適體功能化的金納米棒用于癌癥靶向治療的研究進(jìn)展

徐 慧 趙 璐 白云峰 馮 鋒

(山西大同大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，化學(xué)生物傳感山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大同 037009)

0 引 言

癌癥是人類的第2大疾病，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。據(jù)美國國家癌癥中心統(tǒng)計(jì)，預(yù)估在2022年美國將新增609 360個(gè)癌癥死亡病例[1]。癌癥的傳統(tǒng)治療方法主要包括手術(shù)、放療與化療(chemotherapy，CHT)，其中CHT是癌癥治療中最常用的方法，但CHT存在毒性大、療效低、易耐藥等問題，嚴(yán)重影響患者的治療效果[2]。隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，癌癥的治療方法主要包括：CHT、光熱療法(photothermal therapy，PTT)、光 動(dòng) 力 療 法 (photodynamic therapy，PDT)和基因療法(gene therapy，GT)，PTT 因具有侵入性小、并發(fā)癥少、見效快且對(duì)正常組織毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，引起了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注。PTT 是利用光熱劑(photothermal agent，PTA)將光能高效地轉(zhuǎn)化為熱能，使癌組織溫度快速升高而誘導(dǎo)其凋亡的一種治療方法。PTA除了用于PTT外，也可用于負(fù)載藥物、光敏劑(photosensitizer，PS)、小干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA)等，從而實(shí)現(xiàn)PTT/CHT、PTT/PDT、PTT/GT、PTT/PDT/CHT 或 PTT/GT/CHT的多模式聯(lián)合療法，在癌癥治療中顯示出巨大的潛力[3]。

目前已開發(fā)出多種類型的PTA，包括金納米顆粒(gold nanoparticles，GNs)[4]、碳基納米材料[5]、超薄2D納米材料[6-7]、半導(dǎo)體聚合物[8]、導(dǎo)電共軛聚合物[9]、有機(jī)小分子[10]等[11-12]。各類PTA用于PTT中的優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié)于表1。由于GNs具有局域表面等離子共振(localized surface plasmon resonance，LSPR)的獨(dú)特光學(xué)性質(zhì)，根據(jù)具體應(yīng)用情況，通過改變GNs的形狀，可在近紅外區(qū)調(diào)節(jié)LSPR特征吸收峰[13]。眾所周知，700～1 200 nm是PTT的最佳窗口，在此范圍內(nèi)生理液體和組織對(duì)光的吸收率最低[14-15]，因此GNs被廣泛用于PTT[16]。GNs具有棒狀、球形、梭形、星形等形狀[17]，其中棒狀 GNs(gold nanorods，GNRs)因具有合成簡單、吸收峰可調(diào)、表面易修飾和光吸收率高等特點(diǎn)脫穎而出。常見GNRs的長度可調(diào)范圍為20～200 nm，寬度可調(diào)范圍為5～100 nm，其LSPR峰在近紅外區(qū)的位置隨GNRs長徑比(aspect ratio，AR)的不同發(fā)生變化[18]。到目前為止，GNRs的合成方法有晶種生長法[19]、電化學(xué)法[20]、光化學(xué)法[21]和濕化學(xué)法[22]等，其中最成熟的方法是晶種生長法[23]。利用晶種生長法合成的GNRs，具有形狀可控、單分散性好、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)。其制備分為3步：(1)以十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)作為表面穩(wěn)定劑，通過NaBH4還原HAuCl4制備種子溶液；(2)將CTAB與HAuCl4混合使其發(fā)生配位作用，加入弱還原劑，使Au（Ⅲ）變?yōu)锳u（Ⅰ），并添加AgNO3制備生長溶液；(3)將種子溶液與生長溶液混合，過夜反應(yīng)合成GNRs。通過該方法制備的GNRs表面殘留有CTAB，將其應(yīng)用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，CTAB會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，因此需要將其去除。去除CTAB的方法包括離心或在其表面修飾其他材料，常用的修飾材料有聚合物、無機(jī)材料、生物分子等[23-24]。

表1 各類PTA應(yīng)用于PTT中的優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Advantages and disadvantages of various types of PTA used in PTT

與其他物質(zhì)相比，聚合物PEG(聚乙二醇)明顯提高了納米材料在血液中的循環(huán)周期，治療效果明顯改善[25-26]。Niidome課題組[27]利用PEG修飾GNRs測(cè)試了其對(duì)Hela細(xì)胞的毒性，體外研究結(jié)果顯示細(xì)胞存活率明顯提升，體內(nèi)研究表明，PEG修飾的GNRs在血液中的流動(dòng)時(shí)間延長。

在癌癥治療應(yīng)用中，GNRs可通過納米材料的高通透性和滯留(enhanced permeability and retention，EPR)效應(yīng)被動(dòng)地聚集在癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥的物理靶向治療。但僅依靠EPR效應(yīng)，無法特異性地靶向癌細(xì)胞，通過在GNRs表面修飾靶向分子，可以提高其對(duì)癌細(xì)胞的主動(dòng)靶向能力，改善治療效果。近年來，已有報(bào)道使用單克隆抗體[28]、葉酸[29-31]、多肽[32]和透明質(zhì)酸等[33-34]物質(zhì)修飾GNRs以提高靶向能力，但這些方法存在制備過程復(fù)雜、靶向精度低的缺點(diǎn)。核酸適體(aptamer，Apt)的出現(xiàn)極大地改善了這些問題，為癌癥的靶向治療帶來新的希望。我們將Apt與其他靶向配體之間的優(yōu)缺點(diǎn)比較總結(jié)于表2。

表2 適體與其他配體的優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 2 Comparison of advantages and disadvantages of aptamers and other ligands

1 核酸適體

Apt是一種人工在體外篩選的功能性寡核苷酸序列(短的單鏈DNA或RNA片段)，通常擁有20～80個(gè)堿基，它可以折疊成二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，這使其具有高親和力和特異性。由于具有與抗體相似的親和力和特異性，Apt被稱為“化學(xué)抗體”。

與抗體相比，Apt具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)：(1)Apt的大小為6～30 kDa，具有高比表面積與體積比，可折疊成特定的結(jié)構(gòu)以高親和力識(shí)別靶標(biāo)；(2)可識(shí)別的位點(diǎn)多，可識(shí)別細(xì)胞、金屬離子、蛋白、細(xì)菌、真菌和病毒等[35-39]；(3)具有相對(duì)較低的免疫原性；(4)穩(wěn)定性高且生產(chǎn)成本低；(5)具有可編程性，通過刪除、添加、合并Apt序列進(jìn)而識(shí)別不同目標(biāo)；(6)具有易修飾和標(biāo)記的特點(diǎn)，可在其5′或3′端修飾生物小分子(例如生物素、鏈霉親和素等)、化學(xué)基團(tuán)(例如氨基、巰基、羧基等)[34]等，已廣泛應(yīng)用于生物傳感[40-51]、體內(nèi)成像[52]、靶向遞送藥物[53]和癌癥治療[54]等領(lǐng)域。

經(jīng)過修飾后的Apt可通過共價(jià)作用與聚合物、小分子和納米材料表面的基團(tuán)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)癌癥藥物靶向遞送。在與GNRs結(jié)合的癌癥靶向治療體系中，Apt具有以下作用：(1)精準(zhǔn)靶向癌細(xì)胞或其表面膜蛋白；(2)通過物理作用裝載化療藥物阿霉素(doxorubicin，DOX)[55]；(3)在復(fù)合材料表面封裝藥物的功能；(4)用于連接光敏劑或RNA等。本課題組利用Apt的優(yōu)勢(shì)，在生物傳感方面進(jìn)行研究并取得了一些成果[41-51,56-57]，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腺苷[42]、癌胚抗原[44]以及伴刀豆蛋白[49]等分子的高靈敏檢測(cè)。利用Apt功能化GNRs(Apt-GNRs)，可以將Apt的特異性識(shí)別能力和結(jié)合能力與GNRs的光熱性結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)癌癥的精準(zhǔn)靶向治療，提高治療效率，減少毒副作用。本文基于Apt對(duì)癌細(xì)胞高特異性識(shí)別的優(yōu)勢(shì)，總結(jié)了Apt-GNRs在癌癥靶向治療新策略方面取得的研究進(jìn)展，同時(shí)展望了其未來的發(fā)展趨勢(shì)。

2 Apt-GNRs用于單一模式治療

2.1 Apt-GNRs用于PTT

PTT是利用光熱轉(zhuǎn)換效率較高的納米材料，在激光的照射下將光能快速轉(zhuǎn)化成熱能，使癌細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生熱變性和凝固，從而促使癌細(xì)胞凋亡[58]。GNRs具有可調(diào)的縱向LSPR波長，這增強(qiáng)了其對(duì)相應(yīng)波長的光吸收，從而實(shí)現(xiàn)高效的熱轉(zhuǎn)換。在癌癥治療中，Apt-GNRs對(duì)靶標(biāo)具有高選擇性，進(jìn)行PTT時(shí)使用較低的激光功率就可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的高致死率，同時(shí)減少對(duì)周圍健康組織的傷害。

2008年，Tan課題組[59]首次設(shè)計(jì)了一種銀摻雜的 GNRs(Ag-GNRs)(圖1A)，與 GNRs相比，Ag-GNRs具有更高的摩爾吸收效率。將Apt-Sgc8偶聯(lián)到Ag-GNRs來靶向CCRF-CEM細(xì)胞，在激光的照射下，癌細(xì)胞死亡率從23%上升為93%，正常細(xì)胞NB-4未發(fā)生明顯死亡。為了降低GNRs表面CTAB帶來的毒性，2014年，Haam課題組[60]利用羧基修飾的PEG(COOH-PEG-SH)替換GNRs表面的CTAB，為了提高靶向性，同時(shí)將Apt-EGFR與EGFR抗體修飾于GNRs上(圖1C)，用于靶向A431和MCF-7細(xì)胞。體外研究顯示，在激光的照射下，癌細(xì)胞的死亡率顯著增高，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤明顯變小。為了提升Apt對(duì)靶細(xì)胞的親和力，2016年Cheng課題組[61]篩選出一種新型的Apt-KW16-13靶向MCF-10CA1h細(xì)胞(圖1B)，與Apt-KMF2-1a相比，Apt-KW16-13對(duì)MCF-10CA1h細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的親和力，將其修飾于GNRs進(jìn)行PTT。體外研究結(jié)果顯示，在激光的照射下，癌細(xì)胞的死亡率高達(dá)96%。2019年，Kim課題組[62]篩選一種新的Apt用于靶向KB細(xì)胞(圖1D)，將Apt修飾于GNRs表面進(jìn)行PTT，體外實(shí)驗(yàn)證明在激光的照射下，超過80%的細(xì)胞死亡。

圖1 Apt-GNRs在PTT中應(yīng)用的示意圖[59-62,64]Fig.1 Schematic diagram of the application of Apt-GNRs in PTT[59-62,64]

PEG具有減少非特異性蛋白吸附、改善血液相容性等優(yōu)勢(shì)，但可能會(huì)引起細(xì)胞凝血，并產(chǎn)生抗PEG免疫球蛋白抗體。為了改善這一缺陷，Xu課題組[63]將DSPE-PEG-SH和Apt-EGFR修飾于外泌體(exosomes，Exos)，通過 Au—S 鍵將其與 GNRs結(jié)合，利用Exos提升了GNRs的生物相容性。將Apt-EGFR用于靶向HepG2細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在激光的照射下，GNRs溫度升高，HepG2細(xì)胞存活率顯著降低。

2020年，Tang課題組[64]將 Apt-AS1411/Apt-MUC1修飾的GNRs用于靶向MCF-7細(xì)胞(圖1E)，體外實(shí)驗(yàn)表明，在激光的照射下，MCF-7細(xì)胞幾乎全部死亡，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中Apt-GNRs對(duì)腫瘤的抑制率高達(dá)99%，有望在實(shí)際臨床中應(yīng)用。

以上研究結(jié)果表明，Apt-GNRs在激光的照射下產(chǎn)生的熱量足以消融癌細(xì)胞，PTT可有效抑制腫瘤的生長。

2.2 Apt-GNRs用于PDT

PDT是在指定的波長(一般為440、660 nm)下，PS吸收光能后從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，將能量轉(zhuǎn)移到周圍的氧分子中，產(chǎn)生細(xì)胞毒性活性氧(reactive oxygen species，ROS)，例如單線態(tài)氧(1O2)和羥基自由基(·OH)等，對(duì)癌細(xì)胞造成氧化損傷，致使細(xì)胞凋亡[65-66]。與其他治療方式相比，PDT可以精確地控制其作用的位置和時(shí)間[67-71]。

PDT在臨床應(yīng)用時(shí)，為了避免可見光對(duì)注射光敏藥物的患者帶來傷害，患者在一定時(shí)間內(nèi)必須避免與光照接觸，另外，由于光敏藥物的非特異性分布，對(duì)正常組織也有毒性作用，限制了PDT在癌癥治療中的應(yīng)用。為了改善這一問題，Shi課題組[72]首次將Apt-GNRs應(yīng)用于PDT，選用Apt-MUC1修飾GNRs，并在Apt末端修飾了光敏劑分子Ce6，使Ce6接近GNRs時(shí)發(fā)生猝滅，在激光的照射下，PDT處于“關(guān)閉”狀態(tài)。相反，在MCF-7細(xì)胞存在時(shí)，Apt-MUC1與MCF-7細(xì)胞表面的MUC1蛋白結(jié)合，使Apt-MUC1構(gòu)象發(fā)生變化，增加了Ce6分子與GNRs之間的距離(圖2)，在激光照射下，PDT處于“開啟”狀態(tài)，細(xì)胞凋亡率提升了53.8%。2021年，Ng課題組[73]利用聚多巴胺(PDA)修飾的GNRs連接hp DNA用于靶向高表達(dá)miR-21的MCF-7細(xì)胞，在hp DNA上修飾了DSBDP(二苯乙烯基硼二吡咯亞甲基)。在675 nm激光的照射下，DSBDP被“激活”產(chǎn)生1O2(圖2B)，使80%的細(xì)胞死亡，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明該系統(tǒng)可有效抑制腫瘤生長，并對(duì)正常組織無明顯毒性作用。

圖2 Apt-GNRs在PDT中應(yīng)用的示意圖[72-73]Fig.2 Schematic diagram of the application of Apt-GNRs in PTT[72-73]

在Apt上修飾PS，在激光的照射下可實(shí)現(xiàn)PDT，而以上研究結(jié)果顯示Apt-GNRs可有效使癌細(xì)胞凋亡。

2.3 Apt-GNRs用于化療藥物載體

GNRs具有獨(dú)特的尺寸、較大的比表面積等特點(diǎn)，藥物可通過物理封裝或化學(xué)鍵合(非共價(jià)或共價(jià))與GNRs結(jié)合，通過Apt的主動(dòng)靶向作用增強(qiáng)化療藥物在癌細(xì)胞中的富集，降低對(duì)正常細(xì)胞的毒性，實(shí)現(xiàn)了藥物的定點(diǎn)釋放。

2016年，Wan課題組[74]設(shè)計(jì)一種基于GNRs的雙功能適體探針DOX/GNR/DNA(圖3)，選擇了Apt-Romas與 Apt-ATP(DNA3)兩種 Apt，GNRs表面的單鏈DNA與DNA3雜交后可提供化療藥物DOX負(fù)載位點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)載藥。Romas細(xì)胞存在時(shí)，Apt-Romas與Apt-ATP發(fā)揮雙重靶向作用，可高特異性與Romas細(xì)胞結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了DOX的靶向遞送，體內(nèi)外研究均顯示DOX/GNR/DNA系統(tǒng)對(duì)癌細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。

圖3 Apt-GNRs用于癌癥CHT的機(jī)理圖[74]Fig.3 Mechanism of Apt-GNRs used in CHT for cancer[74]

3 聯(lián)合療法

單一療法在癌癥治療中取得了初步成果，但也存在一些問題，例如：(1)PTT主要依賴PTA的光熱轉(zhuǎn)換性能，GNRs在體外消滅癌細(xì)胞和體內(nèi)消除惡性腫瘤的效果十分顯著，然而，癌細(xì)胞內(nèi)溫度升高使體內(nèi)的熱休克蛋白(HSP)表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)了癌細(xì)胞的耐熱性從而降低了PTT的效果；(2)PDT療法主要依靠PS產(chǎn)生ROS，但部分無機(jī)PS僅在O2的存在下才能產(chǎn)生單線態(tài)氧(1O2)，癌組織中乏氧狀態(tài)下PDT效果會(huì)受到影響；(3)化療藥物(DOX、紫杉醇、5-氟尿嘧啶等)進(jìn)入身體后的非特異性分布會(huì)對(duì)人體臟器造成較大的危害，長時(shí)間使用化療藥物時(shí)，癌細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生耐藥性(multidrug resistance，MDR)。為避免單一治療的缺陷，可以將2種或多種療法聯(lián)合使用以提高治療效果[75-76]。

3.1 雙模式聯(lián)合療法

3.1.1 PTT與CHT聯(lián)合

PTT可以顯著增強(qiáng)CHT效果，兩者聯(lián)合療法已被廣泛應(yīng)用于癌癥治療[77-78]。2011年，Tan課題組[79]在GNRs表面修飾聚丙烯酰胺聚合物(DP-A、DP-B)以形成凝膠用來負(fù)載藥物，同時(shí)利用Apt-Sgc8靶向CCRF-CEM細(xì)胞。在激光的照射下，GNRs溫度升高并加速藥物釋放，細(xì)胞的死亡率可達(dá)67%左右(圖4A)。為了在提高載藥量的同時(shí)實(shí)現(xiàn)靶向作用，Qu課題組[80]首次將Apt作為封閉劑，用介孔SiO2包裹GNRs構(gòu)建介孔二氧化硅納米粒子(mesoporous silica nanoparticles，MSNs)，在其表面修飾了 Apt-AS1411用于靶向MCF-7細(xì)胞。利用Apt-AS1411與互補(bǔ)DNA序列形成雙鏈結(jié)構(gòu)，在激光照射下，GNRs溫度升高使DNA雙鏈解旋，實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向MCF-7細(xì)胞的目的，MSNs自動(dòng)解封，實(shí)現(xiàn)藥物釋放。體外實(shí)驗(yàn)證明，在PTT和CHT共同作用下癌細(xì)胞存活率明顯降低(圖4B)。隨后，Um課題組[81]直接在GNRs表面修飾Apt-A10用于靶向LNCaP細(xì)胞，在PTT和CHT的聯(lián)合作用下，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明該系統(tǒng)抑制腫瘤有顯著效果。

除了直接靶向癌細(xì)胞中的一些蛋白之外，線粒體也可作為癌癥治療中有效的靶點(diǎn)，Qu課題組[82]設(shè)計(jì)了靶向線粒體的納米載藥系統(tǒng)，該系統(tǒng)同樣使用介孔SiO2包裹GNRs構(gòu)建MSNs，將Apt-Cytc修飾于MSNs，其可以將藥物靶向遞送到HeLa細(xì)胞的線粒體。在980 nm激光的照射下，Apt-Cytc在HeLa的細(xì)胞質(zhì)中釋放，觸發(fā)線粒體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并刺激藥物釋放。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與單獨(dú)的CHT和PTT相比，聯(lián)合療法產(chǎn)生了更高的細(xì)胞毒性(圖4C)。在遇到復(fù)雜環(huán)境時(shí)，MSNs不穩(wěn)定，SiO2會(huì)與GNRs分離，對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用。為此Tan課題組[83]利用碳層(Carbon)包裹GNRs以增強(qiáng)納米復(fù)合材料的穩(wěn)定性，并修飾Apt-AS1411、裝載DOX構(gòu)建了GNR@Carbon-DOX納米藥物遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)可通過簡單的疏水作用和π-π堆積在Carbon上裝載DOX，其載藥量高達(dá)46%，在紅外激光照射時(shí)，該納米系統(tǒng)的溫度由20℃快速上升到75℃，PTT療效顯著，在體外研究中用于靶向MCF-7細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，與單獨(dú)CHT和PTT相比，聯(lián)合療法對(duì)MCF-7細(xì)胞生長的抑制作用更顯著(圖4D)。

DNA納米結(jié)構(gòu)因其結(jié)構(gòu)可編程性和良好的生物相容性在藥物載體應(yīng)用方面?zhèn)涫荜P(guān)注。Ding課題組[84]用Apt-MUC1功能化DNA折紙，在折紙上可裝載DOX與GNRs，用于靶向MCF-7細(xì)胞，在激光的照射下，GNRs溫度升高，抑制了P-糖蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)了癌細(xì)胞對(duì)DOX的敏感性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合療法比單一治療更有效地抑制了癌細(xì)胞的生長(圖4E)。

2015年，Tan課題組[85]利用DNA自組裝構(gòu)建了一種大小可控的智能納米復(fù)合物，在GNRs短軸端修飾了Apt-Sgc8，用來靶向CCRF-CEM細(xì)胞。GNRs長軸端修飾捕獲鏈與金納米球(GNPs)上的DNA鏈雜交，用來裝載DOX(圖4F)。在激光照射下，GNRs溫度升高促使DOX釋放，研究結(jié)果顯示，CHT與PTT聯(lián)合，CCRF-CEM細(xì)胞凋亡率可提升24%。2019年，Hao課題組[86]在MSNs表面修飾PDA用于封裝DOX，同時(shí)提升GNRs的光熱效果，Apt-S6通過邁克爾加成反應(yīng)與PDA連接，用于靶向A549細(xì)胞(圖4G)，體外實(shí)驗(yàn)表明，在激光照射下，DOX釋放，CHT與PTT共同作用，癌細(xì)胞存活率顯著降低。

3.1.2 PTT與PDT聯(lián)合

PDT依靠在細(xì)胞內(nèi)直接產(chǎn)生ROS來殺死癌細(xì)胞，將PS高效遞送至癌細(xì)胞內(nèi)是實(shí)現(xiàn)PDT療效的關(guān)鍵。由于溫和的熱療能夠增加細(xì)胞膜的通透性以增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)納米載體的吸收，可通過溫和的PTT效應(yīng)增加細(xì)胞內(nèi)PS濃度，從而提高細(xì)胞內(nèi)ROS濃度，進(jìn)一步增強(qiáng)PDT療效。此外，輕度熱療可加速血液循環(huán)，增加血管飽和O2濃度，這也有利于提高PDT-Ⅱ型(O2依賴型)的1O2產(chǎn)量[87]。Tan 課題組[88]將Apt-Sgc8“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)的末端連接Ce6，依次將PEGSH、Apt-Sgc8修飾在GNRs上，構(gòu)建了納米復(fù)合系統(tǒng)(圖5A)用于靶向CCRF-CEM細(xì)胞。由于Ce6貼近GNRs表面，其熒光被猝滅。在CCRF-CEM細(xì)胞存在時(shí)，Apt-Sgc8構(gòu)象改變，使Ce6遠(yuǎn)離GNRs表面。在激光照射下，GNRs吸收光能轉(zhuǎn)化為熱能，Ce6產(chǎn)生1O2，實(shí)現(xiàn)PDT/PTT聯(lián)合作用，CCRF-CEM細(xì)胞的死亡率高于70%。2013年，Tan課題組[89]將Apt-Sgc8修飾到GNRs，用于靶向CCRF-CEM細(xì)胞。在Apt-Sgc8互補(bǔ)序列(cDNA)末端修飾Ce6(圖5B)，Apt-Sgc8識(shí)別CCRF-CEM細(xì)胞后與cDNA分離，Ce6分子被釋放。在白光和812 nm激光的照射下，Ce6產(chǎn)生1O2，GNRs產(chǎn)生PTT效果。體外研究表明，聯(lián)合療法比單一療法更有效，可使細(xì)胞存活率降至32%以下。

圖5 Apt-GNRs用于PTT/PDT聯(lián)合治療的作用機(jī)理圖[88-89]Fig.5 Mechanism of combined PTT/PDT based on Apt-GNRs[88-89]

3.1.3 PTT與GT聯(lián)合

GT是指將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償缺陷和異常基因引起的疾病，達(dá)到治療目的。為了提高CRISPR-Cas9靶向性，實(shí)現(xiàn)sgRNA在靶標(biāo)處定點(diǎn)釋放，Le課題組[90]利用DNA將sgRNA“保護(hù)”起來，將其偶聯(lián)至GNRs以構(gòu)建納米遞送系統(tǒng)。在激光的照射下，GNRs產(chǎn)生熱量，sgRNA“脫保護(hù)”與Cas9蛋白結(jié)合，啟動(dòng)特定基因編輯敲除PLK1，誘導(dǎo)A549細(xì)胞開始凋亡(圖6A)。體外研究表明，在PTT和GT的共同作用下，細(xì)胞的死亡率可達(dá)84%。為了提升Apt-GNRs對(duì)癌細(xì)胞的靶向能力，2021年，Ding課題組[91]利用Apt-MUC1和TAT(多肽)共同靶向MCF-7細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞雙重靶向作用。在sgRNA/Cas9作用下，PKL1表達(dá)下調(diào)，在激光的照射下，增強(qiáng)了PTT的效果，在聯(lián)合療法的模式下，實(shí)現(xiàn)了最佳的抑制腫瘤效果(圖6B)。

圖6 Apt-GNRs用于PTT/GT聯(lián)合治療的作用機(jī)理圖[90-91]Fig.6 Mechanism of combined PTT/GT based on Apt-GNRs[90-91]

3.2 多模式聯(lián)合療法

兩種治療方式聯(lián)合的抗癌效果遠(yuǎn)高于單一療法，如果將3種治療方式同時(shí)整合于一個(gè)納米平臺(tái)上，可以進(jìn)一步提升治療效率，以較低的劑量就可實(shí)現(xiàn)最佳的治療效果，進(jìn)一步減少對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用[92]。

3.2.1 PTT、CHT和PDT聯(lián)合

在激光照射時(shí)，GNRs產(chǎn)生的熱量可加速釋放化療藥物/PS，提升其對(duì)癌細(xì)胞的作用強(qiáng)度，從而增強(qiáng)CHT與PDT的治療效果，同時(shí)PS產(chǎn)生的ROS可避免內(nèi)體對(duì)GNRs的吞噬，促進(jìn)藥物遞送。Tan課題組[93]將dsDNA自組裝到GNRs的表面，用來提供DOX的結(jié)合位點(diǎn)，光敏劑(TMPyP4)插入Apt-AS1411形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)中構(gòu)成納米載藥遞送系統(tǒng)，用于靶向HeLa細(xì)胞。在808 nm激光照射下，GNRs的溫度迅速升高，DOX從DNA雙鏈中釋放，同時(shí)產(chǎn)生1O2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3種療法聯(lián)合作用表現(xiàn)出最佳的治療效果，HeLa細(xì)胞的死亡率高達(dá)80%以上(圖7A)。

圖7 Apt-GNRs用于癌癥多模式治療的示意圖[93,95]Fig.7 Schematic diagram of multimodal cancer treatment based on Apt-GNRs[93,95]

3.2.2 PTT、CHT和GT聯(lián)合

續(xù)表3

化療藥物長期使用會(huì)產(chǎn)生MDR，GT中特異性的siRNA可作用于耐藥基因，恢復(fù)癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，從而有效提高化療的效果[94]。siRNA是一種雙鏈RNA分子，可用于沉默癌癥相關(guān)基因的表達(dá)。Xu課題組[95]將siRNA與GNRs偶聯(lián)，同時(shí)使用PEG-SH和Apt-AS1411修飾GNRs，作用于PC-3細(xì)胞。在激光的照射下，GNRs周圍溫度升高，使DNA雙鏈解旋釋放DOX和siRNA，DOX進(jìn)入細(xì)胞核，siRNA作用于細(xì)胞質(zhì)。MRP1是一種細(xì)胞表面的外排泵，可通過降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度來調(diào)節(jié)MDR，通過siRNA抑制MRP1的表達(dá)，DOX毒性顯著增強(qiáng)，3種治療模式同時(shí)發(fā)揮作用，PC-3細(xì)胞晚期凋亡率高達(dá) 84.4%(圖7B)。

以上研究表明，相較于單一模式治療，將PTT、PDT、CHT和GT聯(lián)合的多模式治療可提高對(duì)腫瘤的抑制作用，利用GNRs本身具有的PTT效果，可以：(1)在其表面或Apt末端修飾PS實(shí)現(xiàn)PTT與PDT聯(lián)合；(2)利用Apt裝載或連接化療藥物實(shí)現(xiàn)PTT與CHT聯(lián)合；(3)利用Apt連接外源基因?qū)崿F(xiàn)PTT與GT聯(lián)合，或?qū)崿F(xiàn)3種療法的聯(lián)合。

4 總結(jié)與展望

近年來，構(gòu)建用于癌癥治療的多功能納米材料研究取得了巨大進(jìn)步，與單一療法相比，多模式療法在集合每種療法優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)利用各種療法間的相互補(bǔ)充，成功地彌補(bǔ)單一療法的不足，達(dá)到了更佳的治療效果。癌癥醫(yī)學(xué)研究的主要領(lǐng)域之一是將抗癌藥物靶向遞送于癌細(xì)胞，這不僅有助于提高治療效果，而且還降低抗腫瘤藥物的非特異性分布帶來的副作用。Apt作為新型的靶向劑現(xiàn)已成為最熱門的抗癌工具，為癌癥的診斷和治療帶來新的希望。目前已有Apt藥物Macugen上市[96]，用于治療濕性年齡相關(guān)性黃斑變性，臨床應(yīng)用治療效果顯著。美國Cytimmue Sciences公司專注于研發(fā)金屬納米材料藥物用于臨床癌癥治療，其研發(fā)的產(chǎn)品已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，將Apt與GNRs結(jié)合作為臨床癌癥治療藥物指日可待。

Apt-GNRs具有良好的生物相容性、較大的負(fù)載量、優(yōu)良的靶向性，在癌癥治療方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，但仍然面臨許多問題：

(1)表面改性過程中穩(wěn)定性差。目前已經(jīng)提出多種GNRs表面改性的方法，但大多受實(shí)驗(yàn)室條件以及試劑純度的影響，存在可重復(fù)性差、表面改性時(shí)易聚集等缺點(diǎn)，目前已通過在其表面修飾聚合物材料、納米材料等，以改善其穩(wěn)定性，但效果仍不理想。

(2)載藥量低。Apt-GNRs主要通過Apt與單鏈DNA形成的雙鏈結(jié)構(gòu)或Apt自身的雙鏈結(jié)構(gòu)以裝載藥物，其載藥量較低，目前已通過在其表面修飾比表面積較大的有機(jī)/無機(jī)材料來提升其載藥量，但與可生物降解的有機(jī)大分子相比，大部分無機(jī)納米材料在體內(nèi)中幾乎不能降解，其安全性有待研究。

(3)生物安全性。盡管許多研究探討了Apt-GNRs在體內(nèi)外使用的安全性，但一些研究也提出了互相矛盾的結(jié)果。由于GNRs的物理尺寸大于8 nm時(shí)不能通過體內(nèi)的酶促反應(yīng)分解成更小的碎片，進(jìn)入體內(nèi)后，GNRs會(huì)迅速積聚在肝臟、脾臟等健康器官中，無法清除，限制了大多數(shù)GNRs應(yīng)用于臨床，將GNRs的粒徑盡量控制在腎臟利于消除的范圍內(nèi)(6～8 nm)，是目前研究的重點(diǎn)。

Apt-GNRs藥物遞送系統(tǒng)在癌癥治療領(lǐng)域潛力不可限量，未來有望在以下方面取得實(shí)質(zhì)進(jìn)展：(1)由于許多惡性腫瘤是位于體內(nèi)而不是體表，NIR-Ⅰ光只能穿透人體幾厘米，降低了GNRs在深部腫瘤PTT的療效，NIR-Ⅱ光比NIR-Ⅰ光對(duì)組織的穿透深度更高，開發(fā)GNRs在NIR-Ⅱ區(qū)的PTT性能，實(shí)現(xiàn)對(duì)深部的腫瘤進(jìn)行穿透性治療將是未來的研究方向之一；(2)為了提升GNRs的光轉(zhuǎn)化率進(jìn)而提升其PTT性能，利用Ag、Cu與GNRs摻雜可提升其光轉(zhuǎn)化率，摻雜何種材料能更有效地提升GNRs的光轉(zhuǎn)化率是未來的研究方向之一；(3)聯(lián)合療法只是將各種療法的作用簡單疊加，多種療法聯(lián)合如何能起到協(xié)同促進(jìn)作用，達(dá)到“1+1＞2”的療效將是未來的研究方向之一；(4)盡管采用多種方法提升了GNRs的生物相容性，但人體環(huán)境復(fù)雜，難以預(yù)測(cè)，很難確定納米材料進(jìn)入人體后的溶解性、親水性和聚集性等問題，著重提升其生物相容性和穩(wěn)定性是將其應(yīng)用于人體治療中亟待解決的難題之一；(5)應(yīng)用于體內(nèi)研究時(shí)，Apt功能化可大幅度提升納米材料的靶向遞送效果，但在健康器官中仍有大量的納米材料富集，進(jìn)一步提升Apt的主動(dòng)靶向能力是從活體實(shí)驗(yàn)邁向臨床應(yīng)用的重點(diǎn)研究方向之一。

雖然基于Apt-GNRs納米藥物遞送系統(tǒng)在癌癥治療應(yīng)用中還面臨著許多困難與挑戰(zhàn)，但這些問題會(huì)隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和科學(xué)家們對(duì)GNRs的深入研究而逐個(gè)擊破，Apt-GNRs將在癌癥治療領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。