唐 嬌，劉益麗，謝書瓊，馬士龍，江明鋒*

（1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川成都 610041；2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041）

豬肉是最常見和需求量最大的肉類，中國是全球第一大豬肉消費國。2020 年全球豬肉消費量為9747.5 萬t，中國占比44.3%。為滿足人們?nèi)找嬖鲩L的豬肉消費需求，學(xué)者們對豬產(chǎn)肉量相關(guān)性狀展開了大量研究。脊椎數(shù)性狀是豬重要經(jīng)濟(jì)性狀，胸腰椎數(shù)增加可提升豬的產(chǎn)肉量，同時其他生產(chǎn)性能也得到提升。脊椎數(shù)需要對個體進(jìn)行屠宰才可判斷，該方法成本極高，并且屠宰后該豬就失去了育種價值。研究人員利用分子生物技術(shù)挖掘到多個豬脊椎數(shù)性狀相關(guān)基因，其中調(diào)控胸腰椎數(shù)增多的基因可作為分子標(biāo)記，進(jìn)行多脊椎豬的活體鑒定，從而推進(jìn)豬多脊椎品系育種工作。本文從豬脊椎數(shù)性狀、全基因掃描（Genome-Wide Scanning）和全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide Association Study，GWAS）研究方法、豬脊椎數(shù)性狀候選基因三方面內(nèi)容進(jìn)行闡述，詳細(xì)介紹豬脊椎數(shù)性狀候選基因研究進(jìn)展，以期為培育多脊椎豬提供參考。

1 豬脊椎數(shù)性狀

豬脊椎數(shù)遺傳力高達(dá)0.62，家豬的胸腰椎總數(shù)比其祖先野豬多1～4 枚，不同品種之間差異較大，中國本土豬胸腰椎總數(shù)為19～20 枚，西方商業(yè)豬胸腰椎總數(shù)高達(dá)19～23 枚。椎骨數(shù)增多使體長加長，胴體重增加、奶頭數(shù)增多。1960 年，King 等研究發(fā)現(xiàn)家豬椎骨數(shù)與胴體長呈正相關(guān)，每增加1 枚脊椎可使胴體增長1.5cm。Burgos 等研究發(fā)現(xiàn)脊椎數(shù)增加使胴體重增加、腰肉增加、蒸煮損失少，且腌制產(chǎn)量更高。Yang 等研究表明脊椎數(shù)增加會使乳頭數(shù)增加。豬脊椎數(shù)性狀與豬乳頭數(shù)性狀有共同遺傳機(jī)制，乳頭數(shù)增多提高仔豬的成活率與生長速率。

早期通過傳統(tǒng)育種方法對多脊椎豬進(jìn)行選育。西方國家通過對體型特別是體長進(jìn)行高強(qiáng)度的人工選擇，使得杜洛克、長白豬等西方商業(yè)豬的胸腰椎總數(shù)明顯多于中國地方豬種；我國也通過引進(jìn)西方商業(yè)品種改良中國本土品種，提高脊椎數(shù)量以增加體長，如20 世紀(jì)中葉通過引進(jìn)長白豬和巴克夏豬改良里岔黑豬，改良后里岔黑豬的胸腰椎數(shù)增加1～2 枚。經(jīng)過長期選育，里岔黑豬品種已成為具有適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖力高、肉品質(zhì)好、瘦肉率高等特性的地方品種。

2 豬脊椎數(shù)性狀候選基因的研究方法

在豬脊椎數(shù)性狀研究早期，由于多脊椎性狀的復(fù)雜性、家系群體的限制等原因，相關(guān)研究并未深入到分子機(jī)制。隨著生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，對該性狀分子機(jī)制的研究逐漸深入。在豬多脊椎性狀研究中，常利用全基因組掃描和全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-Wide Association Study，GWAS）對相關(guān)數(shù)量性狀位點（Quantitative Trait Locus，QTL）進(jìn)行定位和定性，進(jìn)而挖掘脊椎數(shù)性狀候選基因，為多脊椎豬分子輔助選擇奠定基礎(chǔ)。

2.1 全基因組掃描 全基因組掃描對全基因組范圍內(nèi)的遺傳標(biāo)記，主要是微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記（Short Mndem Repeats，STR）逐個進(jìn)行篩查，挖掘疾病或者經(jīng)濟(jì)性狀候選基因。全基因組掃描方法具有快速、準(zhǔn)確、高效的特點，利用該方法篩選到白內(nèi)障、高血壓等多個人類常見疾病的致病基因；另外也篩選到肉質(zhì)性狀、多脊椎性狀等多個家畜經(jīng)濟(jì)性狀的候選基因。全基因組掃描在人類疾病與家畜經(jīng)濟(jì)性狀研究中發(fā)揮了極大作用。

利用全基因組掃描研究脊椎數(shù)性狀主要流程為：根據(jù)目的性狀，設(shè)計并組建適當(dāng)?shù)馁Y源家系；構(gòu)建標(biāo)記遺傳圖譜，檢測遺傳標(biāo)記的基因型；對表現(xiàn)數(shù)據(jù)與基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，確定目標(biāo)性狀相關(guān)QTL 的數(shù)目、位置及效應(yīng)；通過連鎖不平衡（Linkage Disequilibrium，LD）、同源相同（Identical by Descent，IBD）、傳遞不平衡（Transmission Disequilibrium，TDT）、系譜傳遞連鎖不平衡檢驗（Pedigree transmission Disequilibrium Test，PTDT）對相關(guān)QTL 進(jìn)行精細(xì)定位；通過基因注釋篩選候選基因；對候選基因進(jìn)行多態(tài)性分析，鑒定候選數(shù)量性狀核苷酸（Quantitative Trait Nucleotide，QTN）；對QTN 進(jìn)行功能分析與驗證（圖1）。2000年Wada 等首次利用全基因組掃描方法定位多脊椎性狀QTL，將相關(guān)QTL 定位到1 號與2 號染色體上（Sus Scrofa Chromosome，SSC1 and SSC2）。2005年Mikawa將影響豬多脊椎性狀的QTL 定位到SSC1和SSC7 上。此后，全基因組掃描方法被廣泛應(yīng)用于豬多脊椎性狀QTL 研究，并在SSC1 和SSC7 上挖掘到多個候選基因，如核受體6 亞家族A 組成員1 基因（Nuclear Receptor Subfamily 6 Group A Member 1，）、椎骨發(fā)育相關(guān)基因（Vrtebrae Development Associated，）、同源框2 基因（Prospero Homeobox 2，）等。總體來說，全基因組掃描方法對早期豬多脊椎性狀研究發(fā)揮了重要作用。

圖1 全基因組掃描方法的流程

2.2 GWAS 1996 年Risch 等提出GWAS 的概念。GWAS 是以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，檢測出全基因組范圍內(nèi)的遺傳變異，主要指單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP），并利用統(tǒng)計學(xué)工具對其進(jìn)行分析，篩選影響疾病或目標(biāo)性狀的候選基因，主要步驟如圖2 所示。GWAS 方法的實驗樣本不再受限于資源家系，可從數(shù)據(jù)庫中獲得豐富的變異，可同時檢測同一座位的多個等位基因，并且能直接定位到單個核苷酸。早期GWAS 方法主要應(yīng)用于研究人類復(fù)雜疾病，隨著大量全基因組測序的完成、SNP 單體型圖譜構(gòu)建及高通量基因分型技術(shù)的革新，推動了GWAS 方法迅猛發(fā)展，同時為其應(yīng)用于動植物重要性狀上的研究奠定了基礎(chǔ)。畜禽高密度SNP 芯片的成功研發(fā)使得GWAS 廣泛運用于豬、牛、羊、雞等主要畜禽的疾病、品種特征、重要經(jīng)濟(jì)性狀等方面的研究。近年學(xué)者們利用GWAS 對豬多脊椎性狀展開了大量的研究，挖掘到多個候選基因。

圖2 GWAS 技術(shù)流程圖[25]

研究者通?；趩魏塑账岫鄳B(tài)的全基因關(guān)聯(lián)分析（Single Nucleotide Polymorphism-based Genome-wide Association Study，SNP-GWAS）挖掘豬脊椎數(shù)性狀候選基因。SNP-GWAS 可以檢測出遺傳力較小的QTL和次要等位基因頻率，更容易挖掘新的候選基因。GWAS 主要步驟包括：基因組DNA 的提取，檢測基因組DNA 完整性、濃度、純度；利用SNP 芯片進(jìn)行SNP 基因型判定；SNP 芯片數(shù)據(jù)的質(zhì)控包括SNP 分型率、SNP 最小等位基因頻率、Hardy Weinberger 平衡檢驗SNP 等；芯片數(shù)據(jù)分析顯著SNP，包括進(jìn)行表型數(shù)據(jù)分析、全基因組關(guān)聯(lián)分析和多重假設(shè)檢驗；通過共享性單倍型分析與重測序?qū)ο嚓P(guān)QTL 進(jìn)行精細(xì)定位；最后進(jìn)行基因注釋與候選基因的篩選。目前篩選到轉(zhuǎn)化生長因子3 基因（Transforming Growth Factor Beta 3，）、轉(zhuǎn)化生子因子結(jié)合蛋白基因（Latent Transforming Growth Factor Beta Binding Protein 2，）、IA 型骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體（Type IA Bone Morphogenetic Protein Receptor，）等多個候選基因?？傮w來說，GWAS 推動了揭示豬多脊椎性狀的分子機(jī)制的進(jìn)程。

3 影響豬脊椎數(shù)性狀相關(guān)候選基因

脊椎是由胚胎發(fā)育早期的體節(jié)發(fā)育而來，脊椎數(shù)與體節(jié)數(shù)相關(guān)。體節(jié)是由軸旁中胚層分化而來的，位于胚胎前后軸方向大小相同的重復(fù)片段。體節(jié)的發(fā)生及分化涉及了多個信號通路及基因家族，包括Notch 信號通路、Hox 基因家族及其信號通路、Wnt 信號通路、FGF信號通路等。目前利用模式生物解析了體節(jié)機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物脊椎數(shù)受多個基因共同調(diào)控，但調(diào)控基因及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。在家豬研究中，通過家系定位，并結(jié)合GWAS、全基因組重測序等新技術(shù)，成功鑒定到多個豬脊椎數(shù)性狀候選基因（表1）。使胸腰椎數(shù)增多的候選基因可作為分子標(biāo)記，利用分子輔助選擇可快速育成多脊椎豬新品系。

表1 豬多脊椎性狀的候選基因信息

3.1基因 Mikawa 等在對SSC1 上影響脊椎數(shù)QTL 定位研究中，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域包含了基因。基因在早期胚胎中表達(dá)，該基因缺陷的小鼠胚胎在體節(jié)嚴(yán)重缺陷，比正常個體少產(chǎn)生12 個。另外發(fā)現(xiàn)在西方商業(yè)豬品種中，該基因編碼區(qū)的g.748C>T突變引起192 位氨基酸從脯氨酸變?yōu)榱涟彼?，影響該基因與視黃酸和甲狀腺激素受體NCOR1 和一種新的核蛋白RAP80 的結(jié)合活性，由此推斷是使豬脊椎數(shù)增多的候選基因。脊椎數(shù)增加的單倍型T 在西方商業(yè)豬中固定，而在亞洲豬種和野豬保留單倍型C。Yang 等對基因的因果突變g.748C>T 進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)使脊椎數(shù)增加的等位基因T 在西方商業(yè)豬中是固定的，在大多數(shù)中國本土豬中非常罕見，但在里岔黑豬和萊蕪黑豬2 個中國地方品種中該等位基因頻率較高，原因是引進(jìn)西方商業(yè)豬改良中國本土豬，使單倍型T 滲入到岔黑豬和萊蕪黑豬中。近年Canu 等在意大利、西班牙等5 個歐洲地區(qū)野豬中檢測到該位點單倍型T 的滲入。另外Yan 等研究發(fā)現(xiàn)，基因g.748C>T 突變位點是影響蘇泰豬腰椎數(shù)因果突變。

基因的c.748C>T 突變位點是脊椎數(shù)增多的因果突變位點。有研究利用基因在不同豬品種中等位基因和基因型的分布和頻率特點，將其作為分子標(biāo)記，對多脊椎豬鑒定與育種參考。

3.2基因 Mikawa 等在對SSC1 上影響脊椎數(shù)QTL 定位研究中，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域6 個SNPs 與豬脊椎數(shù)高度相關(guān)，說明該區(qū)域有影響脊椎數(shù)的候選基因，該區(qū)域有且僅有1 個編碼C140rf115 蛋白的基因，將其命名為，該基因具有DNA 結(jié)合活性，是一個調(diào)控豬胸椎數(shù)的新基因；并且發(fā)現(xiàn)該基因的9 個候選因果位點。范寅對基因的因果突變進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)g.19034A>C 與g.20311-20312ins2912 個位點完全連鎖，這兩位點可能共同調(diào)控豬脊椎數(shù)性狀；并且在豬群體中驗證了g.20311-20312ins291 對脊椎數(shù)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)該位點與胸椎數(shù)關(guān)聯(lián)顯著。Duan 等研究表明基因是一個新型的轉(zhuǎn)錄因子，g.19034A>C 與g.20311-20312ins291 是使豬胸椎數(shù)增多的因果突變位點；通過構(gòu)建敲除小鼠發(fā)現(xiàn)，是小鼠胸部體節(jié)發(fā)育所必須的；并且提出基因調(diào)節(jié)胸椎數(shù)機(jī)制的假設(shè)模型：突變位點等位基因特異性上調(diào)前體節(jié)中胚層（Presomitic Mesoderm,PSM）前端基因的表達(dá)量，從而增強(qiáng)了PSM 內(nèi)細(xì)胞間Notch-Delta 的偶聯(lián)速率，Notch 通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)隨之加快，加快分節(jié)時鐘周期，使體節(jié)數(shù)量增多，最終使胸椎數(shù)增多。通過測量豬的胸椎數(shù)量和總長度，證實突變豬的胸椎數(shù)增加1 時，胸椎的總長度將增加1 個胸椎的一半。研究發(fā)現(xiàn)，g.20311-20312ins291 位點的純合子豬比野生型豬的胸椎多0.9～1.19 枚。

另外，F(xiàn)an 等對g.20311-20312ins291 位點頻率進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在大多數(shù)中國地方品種中該位點頻率較低，而在西方商業(yè)豬中頻率較高。Yang 等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，g.20311-20312ins291 位點起源于中國本土豬，在雜交過程中逐漸滲入西方商業(yè)豬中，在對西方商業(yè)豬進(jìn)行嚴(yán)格的人工選育后，該位點頻率明顯高于中國本土豬。

基因g.19034A>C 與g.20311-20312ins291 是使胸椎數(shù)增多的因果突變位點。楊明等通過對基因頻率、基因型與性狀等相關(guān)分析，以基因多態(tài)性為分子標(biāo)記，對W51 系和W52 系長白種豬核心群中胸椎數(shù)增多個體進(jìn)行分子記輔助選擇，在短時間內(nèi)使優(yōu)勢等位基因頻率100%純化，為培育多脊椎性狀系奠定基礎(chǔ)。

3.3基因 范寅在對SSC7 上影響脊椎數(shù)QTL 定位研究中，通過人-豬比較基因組分析發(fā)現(xiàn)相關(guān)QTL 區(qū)域有5 個功能基因，其中包括基因?；虬? 個典型的同源異型結(jié)構(gòu)域，在機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞發(fā)展過程中起決定作用；基因是同源異型基因（Homeobox Genes）家族中的成員，基因是形成體軸不同部分所必需的，的突變會引起脊椎數(shù)目改變，范寅由此推測基因為脊椎數(shù)性狀候選基因，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該基因的3 個SNPs（c.79C>T、c.385T>C、c.694A>G）與脊椎數(shù)關(guān)聯(lián)極顯著，這些SNPs 可解釋大約0.27 根脊椎數(shù)表型變異。Ren 等在對SSC7 上多脊椎性狀QTL 進(jìn)行定位研究中，定位到一個全基因組顯著水平相關(guān)QTL，該QTL 能解釋42.32% 的胸椎數(shù)表型變異，并對該區(qū)域包含的基因進(jìn)行功能注釋，推測基因為脊椎數(shù)性狀候選基因。Zhang 等在對胸腰椎數(shù)QTL 研究中，定位相關(guān)QTL 與Ren 等定位的胸椎數(shù)QTL 相似，推測基因是影響胸椎數(shù)候選基因。

基因是影響胸椎數(shù)候選基因。雖然目前并未定位到該基因的候選因果突變位點，但其顯著SNPs仍然可作為脊椎數(shù)育種的分子標(biāo)記，具備一定的商業(yè)價值。目前尚未報道基因敲除動物的脊椎數(shù)變化，但該基因作為Homeobox 家族成員，值得深入研究，后續(xù)應(yīng)加強(qiáng)篩選因果突變位點，并估算其對脊椎數(shù)表型的影響效應(yīng)。

3.4基因 Zhang 等在 對SSC7 上多脊 椎性狀QTL 進(jìn)行定位研究中發(fā)現(xiàn)，相關(guān)QTL 區(qū)域包含基因。在斑馬魚中，基因通過調(diào)控下游效應(yīng)子ALK5 增加中胚層細(xì)胞增殖，在脊柱發(fā)育中起關(guān)鍵作用，而Alk5+/+小鼠的胸椎數(shù)量比野生型小鼠多34 枚；介導(dǎo)胚胎發(fā)育的椎體特化期間GDF11 信號，使前后軸區(qū)域化，而Gdf11 ?/ ?小鼠肋骨增加5 枚。由此推測是多脊椎性狀重要候選基因。Zhang 等研究發(fā)現(xiàn)，相關(guān)QTL 區(qū)域有23個顯著SNPs，其中c.1749G>A 位點位于基因上；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)基因的非編碼區(qū)有且只有1 個SNP，即c.1749G>A，并在每個親本大白豬中檢測到1 個固定的G 等位基因，G 等位基因使椎骨數(shù)量增加；再次進(jìn)行GWAS 分析，發(fā)現(xiàn)該位點與椎骨數(shù)顯著相關(guān)，推測c.1749G>A 位點可能為基因的候選因果突變。

基因c.1749G>A 是調(diào)控脊椎數(shù)性狀候選因果突變位點。該調(diào)節(jié)胸椎分化和增殖過程，極可能間接調(diào)控脊椎數(shù)增加，后續(xù)可加強(qiáng)該基因的因果突變及其效應(yīng)研究與驗證。

3.5基因 Zhang 等定位多脊椎性狀QTL 研究中，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域最顯著SNP 可解釋16.51%的表型變異?？赡苡绊懮L因子的調(diào)控，通過促進(jìn)微纖維釋放間接調(diào)節(jié)家族成員的活性，敲除小鼠的肋骨數(shù)增加。通過構(gòu)建敲除小鼠發(fā)現(xiàn)，該基因在早期胚胎發(fā)育過程中必不可少的作用。由此推測為多脊椎性狀候選基因。岳靜偉研究進(jìn)一步影響豬肋骨數(shù)性狀變異的候選基因中的因果突變位點，共發(fā)現(xiàn)14 個SNPs 與影響豬肋骨數(shù)表型性狀顯著關(guān)聯(lián)。Park 等在研究基因與脊椎數(shù)關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，該基因的c.4481A>C 位點與基因g.20311-20312ins291 位點對胸椎數(shù)的影響相似，并且基因的SNPs 解釋的加性效應(yīng)和遺傳方差占比略高于。

基因c.4481A>C 位點使胸椎數(shù)增多的候選因果突變。后續(xù)應(yīng)在其他獨立群體中進(jìn)行功能研究和驗證，該位點極可能成為多脊椎性狀育種的分子標(biāo)記。

3.6 其他候選基因 在豬多脊椎性狀候選基因研究過程中，還挖掘到多個與脊椎數(shù)相關(guān)候選基因，但其相關(guān)研究較少。任冬仁等、Rohrer 等研究發(fā)現(xiàn)基因與脊椎數(shù)顯著相關(guān)，該基因家族在胚胎發(fā)育的不同階段依次表達(dá)，以調(diào)控相應(yīng)位置的體節(jié)和脊椎發(fā)育?；蚣易迩贸男∈笞倒菚黾印p少或者異位。因此應(yīng)將基因家族作為重點研究對象展開深入的研究。另外還發(fā)現(xiàn)了多個與胸椎數(shù)相關(guān)的基因，包括肌生成抑制素基因（Myostatin，MSTN）、FBJ 小鼠骨肉瘤病毒致癌基因同源物基因（）以及基因。這些基因作為影響脊椎性狀的候選基因，還需要進(jìn)一步對因果突變及功能進(jìn)行研究與驗證。

4 總結(jié)與展望

多脊椎現(xiàn)象在豬、羊（）、牛（）等家畜中都有過相關(guān)報道，目前只有豬脊椎數(shù)性狀研究相對較多，且定位到了、等多個候選基因。大多數(shù)候選基因通過模式小鼠（）和斑馬魚（）進(jìn)行驗證，但小鼠、斑馬魚和豬的脊椎數(shù)目發(fā)育調(diào)控模式是否一致，還有待進(jìn)一步研究。值得一提的是基因與基因目前已經(jīng)作為多脊椎豬選育的分子標(biāo)記，應(yīng)用于多脊椎品系選育。未來應(yīng)加強(qiáng)基因與基因研究，確證其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，闡明分子作用基礎(chǔ)，為進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。近年，研究者利用SNP-GWAS 挖掘到了多個候選基因，但其只關(guān)注加性遺傳效應(yīng)和極顯著的SNPs，忽視了顯性效應(yīng)和基因間的相互作用，因此這些候選基因的真正因果突變很難鑒別，作為影響表型的證據(jù)也難以解釋。未來可采取多元回歸方法對每個SNPs 進(jìn)行加性和顯性效應(yīng)測試，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行功能驗證。將豬多脊椎候選基因應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇育種，可提高生豬生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益，并帶來可觀的社會效益和生態(tài)效益。