韓明軒，劉瑞莉，于 堃，柏學(xué)進(jìn)，董雅娟,3*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.山東省黑牛繁育工程技術(shù)研究中心，山東青島 266109；3.山東布萊凱特黑?？萍脊煞萦邢薰?，山東淄博 256306）

骨骼肌的肌纖維是畜禽肉類食品的重要組成部分，肌纖維性質(zhì)也是影響其肉品質(zhì)的重要因素。因此，在產(chǎn)肉動(dòng)物育種過(guò)程中，研究骨骼肌的調(diào)控機(jī)制可以對(duì)提高畜禽產(chǎn)肉量以及改善肉品質(zhì)有一定的指導(dǎo)意義。Myopladin（MYPN）是2001 年被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)145 KD并廣泛分布于骨骼肌和心肌中的肌節(jié)蛋白，其結(jié)構(gòu)與普遍表達(dá)的肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白PALLD 相似，它是通過(guò)標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行肉質(zhì)選擇的重要候選基因。

MYPN 的功能類似于腳手架，可以將脊椎動(dòng)物Z線中的半肌動(dòng)蛋白和-輔肌動(dòng)蛋白結(jié)合起來(lái)，-輔肌動(dòng)蛋白又直接與細(xì)肌絲相結(jié)合構(gòu)成Z 線內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)。另有研究表明，過(guò)表達(dá)的心臟錨蛋白重復(fù)序列（CARP）結(jié)合區(qū)域會(huì)使肌節(jié)蛋白的組分遭到嚴(yán)重破壞，說(shuō)明其表達(dá)有可能是通過(guò)和CARP 的相互作用而使得肌纖維組織與肌肉基因存在關(guān)聯(lián)。有關(guān)的研究主要集中于其對(duì)人類肌病的作用，如線狀體肌病、漸進(jìn)性肌無(wú)力、腎上腺素肌病、肥大和擴(kuò)張性心肌病，有研究通過(guò)對(duì)敲除的MKO 小鼠與野生型小鼠進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)MKO 小鼠的肌肉重量減小，肌纖維橫截面積也相應(yīng)減小，結(jié)果提示參與了肌肉的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)。但是有關(guān)家畜的研究卻較少，有研究表明基因3' 非編碼區(qū)的一段序列AJ560657 的231、298、318 堿基處有3 個(gè)SNP，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)性分析，證明可作為影響豬肉質(zhì)性狀的候選基因。Silvia 等通過(guò)對(duì)不同品種豬進(jìn)行的SNP 和胴體性狀的關(guān)聯(lián)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可影響骨骼肌沉積和肉類生產(chǎn)特性。另有研究表明牛的A1795G SNP 與牛的眼肌面積和系水力顯著相關(guān)?？梢?jiàn)有關(guān)家畜的研究主要集中于其SNP 與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性研究，而對(duì)編碼蛋白質(zhì)的理化特性、結(jié)構(gòu)以及表達(dá)分析的報(bào)道卻為空白。

本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物布萊凱特黑牛是在傳統(tǒng)育種技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)培育而成的優(yōu)良肉牛種質(zhì)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆的編碼區(qū)核苷酸序列，分析其理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)等；運(yùn)用qRT-PCR 檢測(cè)在布萊凱特黑牛各組織中的表達(dá)情況；通過(guò)免疫組化檢測(cè)MYPN 蛋白的定位表達(dá)；通過(guò)Western Blot 檢測(cè)MYPN 蛋白在各組織中的表達(dá)規(guī)律，從而探究在布萊凱特黑牛骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育以及功能調(diào)控等方面的作用，為肉牛肉質(zhì)性狀的選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集 選取相同飼養(yǎng)環(huán)境下的12月齡健康布萊凱特黑牛（來(lái)自山東布萊凱特黑牛科技股份有限公司），采集心、肝、脾、肺、腎、背最長(zhǎng)肌、脂肪組織保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑和儀器 DiaSpin 柱式DNA 膠回收試劑盒、T 載體連接試劑盒、DiaSpin 柱式質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒，購(gòu)自上海生工生物股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自青島擎科生物有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；SYBR Green Pro Taq HS 預(yù)混型qPCR 試劑盒，購(gòu)自艾科瑞（青島）科技有限公司；熒光定量?jī)x，Bio-Rad 品牌。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA 提取及cDNA 合成 取各組織少許，按照TRNzol 試劑使用說(shuō)明提取RNA 后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，測(cè)定其濃度和純度（OD 值在1.8～2.0），-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI 中肉牛和內(nèi)參（NM_001034034.2）核苷酸序列，使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.2.3 克隆測(cè)序 通過(guò)PCR 擴(kuò)增后，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)后使用膠回收試劑盒回收目的條帶后采用本實(shí)驗(yàn)室既定試驗(yàn)方法進(jìn)行基因克隆，連接載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板后培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，挑取菌落于氨芐青霉素液體培養(yǎng)基中，搖床過(guò)夜，測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 通過(guò)BLAST 將布萊凱特黑?；駽DS 序列與不同物種（表2）的基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，使用Mega 軟件構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。使用Services-DTU Health Tech 在線分析軟件分析MYPN 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（ProtParam）、疏水性（Protscl）、潛在磷酸化位點(diǎn)（NetPhos）、O-糖基化位點(diǎn)（YinOYang）、N-糖基化位點(diǎn)（NetNGlyc）；SOPMA 預(yù)測(cè)MYPN 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL 預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)；TMHMM預(yù)測(cè)跨膜域；SignalP 預(yù)測(cè)信號(hào)肽。

表2 不同物種MYPN 基因信息

1.2.5 熒光定量PCR 檢測(cè) 按照順序加入10 μL SYBR Green 預(yù)混液，7.8 μL ddHO，上下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL，1 μL cDNA（80 ng/μL）模板共20 μL 體系于96 孔板中，整個(gè)過(guò)程冰上操作。

1.2.6 免疫組化檢測(cè) 取出固定在4% 多聚甲醛中的脂肪組織進(jìn)行修整，將其在PBS 緩沖液中浸泡10 h，然后用不同濃度的乙醇脫水，二甲苯透明，在蠟中浸泡1 h，切塊，厚度是5 μm。檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液修復(fù)抗原，冷卻后將切片放入雙氧水中，避光孵育。滴加BSA 使其均勻覆蓋在組織上，室溫條件下封閉30 min，滴加稀釋的一抗和二抗孵育后顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片，鏡檢采集圖像。

1.2.7 組織蛋白提取及免疫印跡檢測(cè) 將組織樣品加入裂解液，剪碎后充分研磨，冰上裂解0.5 h，4℃ 13 000 r/min離心5 min，取上清，測(cè)其蛋白濃度，加入上樣緩沖液，開(kāi)水煮5 min 備用。配膠后依次加入各組織蛋白樣品，SDS-PAGE 電泳分離總蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，將膜置于稀釋后的一抗中過(guò)夜后，二抗避光搖床1 h。配制顯色液后進(jìn)行曝光和圖像采集。使用Image J 軟件分析圖像中目的條帶的灰度值。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)和蛋白表達(dá)量數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 軟件進(jìn)行分析，One-way ANOVA 方法分析各組織間的數(shù)據(jù)，并以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果

2.1基因CDS 區(qū)序列克隆鑒定 取背最長(zhǎng)肌cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到3 個(gè)擴(kuò)增片段，大小約為1 388、1 316、382 bp，與預(yù)期大小一致（圖1），可進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。對(duì)測(cè)序片段進(jìn)行拼接，獲得全長(zhǎng)為2 841 bp的基因序列。

圖1 MYPN 基因編碼區(qū)CDS 區(qū)序列鑒定

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1基因序列分析基因CDS全長(zhǎng)2 841 bp，同源比對(duì)結(jié)果顯示布萊凱特黑牛與牛（100%）、黑猩猩（90.61%）、獼猴（90.86%）、綿羊（97.57%）、馬（91.81%）、山羊（97.50%）、人（90.54%）、貓（92.33%）同源性高；由進(jìn)化樹(shù)可知，布萊凱特黑牛與牛、綿羊、山羊關(guān)系較近，與家鼠（84.65%）和雞（76.20%）關(guān)系較遠(yuǎn)（圖2）。

圖2 MYPN 基因進(jìn)化樹(shù)

2.2.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)基因（XP_024842614.1）共編碼946 個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為103 884.84，分子式為CHNOS，總原子數(shù)14 551，理論等電點(diǎn)pI 為8.41，不穩(wěn)定系數(shù)為60.45，脂肪系數(shù)為72.41，正電荷殘基數(shù)94，負(fù)電荷殘基數(shù)100，總平均親水性為-0.449 6（圖3）。

圖3 MYPN 基因蛋白質(zhì)疏水性分析

2.2.3 蛋白質(zhì)潛在位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)及定位表達(dá)分析基因蛋白質(zhì)共有磷酸化位點(diǎn)116 個(gè)，其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)80 個(gè)，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)28 個(gè)，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)8 個(gè)（圖4）；共有O-糖基化潛在位點(diǎn)37 個(gè)，N-糖基化潛在位點(diǎn)11 個(gè)（圖5）。使用STRING 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（圖6）。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，二級(jí)結(jié)構(gòu)中-螺旋占15.33%、延伸鏈19.77%、-折疊6.55%、無(wú)規(guī)卷曲58.35%（圖7）。使用Softberry 進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明基因蛋白質(zhì)主要在真核生物的細(xì)胞核中表達(dá)，其次在細(xì)胞質(zhì)、線粒體、細(xì)胞外和質(zhì)膜中表達(dá)。

圖4 MYPN 基因蛋白質(zhì)潛在磷酸化位點(diǎn)

圖5 MYPN 基因蛋白質(zhì)潛在O-糖基化潛在位點(diǎn)（A）和N-糖基化潛在位點(diǎn)（B）

圖6 MYPN 基因蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

圖7 MYPN 基因蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（A）和三級(jí)結(jié)構(gòu)（B）

2.3基因和基因PCR 擴(kuò)增 以背最長(zhǎng)肌cDNA 為模板，對(duì)基因和基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示：基因和基因的產(chǎn)物大小約為168 bp 和104 bp（圖8），與預(yù)期一致。

圖8 MYPN（左）基因和GAPDH（右）基因PCR 擴(kuò)增

2.4在布萊凱特黑牛不同組織中的表達(dá)基因和基因熔解曲線和擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖9A，可見(jiàn)無(wú)雜峰、峰值單一、特異性良好。熒光定量PCR 結(jié)果顯示，基因在布萊凱特黑牛背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量最高，極顯著高于其他組織，依次為肺臟、心臟、腎臟、肝臟，在脾臟和脂肪中表達(dá)量最低（圖9B）。

圖9 MYPN 基因在布萊凱特黑牛不同組織的表達(dá)量分析

2.5 蛋白表達(dá)定位分析 如圖10 所示，免疫反應(yīng)物質(zhì)無(wú)色表示陰性，白色表示弱陽(yáng)性，灰色表示中陽(yáng)性，黑色表示強(qiáng)陽(yáng)性，免疫組化結(jié)果顯示MYPN 蛋白在背最長(zhǎng)肌中呈區(qū)域性分布，主要在肌漿內(nèi)的肌原纖維中表達(dá)。

圖10 MYPN 基因在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)特征

2.6 Western Blot 檢測(cè) 由圖11 可知，MYPN 蛋白在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量最高，顯著高于其他組織。

圖11 MYPN 蛋白在不同組織中的表達(dá)水平

3 討論

MYPN 是一種多功能蛋白，它對(duì)維持肌節(jié)完整性和調(diào)節(jié)Z 線結(jié)構(gòu)具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)克隆了布萊凱特黑牛編碼區(qū)序列，通過(guò)理化性質(zhì)分析得出MYPN 蛋白是堿性親水不穩(wěn)定蛋白，說(shuō)明其為水溶性蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)容易接近水分子。同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，除雞和家鼠外，與其他物種同源性均在90% 以上，基因進(jìn)化樹(shù)與親緣關(guān)系一致，提示該基因在進(jìn)化上高度保守，與生物進(jìn)化特征相符。信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析表明，的氨基酸序列不存在信號(hào)肽，說(shuō)明其編碼的蛋白質(zhì)不是分泌蛋白，并且該結(jié)構(gòu)不能把相關(guān)蛋白質(zhì)引導(dǎo)到不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞器內(nèi)。MYPN 蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示其定位在細(xì)胞核內(nèi)，屬于細(xì)胞核蛋白。磷酸化潛在位點(diǎn)預(yù)測(cè)共發(fā)現(xiàn)116 個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，主要發(fā)生于Ser、Thr 和Tyr 等氨基酸殘基，有研究表明，蛋白激酶執(zhí)行蛋白質(zhì)磷酸化過(guò)程，而蛋白激酶對(duì)催化位點(diǎn)的識(shí)別主要依賴于上述3 種氨基酸殘基。糖基化潛在位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)共有O-糖基化潛在位點(diǎn)37 個(gè)，N-糖基化潛在位點(diǎn)11 個(gè)，由于糖基結(jié)構(gòu)的多樣性，蛋白經(jīng)糖基化修飾后結(jié)構(gòu)明顯更加復(fù)雜，進(jìn)一步說(shuō)明的重要作用。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，基因與等基因互作，其中多與癌癥調(diào)控相關(guān)，其他基因均參與肌肉發(fā)育或脂肪生成過(guò)程，例如，Perrot 等人研究發(fā)現(xiàn)，突變可能導(dǎo)致各種心肌病，吳怡琦等人發(fā)現(xiàn)可能通過(guò)途徑影響成脂關(guān)鍵基因和的表達(dá)，因此推測(cè)參與肌肉的功能調(diào)控。分析表明，MYPN 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲占主要部分，其次為-螺旋和-折疊。三級(jí)結(jié)構(gòu)呈桶狀，說(shuō)明該蛋白的功能區(qū)域在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，與上述同源比對(duì)結(jié)果相一致。

對(duì)MYPN 蛋白質(zhì)性質(zhì)進(jìn)行分析后，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)qRT-PCR 驗(yàn)證了在布萊凱特黑牛多種組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在布萊凱特黑牛背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量最高，其次是肺臟和心臟。根據(jù)先前研究，主要參與心肌病的調(diào)控，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示也可能參與肺臟功能調(diào)節(jié)。焦陽(yáng)研究表明，牛的組織表達(dá)譜相對(duì)順序?yàn)榧∪?、大腦等，由于本實(shí)驗(yàn)用于熒光定量分析的組織有限，并沒(méi)有對(duì)布萊凱特黑牛大腦進(jìn)行分析，但是這與本實(shí)驗(yàn)中在布萊凱特黑牛肌肉中表達(dá)量最高的研究結(jié)果一致。緊接著對(duì)氨基酸序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示MYPN 蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá)，該研究結(jié)果與焦陽(yáng)一致。免疫組化結(jié)果顯示MYPN 蛋白在肌漿內(nèi)的表達(dá)明顯，預(yù)示著影響肌原纖維的生長(zhǎng)發(fā)育，與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果具有一致性，免疫組化結(jié)果亦顯示MYPN蛋白在肌漿膜上高表達(dá)，推測(cè)MYPN 蛋白可能通過(guò)接受外來(lái)傳入的信號(hào)參與肌纖維的調(diào)控代謝。免疫印跡發(fā)現(xiàn)MYPN 蛋白在肌肉組織的表達(dá)量顯著高于其他組織，與qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。有趣的是，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)心臟的蛋白表達(dá)量高于肺臟，有研究表明，mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程涉及許多調(diào)控，mRNA 豐度并不完全決定蛋白豐度，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步推測(cè)參與了肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育及功能調(diào)節(jié)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，參與肉牛肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)并發(fā)揮重要作用，可作為肉質(zhì)性狀輔助標(biāo)記基因。