電針調(diào)控CASP-1/GSDMD細(xì)胞焦亡信號通路對抑郁癥小鼠干預(yù)機(jī)制

田丹丹，楊 陽

(西北婦女兒童醫(yī)院中醫(yī)科，陜西 西安 710061)

抑郁癥是危害人類健康的重大精神疾病之一，其發(fā)病率增長過快，對社會和家庭造成了不可估量的損失,其特征是情緒持續(xù)低落、反復(fù)出現(xiàn)死亡和自殺念頭、社會孤立感和快感缺乏[1]。常常伴隨興趣降低或喪失、睡眠障礙、消化功能減弱、自殺傾向等表現(xiàn)。

抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，在抑郁癥的機(jī)制研究中，主要包括神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)、海馬神經(jīng)發(fā)生障礙、突觸可塑性受損及神經(jīng)炎癥等假說。越來越多的研究證實(shí)，神經(jīng)炎癥是抑郁癥發(fā)病的重要機(jī)制。近年來，針灸通過改善神經(jīng)炎癥發(fā)揮抗抑郁作用受到人們廣泛關(guān)注。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)的固有免疫細(xì)胞，大量研究提示，神經(jīng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生與激活的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞關(guān)系最為密切，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞會產(chǎn)生大量的促炎因子，致使神經(jīng)元功能受損，引起CNS疾病[2]。有研究表明，病理情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)及功能受到損害，可導(dǎo)致相關(guān)的突觸可塑性損傷和神經(jīng)炎癥，引發(fā)抑郁癥。該研究結(jié)果提示，小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化，引起的炎性反應(yīng)在抑郁癥病理過程中具有重要作用。因此，抑郁癥可被看作“小膠質(zhì)細(xì)胞疾病”[3]。研究證實(shí)，應(yīng)激通過活化小膠質(zhì)細(xì)胞中的NLRP3炎性小體，激活下游的半胱天冬蛋白酶(Caspase，CASP-1)，進(jìn)而釋放白介素(Interleukin，IL)-1β、IL-18，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡的發(fā)生，進(jìn)而介導(dǎo)相關(guān)免疫炎性反應(yīng)。

目前，針灸調(diào)節(jié)抑郁癥是否通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的過度神經(jīng)炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞焦亡發(fā)揮作用尚未有報(bào)道。但有研究已證實(shí)，針灸對炎性反應(yīng)以及炎癥細(xì)胞因子，有一定的調(diào)控作用，提示調(diào)節(jié)相關(guān)炎性信號通路可能是針灸治療抑郁癥的重要效應(yīng)機(jī)制[4]。本研究通過腹腔注射利血平(Respine，RESP)成功建立急性抑郁小鼠模型，以CASP-1/GSDMD細(xì)胞焦亡信號通路為切入點(diǎn)，觀察電針干預(yù)對急性抑郁小鼠行為學(xué)、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘及CASP-1/GSDMD細(xì)胞焦亡信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究電針治療抑郁癥的機(jī)制提供新的方向。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性6～8周齡C57BL/6小鼠共領(lǐng)取3批，每批8只，體重約為20～25 g，飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)藥理學(xué)教研室動物房。動物領(lǐng)取后進(jìn)行隨機(jī)化分組喂養(yǎng)，室內(nèi)溫度穩(wěn)定在20～25 ℃，濕度穩(wěn)定在50%左右，光照12 h晝夜循環(huán)，在開始實(shí)驗(yàn)前將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，在實(shí)驗(yàn)過程中保持所有動物自由活動。之后進(jìn)行的行為學(xué)檢測全部在上午實(shí)施。本次實(shí)驗(yàn)動物的使用及所有的實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)過空軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 全自動多功能酶標(biāo)儀(德國 Thermo 公司)；全自動電泳儀(廣州科昊公司)；Bio-Rad 680 酶標(biāo)儀(美國 BioRad 公司)；冰凍切片機(jī)(德國 Leica 公司)；Tanon4200 發(fā)光成系統(tǒng)(上海 Tanon 公司)；氟西汀(美國 Selleck 公司)；RESP (美國 Sigma 公司)；Mouse anti-β-actin(美國 Sigma 公司)；Rat anti-CASP-1 (美國 Abcam 公司)；Rat anti-IL-1β (美國 Abcam 公司)；Mouse anti-Iba-1 (美國 Abcam 公司)；Rat anti-GSDMD (美國 CST 公司)。

1.3 配制溶液 ①制備轉(zhuǎn)膜液：在天平上稱3.03 g的Tris以及14.4 g的甘氨酸放置在器皿中，加入去離子水使其溶解，然后定容至800 ml，最后加入200 ml甲醇，充分混勻備用。②制備麗春紅溶液：在天平上稱取0.2 g麗春紅放置于器皿中，加去離子水使其溶解，然后用量筒定容至90 ml，最后倒入約10 ml冰乙酸充分混勻，常溫保存?zhèn)溆?。③制備PBST緩沖液：用器皿制備500 ml PBS緩沖液，然后往其中加入500 μl吐溫-20，充分混勻待用。④備牛奶封閉液：將100 ml的PBST緩沖液放置于器皿中，放在搖床上左右擺動，緩慢往其中加5 g脫脂奶粉，混勻至沒有顆粒感。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 建立動物模型及其分組：①動物分組：C57BL/6小鼠隨機(jī)分成四組：空白組、模型組、氟西汀組、電針組，氟西汀(20 mg/kg)作為陽性抗抑郁藥連續(xù)治療7 d，每組各8只小鼠。②建立急性抑郁小鼠模型：參考相關(guān)文獻(xiàn)，用濃度為0.5%冰醋酸制備1 mg/ml的RESP溶液，連續(xù)3 d腹腔注射1 mg/ml的RESP溶液建立急性抑郁小鼠模型。然后進(jìn)行行為學(xué)檢測，檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠裰苽涑晒5]。

1.4.2 針刺方法：按照相關(guān)動物穴位圖譜選取“百會”和“內(nèi)關(guān)”穴，用一次性使用無菌針灸針0.18 mm×10 mm進(jìn)行針刺[6]。針刺完成后，接通電針儀的電源連接在針柄上，電針時間15 min，強(qiáng)度為0.3 mA，以小鼠肌肉輕度抽搐為標(biāo)準(zhǔn)對小鼠進(jìn)行電針治療。電針結(jié)束后，小鼠恢復(fù)30 min后，再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。電針組小鼠連續(xù)治療7 d。

1.4.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)被用來評估絕望行為，作為最廣泛使用的抗抑郁作用測試方法之一。在水溫為23～25 ℃的條件下，將各組小鼠分別置于一個高25 cm、直徑10 cm、深11 cm的玻璃容器中，強(qiáng)迫小鼠游泳6 min，在測試的最后4 min記錄總的不動時間。當(dāng)小鼠停止游泳保持不動，頭露出水面的時間被認(rèn)為是不動時間。容器里的水在每只小鼠測試完進(jìn)行更換。

1.4.4 懸尾實(shí)驗(yàn)：尾懸實(shí)驗(yàn)在安靜的房間中進(jìn)行。每只小鼠被懸掛在離地面50 cm的地方，用一小塊膠布黏在小鼠尾巴末端2 cm處將其粘在橫桿上，小鼠的視野被一道屏障擋著。懸尾實(shí)驗(yàn)持續(xù)6 min，在實(shí)驗(yàn)的最后4 min記錄總靜止時間。當(dāng)小鼠表現(xiàn)出絕望時，它們就被認(rèn)為是靜止不動的。在這種情況下，小鼠停止掙扎以克服這種不正常的姿勢，經(jīng)過一段時間的掙扎活動后，幾乎不動或完全不動。

1.4.5 高爾基染色法：制備高爾基染色液，室溫避光保存，備用。小鼠處死后快速取出全腦，浸于高爾基染色工作液中，室溫浸染12 d(需避光)；去離子水漂洗2次(5 min)；乙醇梯度脫水：70%乙醇24 h，80%乙醇8 h，90%乙醇6 h，95%乙醇5 h，無水乙醇2 h。乙醇和乙醚1∶1混合液中脫水；振動切片機(jī)切取含有海馬區(qū)腦片(在去離子水中切)，厚度120 μm，將切好的腦片放置在去離子水中，備用；將腦片在去離子水中漂洗10 min，70%、96%和100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明30 s(漂洗時需震蕩，最后乙醇脫水后先放到載玻片，等乙醇揮發(fā)后滴上甲苯，再加入中性樹膠)；中性樹膠封片(滴在腦片的兩側(cè)，注意避免氣泡)，顯微鏡明場下觀察樹突棘密度；整理每組小鼠CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘的數(shù)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.6 冰凍病理切片制備：行為學(xué)檢測結(jié)束后，每組隨機(jī)進(jìn)行心臟灌注，取出全腦放于裝有多聚甲醛的EP管中，4 ℃放置8 h，然后放置于20%和30%蔗糖水中脫水，最后冰凍切片機(jī)切片，收集腦片，4 ℃保存，免疫熒光染色備用。

1.4.7 免疫熒光：將腦片用含0.3% Triton X-100的濾過的PBS液打孔30 min；打孔完成后，將各組腦片加入標(biāo)記好的24孔板中，加入正常山羊血清封閉液，常溫1 h封閉；封閉完成，吸走封閉液，按照相應(yīng)比例，配制一抗，每孔加入配制好的一抗，放4 ℃冰箱過夜。次日，繼續(xù)孵二抗；將24孔板從4 ℃冰箱取出，放在搖床上搖40 min至2 h進(jìn)行復(fù)蘇；將腦片用濾過的PBS液在打孔板里洗3次×7 min/次；用濾過的PBS為基礎(chǔ)液，按照一定比例，避光配制熒光二抗，避光置于室溫1 h；將腦片用濾過的PBS液在打孔板里洗3次×7 min/次；進(jìn)行貼片，將載玻片按不同的實(shí)驗(yàn)組做好標(biāo)記，再將所有腦片按序貼于載玻片上，稍晾干后，50%的甘油封片，4 ℃避光保存；顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4.8 Western blot檢測：①樣品制備：將標(biāo)本從-80 °C冰箱取出后置于冰上，組織稱重，按組織重量(g)與裂解液體積(ml)為1∶9的比例加入裂解液(RIPA 裂解液+1%蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑，使得最終濃度為1 mmol/L)。用電動組織勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，勻漿每次進(jìn)行10 s，間隔10 s重復(fù)操作，直至無肉眼可見組織碎片即可。將組織勻漿后放于1.5 ml的EP管中，離心機(jī)(12000 r/min，4 ℃)離心20 min后，吸取上清液。蛋白定量：準(zhǔn)備好BCA工作液(A液∶B液=50∶1)于室溫備用，用超純水將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為7個梯度，加入96孔板，做復(fù)孔。再用超純水將上清按原液、1∶5、1∶10、1∶20、1∶50的梯度稀釋，加入96孔板，做復(fù)孔，混勻后于37 ℃孵育30 min。開啟酶標(biāo)儀，讀取OD值。②按操作流程進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉、染色、一抗和二抗。③使用多功能分子成像儀進(jìn)行顯影讀條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入GraphPad Prism 7.03和SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠不動時間比較 懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1A)，與空白組相比，模型組小鼠的不動時間明顯增加(P<0.001)。與模型組相比，電針組小鼠不動時間顯著減少(P<0.05)；氟西汀組與電針組結(jié)果相似(P<0.01)。在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中(圖1B)，與空白組相比，模型組小鼠的不動時間明顯增加(P<0.001)。與模型組相比，電針組小鼠不動時間減少(P<0.001)，氟西汀組與電針組結(jié)果相似，小鼠不動時間顯著減少(P<0.001)。

A：在懸尾實(shí)驗(yàn)中每組小鼠的不動時間； B：在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中每組小鼠的不動時間。與空白組比較，*P<0.001；與模型組比較，#P<0.05，$P<0.01，&P<0.001

2.2 各組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度的比較 研究證實(shí)，抑郁癥的發(fā)生伴隨著突觸可塑性的異常改變，表現(xiàn)為海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度的減少[7]。在利血平誘導(dǎo)的急性抑郁小鼠模型中，我們評估電針干預(yù)是否可逆轉(zhuǎn)抑郁小鼠海馬CA1區(qū)樹突棘密度的減少。對CA1區(qū)錐體神經(jīng)元進(jìn)行高爾基染色用來評估樹突棘密度的變化(圖2A)。與空白組相比，模型組小鼠海馬CA1區(qū)樹突棘密度顯著減少(P<0.001)；與模型組比較，電針組小鼠海馬CA1區(qū)樹突棘密度顯著增加(P<0.05)，氟西汀組與電針組結(jié)果相似(P<0.01)(圖2B)。

A：用于樹突棘密度計(jì)算的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元高爾基染色的代表性標(biāo)本； B：各組樹突棘的代表性圖像(左)，各組樹突棘密度計(jì)數(shù)(右)。與正常組比較，*P<0.001；與模型組比較，#P<0.05，$P<0.01

2.3 各組小鼠海馬腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)比較 在抑郁癥的病理過程中，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞引發(fā)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)至關(guān)重要[8]。采用免疫熒光技術(shù)觀察小鼠海馬區(qū)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞情況。Iba-1是小膠質(zhì)細(xì)胞激活的特異性標(biāo)志物[9]。與空白組相比，模型組小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1表達(dá)升高，胞體增大、突起長度減小、細(xì)胞數(shù)量增加；與模型組相比，電針組小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1的表達(dá)降低，氟西汀組與電針組有相似作用。見圖3。

Iba-1 用紅色標(biāo)記，細(xì)胞核用藍(lán)色標(biāo)記，標(biāo)尺=100 μm

2.4 各組小鼠CASP-1/GSDMD細(xì)胞焦亡信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 在抑郁癥的發(fā)展過程中，CASP-1/GSDMD細(xì)胞焦亡信號通路被激活是一個潛在的研究機(jī)制[10]。Western blot結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組CASP-1、GSDMD、IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.001)；與模型組比較，電針組CASP-1、GSDMD、IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，氟西汀組CASP-1、GSDMD、IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。見圖4。

A：各組CASP-1、GSDMD、IL-1β蛋白表達(dá)水平；B、C、D：各組CASP-1、GSDMD、

2.5 實(shí)驗(yàn)機(jī)制圖 電針通過抑制CASP-1/GSDMD細(xì)胞焦亡信號通路和小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，降低神經(jīng)炎癥，緩解RESP誘導(dǎo)的急性抑郁小鼠模型抑郁樣行為，發(fā)揮抗抑郁作用(圖5)。

圖5 實(shí)驗(yàn)機(jī)制圖

3 討 論

抑郁癥在中醫(yī)學(xué)中屬“郁證”范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中將情志活動歸于五臟，督脈與腦在經(jīng)絡(luò)上有直接聯(lián)系，本著“經(jīng)脈所過，主治所及”的治療原則，督脈腧穴用于治療腦病[15]。針灸治療抑郁癥是以臟腑和經(jīng)脈理論為指導(dǎo)，以調(diào)神解郁、疏利氣機(jī)、調(diào)暢情志為原則，取督脈、手足厥陰、手少陰經(jīng)穴為主[16-17]。百會穴，又名三陽五會，為督脈與手足三陽經(jīng)及足厥陰經(jīng)之會，位于巔頂，屬于督脈，內(nèi)通于腦，不僅有調(diào)神之功，還能宣陽開郁。針刺百會穴可以起到醒腦利竅、通督調(diào)神的功效。內(nèi)關(guān)穴屬于手厥陰心包經(jīng)，為本經(jīng)絡(luò)穴，又通陰維脈，為八脈交會穴之一，既寧心安神又能疏通氣血、寬胸理氣，在抑郁癥的治療中被大量應(yīng)用[17]。本研究選用電針“百會”“內(nèi)關(guān)”，探究電針治療對急性抑郁小鼠的作用及可能機(jī)制。本研究采用懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)觀察抑郁癥小鼠的抑郁樣行為，結(jié)果顯示，模型組小鼠不動時間顯著增加，說明抑郁癥模型成功；相較于模型組，電針組及氟西汀組不動時間明顯縮短，說明電針干預(yù)可改善抑郁癥小鼠抑郁樣行為。

研究表明，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞廣泛參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能，除了對神經(jīng)元的營養(yǎng)支持外，小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦的駐留免疫細(xì)胞，具有消除或修剪脆弱和異常突觸的功能[12]。有害刺激可觸發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子誘導(dǎo)炎癥攻擊、突觸神經(jīng)元損傷[11-18]。在遭受心理社會應(yīng)激動物的邊緣腦區(qū)觀察到活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，在抑郁患者的死后腦組織中，Iba-1陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較高[19]。長期給予小膠質(zhì)細(xì)胞活化抑制劑米諾環(huán)素完全消除了外周炎癥對突觸可塑性的影響，表明小膠質(zhì)細(xì)胞在應(yīng)激下可塑性的動態(tài)變化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[20]。本研究顯示，與正常組相比較，模型組小鼠海馬、CA1區(qū)樹突棘密度顯著減少，說明抑郁小鼠海馬突觸可塑性損傷。與模型組比較，電針組及氟西汀組小鼠海馬CA1區(qū)樹突棘密度顯著增加，表明針刺干預(yù)后海馬突觸可塑性有所改善。

近年來研究證實(shí)，由小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化引起的細(xì)胞焦亡廣泛發(fā)生于中樞系統(tǒng)疾病。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在TBI模型中，使用CASP-1的抑制劑VX-765阻斷其表達(dá)后，可以改善大鼠的認(rèn)知記憶能力，同時可以下調(diào)細(xì)胞焦亡信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)[21]。該研究結(jié)果提示，探討細(xì)胞焦亡在中樞系統(tǒng)疾病中的作用很關(guān)鍵，通過抑制細(xì)胞焦亡信號通路的關(guān)鍵蛋白，從而調(diào)控細(xì)胞焦亡，改善腦內(nèi)的神經(jīng)炎癥，可影響疾病的發(fā)生發(fā)展。GSDMD蛋白是炎癥小體激活下游新發(fā)現(xiàn)的焦亡關(guān)鍵蛋白，其在抑郁癥中的作用和機(jī)制尚不清楚。與這些結(jié)果相一致，本研究的Western blot和免疫熒光的結(jié)果提示，利血平誘導(dǎo)的抑郁小鼠可觸發(fā)CASP-1/GSDMD細(xì)胞焦亡信號通路相關(guān)蛋白CASP-1、GSDMD、IL-1β蛋白表達(dá)水平升高以及小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化。相較于模型組，電針組及氟西汀組小鼠CASP-1/GSDMD細(xì)胞焦亡信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯著降低，小膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)量減少。表明電針發(fā)揮抗抑郁作用是通過抑制CASP-1/GSDMD細(xì)胞焦亡信號通路、改善神經(jīng)炎癥發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明電針發(fā)揮抗抑郁作用，有可能是通過抑制CASP-1/GSDMD細(xì)胞焦亡信號通路，降低神經(jīng)炎癥，改善突觸可塑性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了電針治療抑郁癥可能的分子機(jī)制，但是也不排除電針通過其他機(jī)制共同發(fā)揮抗抑郁作用。今后我們將進(jìn)一步研究電針在其他疾病中的可能分子機(jī)制以及細(xì)胞焦亡與其他疾病的潛在聯(lián)系。