姜黃素對(duì)阿霉素腎病大鼠Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

曹慧慧，王悅彤，屈 凱,趙仁偉，席少卿，李曉琪，沈 霞,王漱非

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.西安市長(zhǎng)安區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710100；3.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003)

慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)是指各種原因引起的慢性腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙[1]。目前CKD的治療主要有透析和腎移植，不僅腎源有限[2]，而且費(fèi)用昂貴，故延緩CKD進(jìn)展尤為重要[3]。腎小球硬化是慢性腎臟病進(jìn)展的主要病理因素，腎小球的主要生理結(jié)構(gòu)有腎小球系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)[4]，腎小球基底膜增厚和細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積是腎小球硬化的主要病理變化，因此抑制腎小球基底膜增厚和細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積可延緩腎小球硬化進(jìn)展。姜黃素為中藥姜黃的根莖提取的多酚類單體，具有抗炎、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、降脂和降糖[7]等藥理作用，且不良反應(yīng)小。有研究表明姜黃素可減輕糖尿病腎病小鼠的腎損傷和腎纖維化[8-9]、改善腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積[10]。進(jìn)一步研究表明，姜黃素對(duì)血管疾病、神經(jīng)根疼痛[5]、腎臟病[3]、視網(wǎng)膜病變和胰腺疾病[11]均具有一定的療效。近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明Notch信號(hào)通路不僅在腎臟的發(fā)育中扮演重要角色，而且參與多種腎臟疾病的發(fā)生[12-13]。本實(shí)驗(yàn)擬建立阿霉素腎病大鼠模型，觀察姜黃素通過調(diào)控Notch信號(hào)通路下神經(jīng)源性基因Notch同源蛋白1(Neurogenic locus notch homolog protein 1，Notch1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforming growth factor β1，TGF-β1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)的蛋白表達(dá)延緩阿霉素大鼠腎小球硬化的進(jìn)程，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，2～3月齡，體重(200±20)g，購(gòu)于四川省成都市達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)室溫度20～25 ℃，濕度55%～65%，大鼠均按標(biāo)準(zhǔn)要求給予顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水和自然晝夜節(jié)律光照。實(shí)驗(yàn)室的管理與操作符合相關(guān)法律及倫理規(guī)定。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑：鹽酸貝那普利片(國(guó)藥準(zhǔn)字H20030514)；注射用鹽酸阿霉素(國(guó)藥準(zhǔn)字C4125316-40-9)；檸檬酸抗原修復(fù)液(批號(hào)G1202)、3%過氧化物酶封閉液(批號(hào)G0115)、蘇木素染液(批號(hào)G1004)、HRP標(biāo)記山羊抗兔(批號(hào)G23303)均購(gòu)自武漢Servicebio公司；Plus RNA提取試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；Platinum SYBR Green qPCR SuperMk-UDG試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；引物購(gòu)自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心；Notch1、TGF-β1、MCP-1均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；ECL辣根過氧化物酶發(fā)光液購(gòu)自北京普利萊公司；DEPC試劑、不同梯度乙醇、PBS緩沖液等由陜西省中醫(yī)醫(yī)院病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：AL104電子天平(上海梅特勒)、低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)、-20 ℃冰箱(青島海爾)、-80 ℃超低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司)、AU2700全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus公司)、LX20生化分析儀(美國(guó)Beckman公司)、ABI 9700PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Thermo公司)、Nano-200超微量核酸分析儀(美國(guó)GE公司)、羅氏480熒光定量PCR儀(德國(guó)Roche公司)、顯微鏡(日本Olympus公司)、H-600電子顯微鏡(日本日立公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組：將60只SD雄性大鼠按體重大小從1到60編號(hào)，從隨機(jī)數(shù)字表中的任一行任一列開始依次讀取2位數(shù)作為一個(gè)隨機(jī)數(shù)錄于編號(hào)下，然后將60個(gè)隨機(jī)數(shù)從小到大編序號(hào)，將序號(hào)記錄在對(duì)應(yīng)的每個(gè)隨機(jī)數(shù)下面；規(guī)定序號(hào)1～10為空白組、序號(hào)11～20為模型組、序號(hào)21～30為對(duì)照組、序號(hào)31～40為姜黃素低劑量組、序號(hào)41～50為姜黃素中劑量組、序號(hào)51～60為姜黃素高劑量組。

1.2.2 造模及給藥：適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，除空白組外其余各組分別于第1、7天給予鹽酸阿霉素4 mg/kg尾靜脈注射，建立阿霉素腎病大鼠模型，14 d后檢測(cè)24 h尿蛋白≥150 mg,說(shuō)明造模成功。造模成功后對(duì)照組以10 mg/kg鹽酸貝那普利灌胃；姜黃素低、中、高劑量組分別予50、100、200 mg/kg姜黃素灌胃；空白組和模型組分別予等劑量的0.9%氯化鈉溶液灌胃，各組均持續(xù)灌胃6周。

1.2.3 24 h尿蛋白定量及血生化指標(biāo)檢測(cè)：于灌胃6周末收集各組大鼠24 h尿液，以3500 r/min離心10 min，尿液分析儀檢測(cè)尿蛋白含量。采用Beckman LX20生化分析儀自動(dòng)分析血清尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(Serum creatinine，Scr)水平。

1.2.4 電鏡觀察腎臟組織病理改變：用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，摘除其右側(cè)腎臟，將腎臟包膜及周圍組織分離去除，用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定，分別以70%、80%、95%、無(wú)水乙醇梯度脫水，二甲苯透明，60 ℃浸蠟60 min，迅速包埋，切成5～6 μm的薄片，用抗熒光淬滅封片液封片，電鏡下觀察腎臟組織病理改變，以上過程均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

1.2.5 RT-PCR法檢測(cè)腎組織Notch1、TGF-β1、MCP-1 mRNA表達(dá)：于-80 ℃凍存管中取2.5 mm×2.5 mm×2.5 mm腎臟組織，經(jīng)研磨、勻漿提取RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品中RNA總量。用PCR擴(kuò)增儀反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，核酸分析儀分析cDNA濃度，確保純度良好。引物由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心提供，Notch1：上游引物5’-AGAGCAGCCTACATTGAGACCT-3’，下游引物5’-CCACATTCCAGCACACTCAAGGCA-3’，長(zhǎng)度101 bp；TGF-β1：上游引物5’-ACTACGCCAAAGAAGTCACC-3’，下游引物5’-CACTGCTTCCCGAATGTCT-3’，長(zhǎng)度125 bp；MCP-1：上游引物5’-AAACCAGCCAACTCTCACT-3’，下游引物5’-GTAGTTCTCCAGCCGACTC-3’，長(zhǎng)度200 bp。退火溫度60 ℃，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物上樣經(jīng)1.7%瓊脂糖凝膠核酸電泳后，用BIO-RAD計(jì)算機(jī)凝膠成像分析系統(tǒng)、Quantity-one軟件進(jìn)行半定量分析。

1.2.6 免疫組化法檢測(cè)腎組織Notch1、TGF-β1、MCP-1蛋白表達(dá)：石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，3%過氧化氫滅活封閉內(nèi)源性過氧化物酶。將切片放入0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液后，置于微波爐進(jìn)行微波熱修復(fù)，以暴露抗原決定簇。3%過氧化物酶封閉液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min；滴加一抗，37 ℃ 2 h,4 ℃過夜，37 ℃復(fù)溫45 min；二抗孵育37 ℃ 30 min；滴加DAB顯色液，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間；蘇木素復(fù)染，70%～100%酒精梯度脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明2 min，中性樹膠封片。顯微鏡采集圖像，并采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 造模前，各組大鼠毛發(fā)整齊光滑，活動(dòng)正常，反應(yīng)靈敏。造模2～3 d后，造模大鼠開始出現(xiàn)毛發(fā)凌亂、活動(dòng)減少，5～6 d后部分大鼠出現(xiàn)便溏、反應(yīng)遲鈍、精神不振，模型組癥狀明顯。對(duì)照組和姜黃素低、中、高劑量組大鼠精神狀態(tài)有所改善，其中姜黃素高劑量組癥狀改善程度最明顯。

2.2 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較 見表1。與空白組比較，模型組24 h尿蛋白定量、BUN、Scr水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，對(duì)照組、姜黃素各劑量組24 h尿蛋白定量、BUN、Scr水平顯著降低(P<0.05)；與對(duì)照組比較，姜黃素中、高劑量組24 h尿蛋白定量、BUN、Scr水平顯著降低(P<0.05)，姜黃素低劑量組血肌酐水平顯著降低(P<0.05)。

表1 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較

2.3 各組大鼠腎臟組織病理結(jié)構(gòu)比較 空白組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常，模型組大鼠腎小球中央出現(xiàn)玻璃樣小體，周圍部分纖維化，腎小管萎縮，間質(zhì)內(nèi)小動(dòng)脈管腔變窄，系膜外基質(zhì)呈輕、中度增生，淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)，可見蛋白管型，足細(xì)胞損傷較重；姜黃素各劑量組及對(duì)照組上述病理改變減輕，其中姜黃素高劑量組減輕最明顯(圖1)。

表1 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較

A：空白組；B：模型組；C：對(duì)照組；D：姜黃素低劑量組；E：姜黃素中劑量組；F：姜黃素高劑量組

2.4 各組大鼠Notch1、TGF-β1、MCP-1 mRNA表達(dá)比較 見表2。與空白組比較，模型組、對(duì)照組、姜黃素各劑量組大鼠腎臟組織Notch1、TGF-β1、MCP-1 mRNA表達(dá)均升高(P<0.05)；與模型組比較，對(duì)照組、姜黃素各劑量組大鼠腎臟組織Notch1、TGF-β1、MCP-1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，其中姜黃素高劑量組表達(dá)最低(P<0.05)；與對(duì)照組比較，姜黃素高劑量組大鼠腎臟組織Notch1、MCP-1 mRNA表達(dá)降低，姜黃素中、低劑量組TGF-β1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠Notch1、TGF-β1、MCP-1 mRNA表達(dá)比較

2.5 各組大鼠Notch1、TGF-β1、MCP-1蛋白表達(dá)比較 見表3(圖2～4)。正常情況下，Notch1、TGF-β1、MCP-1在腎組織少量表達(dá)?？瞻捉MNotch1、TGF-β1、MCP-1僅微量表達(dá)，幾乎不可見，著色極淡；模型組Notch1、TGF-β1、MCP-1呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，表現(xiàn)為黃棕色或淡黃色，著色較重；對(duì)照組、姜黃素各劑量組Notch1、TGF-β1、MCP-1表達(dá)量介于空白組和模型組之間，姜黃素各劑量組均能有效下調(diào)Notch1、TGF-β1、MCP-1表達(dá)，其中以姜黃素高劑量組最明顯。提示姜黃素可能通過降低Notch 1、TGF-β1、MCP-1表達(dá)量起到延緩腎小球硬化的作用。

表3 各組大鼠Notch1、TGF-β1、MCP-1蛋白表達(dá)比較

3 討 論

腎小球硬化是CKD進(jìn)展至慢性腎衰竭的主要病理基礎(chǔ)。有效延緩腎小球硬化，并探討其發(fā)病機(jī)制是目前臨床醫(yī)學(xué)亟待解決的重要問題之一。腎小球硬化的病因較多，西醫(yī)病理學(xué)認(rèn)為腎小球硬化是由腎小球基底膜增厚、系膜細(xì)胞增殖、足細(xì)胞融合等導(dǎo)致，由多種細(xì)胞因子和生物活性物質(zhì)參與，致使腎小球基底膜增厚和細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚，最終導(dǎo)致腎小球硬化[14]。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1、MCP-1、Notch1參與了腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展過程。TGF-β1是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族中的成員，參與多種器官纖維化的過程，是目前公認(rèn)的誘導(dǎo)纖維化能力最強(qiáng)的生長(zhǎng)因子[15]，是腎纖維化的主要驅(qū)動(dòng)因子。MCP-1是一種對(duì)單核細(xì)胞具有趨化和激活活性的細(xì)胞因子，已證實(shí)MCP-1與多種腎臟疾病關(guān)系密切，在感染、缺血、損傷等條件下，腎臟系膜細(xì)胞大量分泌釋放MCP-1，使炎癥細(xì)胞活化和積聚，加重腎臟損傷[16]。Notch1是Notch信號(hào)通路的同源受體，在維持腎小管上皮細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用[17]。有研究表明Notch信號(hào)通路能調(diào)節(jié)足細(xì)胞分化，特定條件下激活Notch1損傷足細(xì)胞損傷[18]，而足細(xì)胞損傷是腎小球硬化的主要病理過程之一。

腎虛日久，致瘀血阻腎絡(luò)是腎小球硬化的主要病機(jī)[4]。中醫(yī)藥可有效延緩腎小球硬化的進(jìn)程。本課題組前期初步證實(shí)，益腎散結(jié)復(fù)方及拆方可有效改善腎功能，防治腎小球硬化[19]，但復(fù)方由多種藥物配伍而成，拆方亦由數(shù)味功效相似的藥物組成，其配伍機(jī)制有待進(jìn)一步研究。因此，課題組進(jìn)一步開展復(fù)方中單味中藥的研究。姜黃素為益腎散結(jié)復(fù)方藥物姜黃的提取物，實(shí)驗(yàn)通過建立阿霉素大鼠腎病模型，低、中、高劑量姜黃素灌胃治療后，發(fā)現(xiàn)其可減少大鼠24 h尿蛋白定量，降低BUN、Scr水平。同時(shí)，腎臟病理結(jié)構(gòu)方面，接受姜黃素治療后的大鼠腎臟腎小球系膜外基質(zhì)增生和足細(xì)胞損傷程度明顯改善，這與課題組前期研究益腎散結(jié)復(fù)方及拆方可改善阿霉素大鼠腎功能、控制蛋白尿的結(jié)論相一致[20]。Notch1、TGF-β1、MCP-1在阿霉素大鼠腎臟組織高表達(dá)，說(shuō)明其參與腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展，姜黃素灌胃后，其表達(dá)量顯著下降，說(shuō)明姜黃素可下調(diào)其表達(dá)以抑制腎小球硬化的進(jìn)程，且高劑量姜黃素對(duì)腎小球硬化的臨床療效優(yōu)于鹽酸貝那普利組。

綜上所述，姜黃素可通過下調(diào)Notch1、TGF-β1、MCP-1在腎臟組織的表達(dá)抑制腎小球基底膜增厚和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，進(jìn)而延緩腎小球硬化進(jìn)程。