柴胡皂苷D對(duì)人三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖的影響

楊楠 馮苗苗 豈銘偉 嚴(yán)曉麗 王明娟 薛晶

(承德醫(yī)學(xué)院 1護(hù)理系，河北 承德 067000；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

我國(guó)女性惡性腫瘤發(fā)病率排第1位的是乳腺癌，其病死率排第5位，是臨床常見惡性腫瘤之一。近1/4乳腺癌患者為三陰乳腺癌(TNBC)，TNBC有高侵襲、惡性程度高、易轉(zhuǎn)移和預(yù)后差等特點(diǎn)〔1，2〕。柴胡根莖中分離出的三萜皂苷柴胡皂苷(SSs)具有多重藥理作用。其中，柴胡皂苷(SS)D的中藥理活性最強(qiáng)，能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖分裂和阻斷細(xì)胞周期，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔3〕。據(jù)報(bào)道，SSD抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用在腎癌、膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌、肝癌等惡性腫瘤中都有體現(xiàn)〔4～7〕。但SSD對(duì)人TNBC細(xì)胞MDA-MB-231增殖的影響和作用機(jī)制尚未報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬研究其對(duì)人TNBC細(xì)胞MDA-MB-231增殖的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(TCHu227)。

1.1.2藥物 SSD購自四川省維克奇生物科技有限公司(wkq17102505)。

1.1.3試劑 兔抗人CX43多克隆、兔抗人mTOR單克隆(杭州華安生物，中國(guó))；兔抗人P70s6K多克隆(武漢ABcolnal公司，中國(guó))；羊抗兔二抗(Redpartytech，美國(guó))；放射沉淀免疫試驗(yàn)(RIPA)裂解液〔含苯甲基磺酰氟(PMSF)，solarbio，中國(guó)〕；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液(杭州聯(lián)科，中國(guó))；蛋白上樣緩沖液、樣品緩沖液(5X)(貝博，中國(guó))；新快速十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒、10×的SDS-PAGE液、Western印跡轉(zhuǎn)膜緩沖液(20×)(莊盟，中國(guó))；TBS/Tween緩沖液(10×)、三色預(yù)染蛋白Marker、Western印跡一抗稀釋液、Western印跡二抗稀釋液(雅酶，中國(guó))；聚偏氟乙烯(PVDF)膜0.45 μm(GE，中國(guó))；PVDF膜0.22 μm(ROCHE，瑞士)；β-actin兔單抗(武漢ABcolnal公司，中國(guó))。

1.1.4儀器 垂直電泳槽、水平搖床(北京六一，中國(guó))；3KE5型低溫離心機(jī)(Sigma，美國(guó))；TE212-L型電子天平(Sartorius公司，德國(guó))；TANON-6100型顯影儀器(Tanon，中國(guó))；倒置顯微鏡(Thermo，美國(guó))；水浴鍋(美的，中國(guó))；-80℃低溫冰箱(海爾，中國(guó))；680型酶標(biāo)儀(BIO-RAD，美國(guó))；DU800型紫外可見分光光度計(jì)(BECKMAN COULTER，美國(guó))；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(信然實(shí)業(yè)有限公司，中國(guó))；DHG-9146A型熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，中國(guó))。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇MDA-MB-231細(xì)胞后，培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取之后3 d處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞活力 單細(xì)胞懸液經(jīng)0.25%胰酶消化后接種于96孔板中(1×104個(gè)/孔)，設(shè)置6個(gè)平行孔，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，分別加入含不同濃度SSD(0、1、5、10、20、50、100 μmol/L)的培養(yǎng)基處理細(xì)胞，24 h后加入20 μl MTT(5 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)基后，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶物溶解。最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值(檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm)，記錄結(jié)果并計(jì)算各組存活率，細(xì)胞存活率(%)=各組的吸光度值/對(duì)照組的吸光度值×100%。

1.2.3Western印跡檢測(cè)人缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-I、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)-6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)24 h貼壁后，吸去DMEM培養(yǎng)基，分為對(duì)照組(不加入SSD)和實(shí)驗(yàn)組(加入20 μmol/L的SSD)，每皿10 ml，每組3個(gè)重復(fù)。藥物處理24 h后棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后加適量裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上靜置裂解40 min取出，于4℃離心機(jī)上以3 000 r/min離心5 min左右，取上清液進(jìn)行BCA法測(cè)定所提取的蛋白質(zhì)濃度。調(diào)整蛋白濃度進(jìn)行10%SDS-PAGE分離，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，TBST漂洗1次后5%脫脂奶粉搖床封閉2 h，分別加入適量稀釋后一抗兔抗人CX43多克隆(1∶2 000)、兔抗人mTOR單克隆(1∶1 000)、兔抗人P70s6K多克隆(1∶2 000)、β-actin兔單克隆 (1∶1 000)，4℃搖床孵育過夜；TBST洗膜15 min第一次，10 min×2次，分別加入相應(yīng)二抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶3 000，應(yīng)用于IGFBP-6、β-actin、VEGF)、山羊抗小鼠(1∶5 000，應(yīng)用于HIF-1)，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST 洗滌5 min×3次，取出PVDF膜，瀝干膜上的洗膜液，將ECL液均勻加在PVDF膜確保覆蓋整張膜，包好避光孵育1～2 min，置于Bio-rad自動(dòng)顯影儀進(jìn)行目的蛋白顯影，保存圖像后進(jìn)行圖像分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組MDA-MB-231細(xì)胞存活率比較 1、5、10、20、50、100 μmol/L SSD對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞存活率〔(101.00±3.91)%、(94.51±4.51)%、(90.51±6.17)%、(77.60±5.10)%、(65.00±8.50)%、(50.89±3.81)%〕呈劑量依賴性，且20、50、100 μmol/L SSD細(xì)胞存活率顯著低于對(duì)照組〔(100.00±6.64)%,P<0.05〕。

2.2各組MDA-MB-231細(xì)胞周期相關(guān)因子水平比較 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組HIF-1、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，IGFBP-6蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 各組MDA-MB-231細(xì)胞周期相關(guān)因子蛋白的表達(dá)

表1 各組MDA-MB-231細(xì)胞周期相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

乳腺癌是嚴(yán)重影響女性健康的惡性腫瘤之一且發(fā)病率逐年呈上升趨勢(shì)〔8〕。SSD在抗炎、抗氧化和抗癌方面均有作用〔9〕。其抗癌的機(jī)制主要是通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化、凋亡，從而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，或者調(diào)節(jié)免疫并調(diào)控癌細(xì)胞自噬等〔10〕。細(xì)胞周期進(jìn)程介導(dǎo)細(xì)胞增殖分裂，當(dāng)細(xì)胞缺失周期調(diào)控功能時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡失衡形成癌細(xì)胞。因此，細(xì)胞周期的調(diào)控已成為消除癌細(xì)胞的有效策略之一〔11〕。本研究結(jié)果說明誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能通過SSD調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。VEGF可促進(jìn)血管通透性增加和血管生成。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF的表達(dá)與乳腺癌患者腫瘤直徑、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)，提示VEGF與乳腺癌患者的疾病進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)〔12，13〕。HIF-1在腫瘤中可參與糖酵解途徑和葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而影響腫瘤代謝，甚至促進(jìn)腫瘤的惡性轉(zhuǎn)變和抗放化療等〔14〕。IGFBPs家族中的IGFBP-6在許多組織中都能廣泛表達(dá)，魏峰等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)信號(hào)素(SEMA3B)可通過促進(jìn)IGFBP-6的表達(dá)，發(fā)揮腫瘤抑制作用。

綜上，SSD可能通過降低MDA-MB-231細(xì)胞周期相關(guān)因子HIF-I、VEGF蛋白的表達(dá)，同時(shí)升高細(xì)胞周期相關(guān)因子IGFBP-6蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，以達(dá)到治療TNBC的目的。