

甘露糖醛酸:Y=40 125X-4 356

式中:Y為色譜峰面積;X為古洛糖醛酸或甘露糖醛酸的質(zhì)量濃度,mg/mL。按照下式計(jì)算古洛糖醛酸和甘露糖醛酸的含量。

式中:c為古洛糖醛酸或甘露糖醛酸的含量,ρ為古洛糖醛酸或甘露糖醛酸的質(zhì)量濃度,N為稀釋倍數(shù),ma為海藻酸鈉的質(zhì)量。

1.3 不同底物的發(fā)酵試驗(yàn)

分別以海藻酸鈉的多級(jí)酸解產(chǎn)物、甘露糖醛酸、古洛糖醛酸、丙酮酸、乙醛為碳源,配制發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL(碳源的質(zhì)量濃度為10 g/L),若出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制,則調(diào)節(jié)丙酮酸和乙醛的濃度。將季也蒙酵母菌從固體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移至液體活化培養(yǎng)基中,于30℃、160 r/min下培養(yǎng)48 h,然后以10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量將菌種轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中。將裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶(在棉塞外用保鮮膜密封瓶口)放置在恒溫?fù)u床中,于30℃、160 r/min下進(jìn)行發(fā)酵。

利用氣相色譜法測(cè)定乙醇濃度。色譜柱為SGE AC-10型氣相毛細(xì)管柱,柱溫180℃,檢測(cè)器溫度180℃,氣化室溫度180℃,載氣氫氣流量30 mL/min。另外用梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到如下線性回歸方程,以此計(jì)算乙醇濃度。

Y=1.056 1X-0.634 2

式中:X為乙醇的質(zhì)量濃度,mg/L。按照下式計(jì)算乙醇產(chǎn)率。

y=ρeVf/mc

式中:y為乙醇產(chǎn)率,ρe為乙醇的質(zhì)量濃度,Vf為發(fā)酵液體積,mc為碳源質(zhì)量。

1.4 海藻酸發(fā)酵生產(chǎn)乙醇過(guò)程中間代謝產(chǎn)物含量測(cè)定

以海藻酸鈉為碳源配制發(fā)酵培養(yǎng)基,接種菌種,進(jìn)行發(fā)酵。將發(fā)酵液離心,倒掉上層液,水洗后收集干凈菌體,采用常規(guī)的高氯酸提取法(高氯酸的濃度為0.5 mol/L)對(duì)酵母細(xì)胞中的代謝物進(jìn)行提取,然后利用高效液相色譜法測(cè)定不同時(shí)間(6～108 h)的代謝物的含量變化。色譜柱為Hi-Plex H型液相柱,柱溫50℃,以水和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,流速0.6 mL/min。另外用梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到如下線性回歸方程,以此計(jì)算有機(jī)物的濃度變化。

丙酮酸:Y=6 179.3X-978.6

3-磷酸甘油醛:Y=1 029.1X-314.2

式中:X為丙酮酸或3-磷酸甘油醛的濃度,mmol/L。然后將濃度單位換算為mg/L。

利用不分流進(jìn)樣氣相色譜法測(cè)定不同時(shí)間的發(fā)酵液中乙醛的濃度。色譜柱為SGE AC-10型氣相毛細(xì)管柱,進(jìn)樣口溫度150℃,載氣流速5 mL/min,檢測(cè)溫度50℃,氫氣流量40.0 mL/min,空氣流量400.0 mL/min;升溫程序:起始溫度40℃,以10℃/min的速度升溫至80℃,保持5 min,然后以10℃/min的速度升溫至150℃,保持5 min。另外用梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到如下線性回歸方程,以此計(jì)算乙醛濃度。

Y=0.131 2X-0.299 8

式中:X為乙醛的質(zhì)量濃度,mg/L。

1.5 酵母細(xì)胞生物量測(cè)定

利用細(xì)胞干重法測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間的酵母細(xì)胞生物量。吸取待測(cè)培養(yǎng)液放入離心管中,反復(fù)離心,用清水洗滌3次。于80℃真空干燥,稱(chēng)重,按照下式計(jì)算酵母細(xì)胞生物量。

C=m/V

式中:C為酵母細(xì)胞生物量,m為細(xì)胞質(zhì)量,V為取樣體積。

1.6 天然酵母菌轉(zhuǎn)化海藻酸生成乙醇的代謝途徑模型驗(yàn)證

通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加或減少特殊物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),判斷其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及乙醇產(chǎn)率的影響。在發(fā)酵液中加入EDTA(0～1 mmol/L),或者改變發(fā)酵液中硫酸鎂的質(zhì)量濃度(0.2～1.2 g/L),其他試驗(yàn)條件不變,發(fā)酵時(shí)間為96 h,測(cè)定乙醇產(chǎn)率和酵母細(xì)胞生物量。

2 結(jié)果與討論

2.1 天然酵母菌的可代謝底物測(cè)定及發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

為了研究海藻酸在季也蒙酵母體內(nèi)的代謝途徑,首先應(yīng)明確季也蒙酵母可以進(jìn)行代謝的海藻酸前體物類(lèi)型。本文制備了海藻酸在不同時(shí)間的酸解產(chǎn)物,測(cè)定其中甘露糖醛酸M和古洛糖醛酸G的含量,結(jié)果如圖1所示。隨著酸解時(shí)間的延長(zhǎng),兩種糖醛酸單體M和G的含量均升高,表明在不同降解時(shí)間下海藻酸的裂解程度不同,并且在酸解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生寡聚海藻酸,這與Lee等[6]的研究結(jié)果類(lèi)似。

圖1 不同時(shí)間下海藻酸鈉酸解生成的M和G單體的含量Fig.1 Contents of M and G monomers generated by acid hydrolysis of sodium alginate at different times

分別以海藻酸鈉在不同時(shí)間的酸解產(chǎn)物、M單體、G單體為碳源進(jìn)行發(fā)酵,測(cè)定乙醇產(chǎn)率,結(jié)果如圖2所示。以M和G單體為碳源時(shí),乙醇產(chǎn)率較高,表明季也蒙酵母可以直接利用這兩種單體進(jìn)行乙醇發(fā)酵。還可以看出,并非酸水解的時(shí)間越長(zhǎng),乙醇產(chǎn)率越高。依據(jù)本課題組之前的研究[5],季也蒙酵母能夠產(chǎn)生胞外海藻酸裂解酶,可以對(duì)海藻酸進(jìn)行分解。由于海藻酸裂解酶的作用特異性,會(huì)生成在C4和C5之間形成雙鍵的不飽和產(chǎn)物[14],這種非還原性末端含有不飽和雙鍵的結(jié)構(gòu)或許更容易被利用。

圖2 季也蒙酵母利用不同碳源進(jìn)行發(fā)酵的乙醇產(chǎn)率Fig.2 Ethanol yield of M.guilliermondii fermented with different carbon sources

此外,本文還測(cè)定了以10 g/L丙酮酸和乙醛為碳源的乙醇產(chǎn)率,發(fā)現(xiàn)此時(shí)基本不產(chǎn)乙醇,這是因?yàn)?0 g/L丙酮酸和乙醛對(duì)季也蒙酵母的生長(zhǎng)產(chǎn)生了較強(qiáng)的抑制作用。因此本文降低了二者的濃度再次進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果表明:當(dāng)丙酮酸的質(zhì)量濃度降至4.5 g/L時(shí),乙醇產(chǎn)率僅為0.031 g/g;當(dāng)乙醛的質(zhì)量濃度降至1.5 g/L時(shí),乙醇產(chǎn)率為0.042 g/g。結(jié)果說(shuō)明直接以這兩種中間代謝產(chǎn)物為碳源,會(huì)導(dǎo)致糖的代謝前端產(chǎn)物缺乏,由于細(xì)胞中沒(méi)有產(chǎn)生足夠的還原型輔酶Ⅰ(NADH),因此乙醛無(wú)法作為電子受體大量轉(zhuǎn)化為乙醇。

2.2 海藻酸發(fā)酵生產(chǎn)乙醇過(guò)程中重要中間代謝產(chǎn)物含量的動(dòng)態(tài)變化

通過(guò)化學(xué)分析手段對(duì)海藻酸代謝產(chǎn)生的中間產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),了解其含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,以分析季也蒙酵母的海藻酸代謝路徑。

2.2.1 丙酮酸濃度和3-磷酸甘油醛濃度的動(dòng)態(tài)變化

圖3為酵母細(xì)胞中中間代謝產(chǎn)物(丙酮酸和3-磷酸甘油醛)的質(zhì)量濃度和酵母細(xì)胞生物量隨時(shí)間的變化。丙酮酸是多種酵母菌在乙醇發(fā)酵過(guò)程中的重要中間體,也是許多其他代謝產(chǎn)物如乳酸、檸檬酸等有機(jī)酸的前體物質(zhì)。在乙醇發(fā)酵過(guò)程中,細(xì)胞中的丙酮酸濃度與發(fā)酵菌種、發(fā)酵條件及外源添加物有關(guān)?？梢钥闯?隨著發(fā)酵的進(jìn)行,丙酮酸的質(zhì)量濃度先升高后降低,其變化規(guī)律與酵母細(xì)胞生物量相似,并且丙酮酸質(zhì)量濃度的峰值出現(xiàn)在酵母的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定生長(zhǎng)期之間,說(shuō)明丙酮酸的質(zhì)量濃度與酵母活性相關(guān)。

圖3 酵母細(xì)胞中中間代謝產(chǎn)物(丙酮酸和3-磷酸甘油醛)的質(zhì)量濃度及酵母細(xì)胞生物量的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of the mass concentration of intermediate metabolites(pyruvic acid and glyceraldehyde 3-phosphate)in yeast cells and the yeast cell biomass

3-磷酸甘油醛是生物體內(nèi)糖原或淀粉酵解過(guò)程中的重要中間產(chǎn)物,可由糖磷酸化及異構(gòu)化的產(chǎn)物磷酸果糖裂解產(chǎn)生,3-磷酸甘油醛可以與磷酸二羥丙酮在磷酸丙酮異構(gòu)酶的催化下相互轉(zhuǎn)變,且后續(xù)可在3-磷酸甘油醛脫氫酶的作用下生成1,3-二磷酸甘油酸,并最終由烯醇化酶和丙酮酸激酶催化反應(yīng)形成丙酮酸。由圖3可以看出,作為生成丙酮酸的前體物質(zhì),3-磷酸甘油醛在酵母細(xì)胞中的質(zhì)量濃度變化規(guī)律與丙酮酸較為接近。但相較于丙酮酸,3-磷酸甘油醛的質(zhì)量濃度變化較小,保持較為穩(wěn)定的狀態(tài),原因可能是3-磷酸甘油醛的轉(zhuǎn)化過(guò)程始終處于平衡狀態(tài)。

2.2.2 發(fā)酵液中乙醛濃度的動(dòng)態(tài)變化

乙醛是乙醇發(fā)酵過(guò)程中的一種中間產(chǎn)物,它是由丙酮酸在丙酮酸脫羧酶的作用下產(chǎn)生的,同時(shí)又會(huì)在乙醇脫氫酶的催化作用下轉(zhuǎn)化為乙醇,因此它的濃度積累與最終的乙醇發(fā)酵效率密切相關(guān)。由于乙醛的分子量較小,它可以通過(guò)自由擴(kuò)散的方式穿過(guò)細(xì)胞膜,因此本研究中檢測(cè)的是發(fā)酵液中乙醛的濃度,結(jié)果如圖4所示。在發(fā)酵過(guò)程中,乙醛的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì):在發(fā)酵初期,隨著酵母菌的繁殖,乙醛的質(zhì)量濃度迅速升高;隨后酵母菌生長(zhǎng)進(jìn)入平穩(wěn)期,乙醛的質(zhì)量濃度逐漸降低直到發(fā)酵末期。

圖4 發(fā)酵液中乙醛質(zhì)量濃度的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of acetaldehyde mass concentration in the fermentation broth

此外,本文還檢測(cè)了發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的其他一些常見(jiàn)的有機(jī)物,如甘油、甲酸、乳酸、乙酸等,但均未能檢出,原因可能是:這些物質(zhì)的濃度較低,低于檢測(cè)限;其代謝速度較快,未能積累;在海藻酸向乙醇的代謝過(guò)程中未產(chǎn)生。

2.3 海藻酸代謝途徑模型建立及初步驗(yàn)證

根據(jù)本文的研究結(jié)果,同時(shí)結(jié)合本課題組的前期研究[5],對(duì)海藻酸的代謝途徑進(jìn)行了推測(cè),結(jié)果如圖5所示。海藻酸代謝過(guò)程的基本途徑為:天然酵母菌產(chǎn)生胞外海藻酸裂解酶,將海藻酸裂解成寡聚海藻酸,隨后其進(jìn)一步降解為低聚體;進(jìn)入酵母菌細(xì)胞后,低聚體轉(zhuǎn)化為糖醛酸單體等前體物質(zhì),隨后轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛、丙酮酸等中間產(chǎn)物,然后在丙酮酸脫羧酶及乙醇脫氫酶的作用下,最終生成乙醇。其中,海藻酸裂解和丙酮酸脫羧是海藻酸代謝過(guò)程的關(guān)鍵步驟。本文所推測(cè)的天然酵母菌的海藻酸代謝途徑與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的研究結(jié)果較為接近,即在碳源進(jìn)入細(xì)胞前,都是通過(guò)海藻酸裂解酶的作用實(shí)現(xiàn)海藻酸的裂解。但該基因工程菌的胞內(nèi)糖代謝過(guò)程明確為部分細(xì)菌體內(nèi)進(jìn)行乙醇代謝的Entner-Doudoroff(ED)途徑。ED途徑是存在于缺乏完整EMP途徑的微生物(主要是細(xì)菌)中的一種替代途徑,而季也蒙酵母可進(jìn)行完整的EMP途徑代謝[12],因此推測(cè)酵母菌體內(nèi)的糖代謝過(guò)程與該基因工程菌不同,可能為EMP途徑或者部分ED、部分EMP途徑,這一點(diǎn)在今后的研究中還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖5 海藻酸代謝途徑模型Fig.5 Metabolic pathway model for alginate

為了驗(yàn)證上述海藻酸的代謝過(guò)程,本文進(jìn)行了EDTA添加試驗(yàn)和鎂離子濃度控制試驗(yàn),結(jié)果分別如圖6和圖7所示。由圖6可以看出,隨著體系中EDTA濃度的增加,乙醇產(chǎn)率和酵母細(xì)胞生物量均明顯降低。當(dāng)EDTA的濃度為1 mmol/L時(shí),與不添加EDTA的體系相比,發(fā)酵96 h的酵母細(xì)胞生物量減少了46.7%,乙醇產(chǎn)率降低了61%。EDTA的添加可影響體系中還原糖的濃度,延緩微生物的生長(zhǎng),降低乙醇發(fā)酵產(chǎn)率。而本課題組的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)EDTA還能夠降低海藻酸裂解酶的酶活力[15],這可能是EDTA的添加影響酵母菌利用海藻酸代謝生成乙醇的主要原因。由圖7可以看出,鎂離子濃度也影響乙醇發(fā)酵過(guò)程,隨著鎂離子質(zhì)量濃度的增加,乙醇產(chǎn)率和酵母細(xì)胞生成量均增加。鎂離子是酵母菌胞內(nèi)的酶(如丙酮酸脫羧酶等)的重要輔助因子,在海藻酸代謝生成乙醇的過(guò)程中,這些酶也可能發(fā)揮重要作用。在發(fā)酵過(guò)程中,可以通過(guò)調(diào)節(jié)鎂離子濃度來(lái)提高酵母的活性,促進(jìn)酵母對(duì)糖的吸收和利用,從而增加乙醇產(chǎn)率和酵母細(xì)胞生成量。

圖6 EDTA對(duì)海藻酸發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響Fig.6 Effect of EDTA on ethanol production by alginate fermentation

圖7 鎂離子對(duì)海藻酸發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響Fig.7 Effect of Mg2+on ethanol production by alginate fermentation

3 結(jié)論

通過(guò)測(cè)定季也蒙酵母的可代謝前體物對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響以及關(guān)鍵中間產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化,建立了酵母菌代謝海藻酸生成乙醇的路徑模型并進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,推測(cè)海藻酸的代謝途徑為:酵母菌產(chǎn)生胞外海藻酸裂解酶,將海藻酸裂解為寡聚海藻酸,隨后進(jìn)一步降解為低聚體;進(jìn)入酵母菌細(xì)胞后,低聚體轉(zhuǎn)化為糖醛酸單體等前體物質(zhì),隨后轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛、丙酮酸等中間產(chǎn)物,然后在丙酮酸脫羧酶及乙醇脫氫酶的作用下,最終生成乙醇。由于海藻酸的代謝過(guò)程非常復(fù)雜,其涉及的各級(jí)產(chǎn)物及調(diào)控環(huán)節(jié)遠(yuǎn)未明確,因此本研究仍然存在局限。今后將進(jìn)一步細(xì)化各相關(guān)中間步驟的研究,并重點(diǎn)分析“環(huán)境-底物-菌”之間的相互作用,以期能夠設(shè)計(jì)出適用于工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)路線。