miR-30c-2過表達聯(lián)合阿霉素對甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖及遷移能力的影響

劉赫迪，楊美宇，商 楊，孫 蕾，矯 健，于建渤

(牡丹江醫(yī)學院 1.病理教研室；2.附屬紅旗醫(yī)院超聲科，黑龍江 牡丹江 157011)

甲狀腺癌(thyroid cancer,TC)的檢出率在全世界范圍內(nèi)持續(xù)上升，其中乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid cancer,PTC)是最常見的亞型，總體預后較好，常見頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移[1]。目前，由于甲狀腺癌表現(xiàn)出廣泛的臨床行為，選擇何種治療手段仍是治療甲狀腺癌面臨的主要問題[2]。因此，選擇合適藥物或掌握PTC的遷移或侵襲過程的潛在分子機制對于降低患者的腫瘤發(fā)病率及改善預后是十分重要的。阿霉素，又稱多柔比星(adriamycin;doxorubicin,ADR)是一種DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ抑制劑，屬于蒽環(huán)類抗癌藥物家族，廣泛用于多種腫瘤的治療，通過阻止腫瘤細胞有絲分裂的DNA損傷抑制DNA復制和轉(zhuǎn)錄[3]。然而，在癌癥晚期由于長期使用引起的ADR耐藥，常常導致預后不良[4]。

microRNA(miRNAs)是長度約為22個核苷酸長度的短非編碼RNA，已經(jīng)在人類中發(fā)現(xiàn)了超過2500個miRNAs的生物標志物，參與腫瘤基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，許多miRNA在癌癥發(fā)展和耐藥性中起到關(guān)鍵作用[5]。miR-30家族包含五個成員和六個不同的成熟miRNA(miR-30a、-30b、-30c-1、-30c-2、30d、30e)，主要發(fā)揮腫瘤抑制作用，通過對腫瘤基因和致癌途徑的負性調(diào)節(jié)，引起腫瘤抑制、細胞凋亡和細胞周期阻滯[6]。在化療和化療耐藥方面發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-30c表達可顯著降低細胞骨架基因TWF1及其下游細胞因子IL-11的表達，從而導致乳腺癌細胞對阿霉素治療重新敏感[7]。因此，本研究選擇PTC細胞TPC-1為研究對象，旨在探討miR-30c-2聯(lián)合阿霉素對TPC-1細胞增殖及遷移能力的影響，以期為PTC治療提供新的分子靶點和思路。

1 材料和方法

1.1 細胞株和主要試劑PTC細胞TPC-1購自武漢普諾賽生命科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO公司； RNA提取試劑盒(E.Z.N.A.TM HP Total RNA Kit)購于美國Omega Bio-Tek公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA)購于美國賽默飛世爾科技公司；miRNA提取試劑盒；miR-30c-2，GAPDH引物由上海生工設(shè)計完成；CCK-8試劑盒購于上海尚寶生物科技有限公司；miR-30c-2 mimic，NC mimic及轉(zhuǎn)染試劑購自廣州市銳博生物科技有限公司；阿霉素購于北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與細胞轉(zhuǎn)染 將TPC-1細胞培養(yǎng)在RPMI 1640完全培養(yǎng)基(RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清按9∶1比例配置RPMI 1640完全培養(yǎng)基，另加入1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素)中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)期的TPC-1細胞分為三組，即Control組(未進行轉(zhuǎn)染處理)、miR-30c-2過表達組(加入20 nM miR-30c-2 mimic轉(zhuǎn)染試劑)、過表達對照組(加入20 nM NC mimic轉(zhuǎn)染試劑)。在轉(zhuǎn)染前1 d，對細胞株進行傳代，且更換為無雙抗培養(yǎng)基，進行細胞計數(shù)后均勻接種于6孔板中培養(yǎng)，待細胞匯合度約70%時，再行細胞轉(zhuǎn)染。按照轉(zhuǎn)染說明書進行轉(zhuǎn)染，Control組細胞未轉(zhuǎn)染。將6孔板置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中，24 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 qRT-PCR檢測 使用RNA提取試劑盒從上述分組細胞中分離總RNA，測定RNA的濃度及純度后，根據(jù)制造商的說明使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用Fast SYBRgreen PCR master mix(Roche)通過引物序列進行擴增。反應條件如下：總反應體系20 μL，95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min，進行40個循環(huán)。使用7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行定量PCR(qPCR)檢測。使用Δ閾值循環(huán)(ΔΔCt)方法計算各組miR-30c-2，GAPDH的相對表達水平，以檢驗轉(zhuǎn)染效果。用于PCR擴增的引物序列如下：miR-30c-2上游5′-CGCTGGGAGAAGGCTGTT-3′，下游5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；GAPDH上游5′-TGACAAGTGTGAATCCCGTGAAG-3′，下游5′-AACCATTTCATCCGTTGTTACGAAG-3′。

1.2.3 CCK-8檢測細胞增殖能力 取對數(shù)生長期的TPC-1細胞分成4組，即Control組(不加藥物及轉(zhuǎn)染試劑)、阿霉素組(加入0.5 nM阿霉素)、過表達組(加入20 nM miR-30c-2 mimic轉(zhuǎn)染試劑)、阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理組(加入0.5 nM阿霉素及20 nM miR-30c-2 mimic轉(zhuǎn)染試劑)，用胰蛋白酶消化后接種于96孔板上，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，分別培養(yǎng)24 h、48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，設(shè)置空白對照孔，放回恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，2 h后用酶標儀檢測各孔吸光度(OD)值。

1.2.4 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 在12孔板中培養(yǎng)TPC-1細胞，分別為Control組、阿霉素組、miR-30c-2 mimic組、阿霉素+miR-30c-2 mimic組，每孔種5×105個細胞，將培養(yǎng)板放入恒溫培養(yǎng)箱中過夜；待細胞貼壁后，用10 μL移液器槍頭對每孔劃兩條直線，并用PBS緩沖液沖洗兩次，將細胞放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；于培養(yǎng)0 h、24 h處對每孔細胞進行拍照；利用Image J分析劃痕寬度變化，劃痕愈合%=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.3 統(tǒng)計學分析應用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件，計量資料以“均數(shù)±標準差”表示，采用單因素方差分析，有統(tǒng)計學意義再采用t檢驗進行兩組間差異性比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-30c-2 mimic轉(zhuǎn)染后TPC-1細胞中miR-30c-2表達增高通過qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示瞬時轉(zhuǎn)染miR-30c-2 mimic后，miR-30c-2表達水平相比過表達對照組表達增高(P<0.001)(見表1)，提示轉(zhuǎn)染成功。

表1 轉(zhuǎn)染處理后，TPC-1細胞中的miR-30c-2的mRNA表達

2.2 阿霉素、miR-30c-2 mimic及阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理后TPC-1細胞增殖活性降低CCK-8實驗于24 h及48 h結(jié)果顯示，阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理組與單獨阿霉素組以及單獨過表達組相比TPC-1細胞的增殖活性明顯降低(均P<0.05)(見表2)。表明在TPC-1細胞中，過表達miR-30c-2可以聯(lián)合阿霉素進一步抑制細胞的增殖能力。

表2 阿霉素、miR-30c-2 mimic、阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理后細胞的存活率

2.3 阿霉素、miR-30c-2 mimic及阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理后TPC-1細胞遷移能力降低利用細胞劃痕實驗檢測阿霉素組、miR-30c-2 mimic組及阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理組TPC-1細胞的遷移能力。處理24 h后進行統(tǒng)計分析，阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理組與單獨阿霉素組及miR-30c-2 mimic組相比，TPC-1細胞遷移能力受到進一步抑制，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖3)。提示過表達miR-30c-2可以聯(lián)合阿霉素進一步抑制TPC-1細胞的遷移能力。

圖3 阿霉素、miR-30c-2 mimic、阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理后細胞的遷移能力

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，占所有甲狀腺癌的85%～90%，通常是一種惰性腫瘤，長期生存率>95%[8]。MicroRNA是一類小的非編碼RNA，在調(diào)節(jié)包括癌癥在內(nèi)的許多生物過程和疾病中起著重要作用，可以作為癌基因或腫瘤抑制因子，被用作診斷、預后和預測性生物標志物，并開發(fā)聯(lián)合miRNA的抗癌療法，目的在于提高療效和疾病治愈率[9]。越來越多研究表明，miRNA在PTC中發(fā)揮著重要的作用。例如，miR-625-3p通過增強AEG-1的表達并激活下游Wnt/β-catenin和JNK通路，促進甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[10]。miR-30c-2已被證實在多種癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制作用，同時也在腫瘤耐藥機制中發(fā)揮作用[11]。

化療作為一種有效的腫瘤治療方法，但是部分腫瘤由于多藥耐藥而無法得到有效治療[12]。據(jù)文獻統(tǒng)計，實體瘤的化療失敗率約85%，這是腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移和患者臨床預后差的主要原因[13]。各種分子和細胞過程，包括癌基因、腫瘤抑制物、凋亡和EMT過程與腫瘤細胞的化療耐藥性有關(guān)[14]。阿霉素是一種蒽環(huán)類藥物，廣泛用作各種腫瘤的抗癌劑，盡管具有廣譜抗腫瘤活性，但由于長期使用帶來的ADR耐藥性及心臟毒性等負面作用，使得預期療效不理想。假如能發(fā)現(xiàn)一種miRNA可以對阿霉素療效有正向作用，將會為PTC的治療提供新的思路。在乳腺癌中的研究發(fā)現(xiàn)，miR-30c過表達導致YWHAZ的下調(diào)，并通過p38MAPK途徑產(chǎn)生更活躍的信號，這有助于逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞對阿霉素的耐藥性[16]。因此，在PTC中，miR-30c-2能否聯(lián)合阿霉素進一步發(fā)揮對TPC-1細胞遷移和增殖的抑制作用將是重點。

本研究結(jié)果顯示，通過qRT-PCR技術(shù)，將miR-30c-2 mimic轉(zhuǎn)染至TPC-1細胞，觀察到與Control組及NC mimic組相比，過表達miR-30c-2的mRNA表達水平明顯增高(P<0.001)，證明轉(zhuǎn)染成功；利用CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理組相比Control組和單獨阿霉素組細胞的增殖情況明顯降低(P<0.01和P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義；細胞劃痕實驗進一步驗證了阿霉素+miR-30c-2 mimic共處理組可以明顯抑制細胞遷移能力(P<0.01和P<0.05)。這提示miR-30c-2可以聯(lián)合阿霉素共同抑制TPC-1細胞增殖和遷移能力。

綜上所述，過表達的miR-30c-2可以聯(lián)合阿霉素共同抑制甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞的增殖和遷移能力，提示miR-30c-2與阿霉素的聯(lián)合應用可以為PTC患者預后和治療提供新的理論基礎(chǔ)。