七福飲調(diào)控JAK2/STAT3通路改善2型糖尿病認(rèn)知障礙的效應(yīng)與機(jī)制

劉 玲，張靜文，張瑞華，史磊磊，王 晨，韓朝軍，史永恒，王 斌，劉繼平

(陜西中醫(yī)藥大學(xué), 陜西 咸陽(yáng) 712000)

糖尿病認(rèn)知障礙(diabetic cognitive impairment，DCI)是一種以輕度認(rèn)知功能障礙為主的糖尿病并發(fā)癥，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)2型DCI的發(fā)病概率高于1型，且隨著病程的發(fā)展極易轉(zhuǎn)化為阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)[1-3]。同時(shí)，高血糖也被認(rèn)為是AD的重要發(fā)病因素之一[4]。但導(dǎo)致2型DCI和AD的發(fā)病機(jī)制目前還未完全闡明，長(zhǎng)期高血糖刺激導(dǎo)致的慢性神經(jīng)炎癥可能是其共同的發(fā)病基礎(chǔ)[5]。小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia，MG)是中樞免疫反應(yīng)的主要參與者，具有調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)等功能，另外其分泌的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能[6]。慢性糖尿病患者腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)被激活，分泌大量促炎因子和促氧化物質(zhì)導(dǎo)致持續(xù)性炎癥從而危害認(rèn)知功能[7]。因此調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化可能是2型DCI的治療靶點(diǎn)。

JAK/STAT(Janus kinase /signal transducer and activator of transcription)通路與細(xì)胞因子表達(dá)密切相關(guān)，是調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)鍵通路，研究發(fā)現(xiàn)酸棗仁湯減少APP/PS1小鼠Aβ積累、減輕神經(jīng)炎癥、改善認(rèn)知障礙的機(jī)制與抑制JAK2/STAT3通路表達(dá)有關(guān)[8]，但其與2型DCI的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

QFY是張景岳治療癡呆的傳統(tǒng)名方，研究發(fā)現(xiàn)QFY具有神經(jīng)保護(hù)作用，但其機(jī)制還未完全闡明[9]。QFY還具有一定抗炎、抗凋亡的作用[10]，所以QFY抗炎機(jī)制可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化、發(fā)揮修復(fù)神經(jīng)的功能相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探討QFY對(duì)2型DCI大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及對(duì)JAK2/STAT3通路變化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物12～24 周SPF級(jí)♂SD大鼠103只，體質(zhì)量(180～220) g，通過(guò)成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)買(mǎi)，許可證號(hào)：SCXK(川)2020-030，于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房飼養(yǎng)，本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 藥物與試劑QFY組成為人參6 g，熟地9 g，當(dāng)歸9 g，白術(shù)(炒)5 g，炙甘草3 g，酸棗仁6 g，制遠(yuǎn)志5 g。以上中藥飲片均購(gòu)于咸陽(yáng)宜家大藥房，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室顏永剛教授鑒定為正品，符合2020版《中國(guó)藥典》一部相關(guān)規(guī)定。按照處方比例，十倍水煎煮1 h，收集濾液，殘?jiān)影吮端^續(xù)煎煮40 min，過(guò)濾后合并濾液，減壓濃縮成生藥濃度分別為0.43 kg·L-1和0.86 kg·L-1的藥液，4 ℃保存。按照1 mL/100 g的體積灌胃。鹽酸二甲雙胍片(格華止，規(guī)格：0.5 g/片，中美上海施貴寶制藥有限公司)；鏈脲佐菌素(Sigma公司)；p-JAK抗體(3776S)、JAK抗體(3230S)、p-STAT3抗體(9145S)、STAT3抗體(9139S)均購(gòu)于Cell Signaling Technology公司，β-actin抗體(10004156)購(gòu)自Proteintech公司；Iba-1抗體(GB12105)購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；羊抗小鼠(BA1050)、羊抗兔(BA1054)、超敏ECL化學(xué)發(fā)光液(AR1197)均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。ELISA試劑盒TNF-α(ml002859)、IL-6(ml102828)、IL-10(ml002813)和BDNF(ml302829)均購(gòu)自于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 儀器羅氏血糖儀(羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)；Morris水迷宮(上海吉量軟件科技有限公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BIOTEK公司)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad)；正置熒光顯微鏡與成像系統(tǒng)(日本尼康)。

1.4 方法

1.4.12型DCI模型建立及分組 造模方法參考[11]，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分組，空白組10只，造模組93只。空白組飼喂普通飼料，造模組給予自制高脂高糖飼料(含基礎(chǔ)飼料59%、蔗糖20%、豬油18%、蛋黃3%)喂養(yǎng)4周，禁食16 h，造模組腹腔注射STZ 35 mg·kg-1，空白組注射相同劑量檸檬酸緩沖液。72 h后使用血糖儀檢測(cè)尾靜脈血糖，低于11.1 mmol·L-1的大鼠繼續(xù)補(bǔ)打1次，取空腹血糖>11.1 mmol·L-1的大鼠繼續(xù)給予高脂高糖飼料8周，最后1 d測(cè)定血糖，剔除未達(dá)標(biāo)大鼠。水迷宮證明造模成功后設(shè)立模型組、QFY低(4.3 g·kg-1)、高(8.6 g·kg-1)組、二甲雙胍(200 mg·kg-1)組，每組各10只。灌胃4周后d 2禁食不禁水12 h，檢測(cè)各組血糖。

1.4.2行為學(xué)檢測(cè) 采用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮四個(gè)象限邊緣設(shè)置標(biāo)記，在目標(biāo)象限設(shè)置一水平平臺(tái)后注水使水面沒(méi)過(guò)平臺(tái)，確保大鼠無(wú)法看見(jiàn)平臺(tái)，分別從4個(gè)象限將大鼠頭朝池壁放入水中，訓(xùn)練大鼠尋找平臺(tái)。連續(xù)訓(xùn)練5 d，記錄其逃避潛伏期，于d 6撤去平臺(tái)，記錄大鼠在目標(biāo)象限的穿越次數(shù)。

1.4.3樣本采集 水迷宮測(cè)試結(jié)束后d 2麻醉取材。每組隨機(jī)選擇4只大鼠灌注后取出完整大腦置于4%多聚甲醛中，用于病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)和免疫熒光染色；其余大鼠先腹主動(dòng)脈采血得到血清，然后迅速脫頸處死取出兩側(cè)海馬組織，液氮速凍后與血清一同存放于-80 ℃。左側(cè)海馬制備成10%組織勻漿用于試劑盒檢測(cè)，右側(cè)海馬進(jìn)行免疫蛋白印跡分析，全程在冰上操作。

1.4.4觀察指標(biāo)與方法

1.4.4.1尼氏染色 腦組織在4 ℃、4%多聚甲醛溶液中固定24 h，隨后乙醇梯度脫水，二甲苯透明、兩次浸蠟、常規(guī)石蠟包埋、5 μm厚切片進(jìn)行尼氏染色，400倍顯微鏡下觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞中尼氏小體的含量。

1.4.4.2免疫熒光染色 石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，封閉，加Iba-1一抗(1 ∶3 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，加二抗。DAPI復(fù)染細(xì)胞核，淬滅組織自發(fā)熒光，封片后鏡檢掃描，觀察并計(jì)數(shù)海馬DG區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1的表達(dá)。DAPI為藍(lán)色熒光，Iba-1為紅色熒光。

1.4.4.3血清炎癥因子/抑炎因子及海馬中BDNF的檢測(cè) 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-10和BDNF的含量。

1.4.4.4Western blot 取大鼠右側(cè)海馬加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑后，在低溫冷凍研磨儀中充分研磨，4 ℃離心取上清液，BCA蛋白定量后，等量蛋白上樣，通過(guò)SDS-PAGE電泳分離，并轉(zhuǎn)移至0.22 μm PVDF膜上，在TBST中清洗后在5%的脫脂牛奶中封閉1 h,分別加入按比例配好的一抗：p-JAK2(1 ∶1 000)、JAK2(1 ∶1 000)、p-STAT3(1 ∶1 000)、STAT3(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶20 000)，4 ℃過(guò)夜；TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗：山羊抗鼠、山羊抗兔室溫孵育1 h；TBST洗膜3次,每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，利用ImageJ計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 QFY對(duì)2型DCI大鼠干預(yù)前后空腹血糖及體質(zhì)量的影響Tab 1結(jié)果表明，4周后，模型組FBG明顯高于空白組(P<0.01)，而QFY(8.6 g·kg-1)組和二甲雙胍組血糖明顯低于模型組(P<0.05)；但各組與四周前相比較發(fā)現(xiàn)，模型組以及QFY(4.3 g·kg-1)組血糖均比干預(yù)前明顯上升(P<0.05，0.05)，而QFY(8.6 g·kg-1)組和二甲雙胍組則升高血糖不明顯，說(shuō)明QFY(8.6 g·kg-1)組可以有效抑制2型DCI大鼠體內(nèi)血糖的持續(xù)升高。另外，模型組體質(zhì)量明顯低于空白組(P<0.01)，而各給藥組體質(zhì)量與模型組相差不大；但各組與四周前相比較發(fā)現(xiàn)，空白組體質(zhì)量明顯上升(P<0.01)，模型組、二甲雙胍組以及QFY(8.6 g·kg-1)組體質(zhì)量均比4周前明顯下降(P<0.01，0.05，0.05),而QFY(4.3 g·kg-1)組則和4周前相差不明顯，說(shuō)明QFY組對(duì)抑制2型DCI大鼠體質(zhì)量持續(xù)下降的影響不大。

Tab 2 Effect of QFY on escape latency and number of crossings in type 2 DCI rats / M±IQR，n=9-10)

2.2 QFY對(duì)2型DCI大鼠水迷宮成績(jī)的影響隨著訓(xùn)練時(shí)間的增加，各組大鼠的逃避潛伏期均呈下降趨勢(shì)。但在d 5時(shí)，模型組大鼠逃避潛伏期明顯高于空白組(P<0.05)，而QFY低(P<0.01)、高劑量組(P<0.05)和二甲雙胍組(P<0.01)的逃避潛伏期均明顯低于模型組，這表明模型組的空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損，而QFY和二甲雙胍干預(yù)后，學(xué)習(xí)記憶能力得到改善；撤去平臺(tái)后，模型組穿越目標(biāo)平臺(tái)次數(shù)明顯低于空白組(P<0.05)，而高劑量組(P<0.01)和二甲雙胍組(P<0.05)大鼠穿越平臺(tái)成績(jī)則明顯高于模型組。綜上，QFY干預(yù)后，2型DCI大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力能得到明顯提升。

2.3 QFY對(duì)2型DCI大鼠海馬尼氏染色的影響400×尼氏小體廣泛存在于神經(jīng)元的胞體中，尼氏小體分布均勻、數(shù)量多說(shuō)明神經(jīng)細(xì)胞代謝功能強(qiáng)，若細(xì)胞受損，尼氏小體會(huì)減少甚至消失。對(duì)比空白組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)，模型組神經(jīng)元排列稀疏，細(xì)胞形態(tài)大小不一，部分胞體皺縮，胞內(nèi)尼氏小體著色淺、數(shù)量明顯減少，可見(jiàn)不同程度神經(jīng)元損傷。而給予QFY和二甲雙胍后，神經(jīng)元形態(tài)較好，胞內(nèi)尼氏小體的數(shù)目比模型組明顯增多，說(shuō)明QFY干預(yù)可以有效減輕2型DCI大鼠神經(jīng)元損傷，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用，見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Effect of QFY on Nissl bodies of hippocampus CA1 in type 2 DCI rats (×400) QFYL and QFYH represented QFY low and high dose group.

2.4 QFY對(duì)2型DCI大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的影響Iba-1是小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，模型組海馬DG區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多(P<0.01)，而給予QFY不同劑量(P<0.01)和二甲雙胍(P<0.05)后均能有效降低小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目，保護(hù)海馬免受炎癥損傷,見(jiàn)Fig 2,3。

Fig 2 Effect of QFY on expression of Iba-1 in hippocampus DG in type 2 DCI rats (×15)A: Control，B: Model，C: Metformin，D: QFYD，E: QFYH

Fig 3 Immunofluorescence results of Iba-1 in hippocampus DG n=4)##P<0.01 vs control；*P<0.05，**P<0.01 vs model.

2.5 QFY對(duì)2型DCI大鼠TNF-α、IL-6、IL-10和BDNF含量的影響與空白組相比，模型組血清中TNF-α(P<0.01)、IL-6(P<0.01)含量明顯升高，IL-10(P<0.01)和海馬組織中BDNF(P<0.01)明顯下降，說(shuō)明2型DCI會(huì)引起大鼠體內(nèi)炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)升高、抑炎因子IL-10和BDNF表達(dá)下降；給予QFY后，大鼠血清中TNF-α(P<0.05)和IL-6(P<0.05)的水平明顯下降，抑炎因子IL-10(P<0.01)明顯升高，BDNF的水平也明顯上升(P<0.01),見(jiàn)Tab 3。

Tab 3 Effect of QFY on contents of TNF-α, IL-6, IL-10 and BDNF in type 2 DCI rats , n=6)

Tab 4 Effect of QFY on expression of JAK2/STAT3 pathway in type 2 DCI n=6)

2.6 QFY對(duì)2型DCI大鼠JAK2/STAT3通路表達(dá)的影響與空白組相比，模型組的p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3的比值均明顯升高，而QFY不同劑量組和二甲雙胍組則能明顯降低JAK2和STAT3的磷酸化水平,見(jiàn)Fig 4。

Fig 4 Effect of QFY on expression of JAK2/STAT3 pathway in type 2 DCI rats A:Control，B: Model，C: Metformin，D: QFYD，E: QFYH)

3 討論

根據(jù)目前報(bào)道降糖藥二甲雙胍、格列本脲和羅格列酮等[12]雖然能減輕糖尿病認(rèn)知損傷，但尚無(wú)有效針對(duì)治療2型DCI的藥物上市，仍需對(duì)其機(jī)制進(jìn)行深入研究。采用中醫(yī)藥治療2型DCI具有一定優(yōu)勢(shì)，糖尿病久之則心脾兩虛，痰瘀互結(jié)，蒙蔽清竅，出現(xiàn)健忘癡呆，而QFY可扶正祛邪，杜絕痰瘀之內(nèi)生，又榮養(yǎng)腦神，改善病理?yè)p傷，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致，QFY能有效提升2型DCI大鼠水迷宮成績(jī)，提高其學(xué)習(xí)記憶能力，減輕神經(jīng)元損傷。相比模型組大鼠，QFY(8.6 g·kg-1)能明顯降低空腹血糖。注射STZ后，模型組血糖水平在4周內(nèi)持續(xù)升高，但QFY(8.6 g·kg-1)可以抑制血糖上升，使血糖水平保持穩(wěn)定，這可能使神經(jīng)病變的概率減小[3]。

近年來(lái)，2型糖尿病的“炎癥學(xué)說(shuō)”被廣泛關(guān)注，部分學(xué)者認(rèn)為其是一種慢性免疫性疾病，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)小鼠飼喂高脂飼料并注射STZ后使其血糖升高能明顯增加其外周和海馬炎癥的發(fā)生，促進(jìn)增加小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞[13]。小膠質(zhì)細(xì)胞活化后，能激活NADPH酶，釋放超氧陰離子以及促炎因子IFN、TNF-α、IL-6、IL-1β等損傷神經(jīng)元，除此之外，小膠質(zhì)細(xì)胞還可以通過(guò)分泌BDNF、吞噬突觸等功能影響大腦發(fā)育和可塑性。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，QFY不同劑量組能明顯降低血清促炎因子TNF-α、IL-6水平，增加抑炎因子IL-10水平和海馬BDNF的含量，有效降低海馬部位Iba-1陽(yáng)性表達(dá)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化。

JAK2/STAT3作為調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化的通路之一，可響應(yīng)炎癥因子如IL-6，被炎癥激活。研究發(fā)現(xiàn)抑制JAK2/STAT3通路磷酸化能有效改善大鼠腦缺血再灌注損傷[14-15]。本研究結(jié)果顯示，QFY不同劑量組能明顯抑制JAK2、STAT3的磷酸化水平，從而抑制炎癥。

綜上，本文研究結(jié)果顯示，QFY具有改善2型DCI大鼠認(rèn)知功能、降低空腹血糖值、減輕神經(jīng)炎癥等作用，其機(jī)制與調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路及抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化、保護(hù)神經(jīng)元等有關(guān)，為深入探究QFY的化痰祛瘀、扶正祛邪及腦保護(hù)作用提供了重要參考。