乳腺癌肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成機制及中醫(yī)藥干預(yù)研究進展

韓鴻寬，陶睿智，王愛云，2，吳媛媛，李曉曼，韋忠紅，陸 茵，2

(1．南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，2．南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

2020年，據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)統(tǒng)計結(jié)果顯示，乳腺癌超越肺癌成為全球發(fā)病率最高的癌癥[1]。乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，根據(jù)分子以及組織病理特征可分為3種亞型：雌激素受體(ER)或孕激素受體(PR)陽性，人類表皮生長因子受體(HER)陽性、三陰型乳腺癌(ER-、PR-、HER-)。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展到遺傳，環(huán)境等多種因素的影響。對于原發(fā)部位的乳腺癌，已有靶向藥物以及手術(shù)切除方法進行治療，而大多數(shù)乳腺癌患者往往因轉(zhuǎn)移而死亡。乳腺癌常見的轉(zhuǎn)移部位有肺臟、骨髓、肝臟等。乳腺癌對于特定器官轉(zhuǎn)移的傾向性受到乳腺癌分子分型的影響，其中以三陰性乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移率最高。臨床上，其中大約60%～70%的乳腺癌患者因肺轉(zhuǎn)移而死亡。因此，探究乳腺癌轉(zhuǎn)移機制對于臨床上乳腺癌轉(zhuǎn)移患者的治療至關(guān)重要。

近年來，大多數(shù)研究都聚集在了PMN形成的機制研究上。PMN是由原發(fā)部位的腫瘤通過分泌腫瘤衍生因子，細胞外囊泡等到達腫瘤未來的轉(zhuǎn)移部位，并引發(fā)一系列有利于腫瘤生存定植的生物學(xué)事件，例如引起轉(zhuǎn)移部位炎癥、血管滲漏、募集骨髓來源細胞等從而改變轉(zhuǎn)移器官的微環(huán)境以適應(yīng)循環(huán)腫瘤細胞的定植[2-3]。因此，PMN的形成在原發(fā)腫瘤進行遠端轉(zhuǎn)移的過程中具有重要作用。然而，PMN的形成機制較為復(fù)雜，受到多種細胞以及相關(guān)細胞因子的調(diào)控。因此，闡明PMN的形成機制對后續(xù)的抑制腫瘤PMN形成的治療是至關(guān)重要的。近年來，乳腺癌PMN的形成機制被不斷揭示，干預(yù)乳腺癌PMN也逐漸成為治療乳腺癌轉(zhuǎn)移的一種重要手段。中醫(yī)藥治療疾病具有多靶點、多環(huán)節(jié)的作用特點，目前使用中醫(yī)藥對多種疾病已有確切療效。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)中，中醫(yī)藥的干預(yù)能起到主要或輔助治療作用。因此，中醫(yī)藥干預(yù)PMN的形成有望成為一種有效的治療手段。本文綜述了乳腺癌肺PMN的發(fā)生的機制以及中醫(yī)藥干預(yù)治療的研究進展，為后續(xù)的治療研究提供了思路。

1 轉(zhuǎn)移前微環(huán)境(PMN)

1889年，Piget的種子土壤假說表明腫瘤轉(zhuǎn)移依賴于種子(腫瘤)以及土壤(轉(zhuǎn)移器官微環(huán)境)相互作用，在之后的一個世紀里，相繼有學(xué)者發(fā)表不同觀點，James Ewing在1928年提出腫瘤轉(zhuǎn)移僅僅依賴于血液動力學(xué)，而在1976年Isaiah Fidler利用靜脈注射以及心內(nèi)注射模型表明循環(huán)腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移定植不僅取決于血液動力學(xué)的因素，腫瘤本身具有一定的轉(zhuǎn)移傾向性[4]。那么，在轉(zhuǎn)移過程中腫瘤與靶器官之間是否具有相互作用，其作用機制又是什么？直到2005年，Kaplan等[3]第一次提出了PMN這一概念，他們觀察到在LLC的皮內(nèi)原位模型中，VEGFR1+的骨髓來源造血祖細胞比腫瘤率先到肺臟，并使肺中血管異?；瘡亩鵀檗D(zhuǎn)移提供有利的定植條件。同時，他們使用黑色素瘤的條件培養(yǎng)基與LLC細胞共孵育后再注射至小鼠體內(nèi)時，LLC轉(zhuǎn)移到了黑色素瘤常見的轉(zhuǎn)移部位中，這凸顯出了腫瘤來源的分泌因子在腫瘤轉(zhuǎn)移器官傾向性中的重要作用。與此相符的是，近幾年來的大量研究都表明腫瘤來源的外泌體以及細胞外囊泡在PMN形成中的重要作用。

然而，腫瘤衍生因子(TDSF)在形成PMN過程中需要與靶器官中的多種細胞進行復(fù)雜的相互作用，以此使原本正常器官發(fā)生病變從而建立起PMN。PMN也具有6大特征，包括炎癥、免疫抑制、血管滲漏等。TDSF可以通過募集骨髓來源細胞，促使轉(zhuǎn)移靶器官中血管通透性增加以及介導(dǎo)炎癥信號來為之后的CTC定植提供有利環(huán)境。然而，不同類型的癌癥以及轉(zhuǎn)移靶器官導(dǎo)致PMN中的成分也各不相同，同時這也決定了PMN的形成機制也有所差異。因此，PMN的形成機制仍在不斷被研究之中。

2 乳腺癌肺PMN形成機制

乳腺癌的不同亞型具有不同的侵襲性，其中以三陰性乳腺癌(又稱基底樣乳腺癌)的侵襲性最強。同樣，乳腺癌的不同亞型也是乳腺癌具有不同器官轉(zhuǎn)移傾向性的主要原因之一，而三陰性乳腺癌細胞往往具有高肺轉(zhuǎn)移的特點。臨床上，大約有60%～70%的乳腺癌患者因診斷為肺轉(zhuǎn)移而發(fā)生死亡[5]。有研究表明[6]，肺轉(zhuǎn)移在ER+/PR+的乳腺癌患者占約21%，在HER2+乳腺癌患者占約25%，肺轉(zhuǎn)移在三陰性乳腺癌中更是占到了40%。但目前，不同乳腺癌分子分型在肺轉(zhuǎn)移的時間點以及轉(zhuǎn)移的分子機制目前仍未研究清楚。因此，需要充分了解乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的機制以應(yīng)對乳腺癌肺轉(zhuǎn)移。

2.1 血管滲漏肺作為一種血管網(wǎng)絡(luò)較為豐富的器官，是血液流通的重要樞紐，然而這也同樣為乳腺癌的轉(zhuǎn)移提供了便利。血管滲漏是PMN形成最早發(fā)生的生物學(xué)事件。血管通透性的增加是血管滲漏的重要標志之一。肺血管通透性的增加不僅有助于PMN的形成，也為腫瘤轉(zhuǎn)移外滲出血管促進肺定植提供了有利條件。研究表明[7]，乳腺癌分泌的miR-105靶向破壞肺微血管內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白ZO-1從而增加血管通透性促進乳腺癌肺轉(zhuǎn)移。Jiang等[8]利用4T1原位小鼠模型發(fā)現(xiàn)血清中升高的血管內(nèi)皮生長因子VEGF誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移前肺微血管緊密連接蛋白ZO-1破壞，該機制可能與VEGF-PKC途徑相關(guān)，使用貝伐單抗阻斷VEGF可逆轉(zhuǎn)其誘導(dǎo)的血管通透性增加。另一項研究發(fā)現(xiàn)，occludin 磷酸化/泛素化途徑也可能是肺PMN中VEGF誘導(dǎo)肺血管通透性過高的機制[9]。Liu等[10]發(fā)現(xiàn)原位乳腺癌誘導(dǎo)肺中總血管密度增加，體外使用VEGF可誘導(dǎo)小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(MPVEC)中前列腺素E2(PGE2)的產(chǎn)生并增強4T1細胞的黏附。環(huán)氧合酶2(COX-2)抑制劑塞來昔布的治療顯著降低了4T1細胞對MPVEC的黏附，同時減少了癌癥轉(zhuǎn)移。

雖然使用VEGF等靶向藥物能夠逆轉(zhuǎn)PMN形成過程中所帶來的血管異常，但靶向藥物帶來的副作用同樣也是十分嚴重，并且臨床上目前單抗藥物并非有應(yīng)用于治療轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的方案。因此，單抗藥物靶向治療腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的有效性以及安全性仍然需要進一步的研究闡明。由于，中醫(yī)藥的治療具有毒副作用小的特點，針對靶點進行中藥的開發(fā)也不失為一項有前途的治療策略。

2.2 骨髓來源細胞(BMDC)骨髓來源細胞(BMDC)也是該形成過程中的重要角色，BMDC包括中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞等。雖然以中性粒細胞、巨噬細胞為代表的骨髓來源免疫細胞是體內(nèi)重要的炎癥細胞。但隨著單細胞組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，BMDC的高度異質(zhì)性已被闡明，不同表型的BMDC在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演了不同的角色，在PMN形成的過程中，BMDC被表明介導(dǎo)了PMN中的免疫抑制反應(yīng)，通過釋放相關(guān)細胞因子如IL-10、Arg-1等抑制T、NK細胞的活化，從而抑制其抗腫瘤活性以促進轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞逃避免疫殺傷。在臨床上，患者腫瘤微環(huán)境中的中性粒細胞以及巨噬細胞的浸潤與患者的不良預(yù)后相關(guān)。因此，BMDC目前已經(jīng)成為了癌癥治療的一個重要靶點。

2.2.1VEGFR1+造血祖細胞(HPC) VEGFR1+造血祖細胞(HPC)是最早被發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤以及肺癌模型中在PMN中募集的一類骨髓來源細胞。Meng等[11]在構(gòu)建表達熒光素酶報告基因的MDA-MB-435s乳腺癌細胞小鼠肺轉(zhuǎn)移模型中也發(fā)現(xiàn)VEGFR1+CD133+的骨髓來源造血干細胞在肺中的募集增加，體內(nèi)使用MMP-9、PDGFR-α和PECAM-1的特異性抑制可減少VEGFR1+CD133+HPC的向肺中的募集并減少乳腺癌肺轉(zhuǎn)移。

然而，此類骨髓來源細胞在乳腺癌肺PMN中的研究較少，大部分的研究仍然集中于腫瘤相關(guān)中性粒細胞以及巨噬細胞對于乳腺癌肺PMN的影響。但已有使用VEGFR1的靶向藥物治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌，因此，該類細胞也可能成為治療乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的潛在靶點。

2.2.2腫瘤相關(guān)中性粒細胞(TAN) 中性粒細胞發(fā)源于骨髓造血祖干細胞，在骨髓中發(fā)育成熟后，其表面受體由CXCR4轉(zhuǎn)變?yōu)镃XCR2(IL-8)受體，通過血液中CXCL8的趨化作用下釋放進入血液循環(huán)中。中性粒細胞是人體抵抗病原微生物感染的第一道防線，然而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，腫瘤相關(guān)中性粒細胞(TAN)充當了雙面角色[12]。最早提出將TAN可以類似于巨噬細胞分為N1與N2表型的是Friedlander等[13]，N1型TAN通過直接或間接的細胞毒性發(fā)揮抗腫瘤活性[12]。N2型TAN通過DNA不穩(wěn)定或細胞因子和趨化因子的釋放刺激免疫抑制、腫瘤生長、血管生成和轉(zhuǎn)移[14]。TAN在促進腫瘤PMN形成中的作用目前已被證實。在Ⅰ型干擾素信號受損的小鼠[Ifnar1(-/-)]的LLC以及4T1小鼠皮下模型中，肺部出現(xiàn)了大量TAN的積累，并伴隨著肺部Bv8、MMP9、S100A8 和 S100A9蛋白水平表達升高以促進PMN的形成。Wang等[15]通過在4T1原位乳腺癌小鼠模型以及MMTV-PyMT自發(fā)性乳腺癌肺轉(zhuǎn)移小鼠模型中發(fā)現(xiàn)了一類中性粒細胞群體CD62Ldim中性粒細胞，該類中性粒細胞能夠通過CXCL12/CXCR4軸特異性趨化至肺中形成乳腺癌肺PMN。在一項關(guān)于尼古丁暴露對乳腺癌PMN的影響實驗中，尼古丁的長期暴露通過誘導(dǎo)并募集促腫瘤N2表型的中性粒細胞促進肺PMN的形成，進而激活LCN2(一種來自N2型TAN的分泌糖蛋白)釋放，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞MET過程，促進乳腺癌細胞在肺中的定植，使用紅景天苷能夠減少尼古丁暴露誘導(dǎo)的TAN的N2極化抑制其在PMN中的募集從而減少激素受體陰性的乳腺癌細胞肺轉(zhuǎn)移[16]。

TAN的募集同樣也受到原發(fā)乳腺癌細胞分泌的因子趨化作用的影響。在缺氧的原位乳腺癌腫瘤微環(huán)境下，其分泌的TDSF有助于骨髓來源的CD11b+/Ly6Cmed/Ly6G+粒細胞以及低細胞毒性的NK細胞在肺中的募集促進免疫抑制PMN的形成[17]。此外，有研究表明，原位乳腺癌分泌的氧甾醇通過募集N2型TAN從而促進肺PMN形成[18]。原位乳腺癌缺氧條件下誘導(dǎo)的酶碳酸酐酶IX(CAIX)通過刺激粒細胞樣的MDSC通過G-CSF募集至肺中形成PMN來促進轉(zhuǎn)移[19]。

因此，中性粒的表型對于乳腺癌肺PMN的形成至關(guān)重要，雖然已有多種靶向藥物抑制N2型TAN的趨化從而抑制乳腺癌肺轉(zhuǎn)移，但靶向藥物同樣也將N1型TAN的趨化抑制從而影響機體免疫。未來的研究應(yīng)著重于如何精準靶向N2型TAN同時保留N1型TAN從而協(xié)同促進抗腫瘤轉(zhuǎn)移。此外，阻斷原位乳腺癌分泌的TDSF進而抑制TAN的募集趨化同樣也是一個潛在的治療靶點。

2.2.3腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM) TAM目前已被報道通過多種機制促進乳腺癌轉(zhuǎn)移[20-21]，巨噬細胞在PMN中介導(dǎo)的免疫抑制反應(yīng)是由于巨噬細胞的表型改變，在乳腺癌肺PMN形成過程中，CYP4A+TAM通過極化成M2表型并釋放TGF-β，VEGF和SDF-1增強VEGFR1+骨髓來源細胞在肺中的募集和成纖維細胞的活化[23]。因此，通過改變巨噬細胞的表型也可能是抑制PMN形成并抑制腫瘤遠端轉(zhuǎn)移的治療策略。

2.3 其他因素此外，乳腺癌肺PMN的形成與心理壓力也有關(guān)聯(lián)，在慢性不可預(yù)見性應(yīng)激(CUS)造模的尾靜脈乳腺癌轉(zhuǎn)移模型小鼠中，使用β-腎上腺素能激動劑異丙腎上腺素(ISO)處理小鼠能夠促進轉(zhuǎn)移前階段肺中巨噬細胞浸潤。該作用機制可能與ISO刺激上調(diào)了肺基質(zhì)細胞中CCL2和單核細胞/巨噬細胞中 CCR2 的表達，導(dǎo)致巨噬細胞募集和浸潤到轉(zhuǎn)移前的肺中。對β-腎上腺素能信號通路的藥理抑制能夠顯著抑制壓力誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移[24]。在使用高脂飲食的乳腺癌原位小鼠模型中，使用甘草酸(GA)能夠改善腸道微生物組成以及抑制M1樣結(jié)腸巨噬細胞介導(dǎo)的LPS/HMGB2/NF-κB信號來抑制CCL2和TNF-α的產(chǎn)生，從而抑制Gr-1+骨髓細胞的遷移和S100A8/9的表達抑制肺PMN的形成[25]。

由此可見，在乳腺癌肺PMN的形成機制過程中，除了已被大部分研究表明的血管滲漏以及免疫抑制等機制之外，仍然存在著心理壓力，腸道菌群等因素的調(diào)控影響。這為后續(xù)的PMN的形成機制研究拓寬了思路，同樣也揭示了豐富的潛在治療靶點。

3 中醫(yī)藥干預(yù)肺PMN形成治療研究

中醫(yī)治療腫瘤PMN的理論始于2007年，大多學(xué)者認為中醫(yī)藥治療PMN符合“治未病”的中醫(yī)學(xué)術(shù)理論，中醫(yī)認為腫瘤PMN的形成是由于轉(zhuǎn)移靶器官“正虛”，以及受到“癌毒”侵擾以及具有“氣滯痰凝血瘀”的病理狀態(tài)。并提出以“扶正培本、清熱解毒、理氣祛痰，活血化瘀法”改善PMN，從而抑制患者腫瘤轉(zhuǎn)移，改善腫瘤患者的預(yù)后。

目前，已有報道中醫(yī)藥在干預(yù)腫瘤PMN中的治療作用。Tian等[26]通過對4T1原位荷瘤小鼠模型灌胃不同劑量的保元解毒湯發(fā)現(xiàn)，具有補氣血，增強免疫功能的保元解毒湯可以通過TGF-β/CCL9通路抑制具有免疫抑制功能的髓源抑制細胞(MDSC)在肺PMN中的積累從而延長了4T1荷瘤原位小鼠的生存時間并減少了腫瘤轉(zhuǎn)移。使用中藥消痞方能夠抑制乳腺癌PMN的形成從而抑制肺轉(zhuǎn)移，其機制是通過抑制M2型巨噬細胞上的CXCL1表達從而減少骨髓中的HSPC的募集以及其向MDSC的分化[27]。另一項研究表明使用中藥復(fù)方乳移平與桔梗聯(lián)用可以通過保護肺血管完整性來抑制纖維蛋白原的外滲，并中斷其與原位癌的相互作用，從而抑制炎癥性PMN的形成[28]。

乳腺癌肺PMN的形成機制復(fù)雜多變，受到腫瘤細胞、免疫細胞等多種細胞的互作調(diào)控，臨床上抑制乳腺癌肺PMN的形成目前也無任何靶向藥物的治療。中醫(yī)藥干預(yù)乳腺癌肺PMN的形成不僅符合中醫(yī)傳統(tǒng)理論，其相應(yīng)的實驗研究也表明其具有一定的科學(xué)內(nèi)涵。因此，利用中醫(yī)藥復(fù)方多成分，多環(huán)節(jié)，多靶點的整合調(diào)節(jié)作用的治療特點抑制乳腺癌肺PMN形成是一個具有前途的治療策略之一。

4 展望

臨床上，接受治療的乳腺癌肺轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后仍然很差。大部分患者在確診腫瘤之后已經(jīng)發(fā)生了遠端轉(zhuǎn)移。因此，對其的治療策略應(yīng)該盡早進行診斷治療。腫瘤PMN的形成是腫瘤遠端轉(zhuǎn)移的重要先決條件之一，干預(yù)腫瘤PMN的形成也成為近幾年來治療腫瘤轉(zhuǎn)移的重要治療策略。臨床上，目前對于PMN的檢測缺乏有效的手段[22]，但已有報道在乳腺癌動物模型中使用基于抗體的單光子發(fā)射計算機斷層掃描(SPECT)在體內(nèi)檢測以S100A8/A9 作為轉(zhuǎn)移前靶器官標記物的成像系統(tǒng)的應(yīng)用以檢測PMN中的免疫微環(huán)境狀態(tài)[29]。這可能為后續(xù)應(yīng)用基礎(chǔ)及臨床研究提供了方法。另外，通過3D生物打印技術(shù)構(gòu)建體外腫瘤微環(huán)境，使得研究精準研究腫瘤轉(zhuǎn)移分子機制成為了可能，這也為臨床前藥物篩選提供了平臺。同時，這可能也為PMN的體外研究并為PMN的精準治療提供思路。

由于PMN的形成機制復(fù)雜，治療的難度也大大提高。最近，在自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移的橫紋肌肉瘤小鼠模型中，有研究表明，可通過基因工程改造的骨髓來源細胞(GEMys)利用其歸巢特性將細胞因子IL-12遞送至肺部改善PMN從而減少腫瘤轉(zhuǎn)移，這為后續(xù)其他癌癥模型的PMN治療以及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[30]。以多成分、多靶點治療為特點的中醫(yī)藥可能是干預(yù)PMN形成的治療策略，目前對于中醫(yī)藥干預(yù)PMN的形成機制主要在于重塑免疫微環(huán)境，以及保護血管通透性方面。然而，PMN也具有代謝異常等特點，同時，改善免疫抑制微環(huán)境不僅取決于減少以骨髓來源細胞介導(dǎo)的免疫抑制反應(yīng)，同時也要激活T，NK細胞活化的相關(guān)的代謝途徑以促進其介導(dǎo)腫瘤殺傷效應(yīng)。那么，一方面從改善PMN代謝的角度出發(fā)是否也能夠起到干預(yù)治療腫瘤PMN的效果？另一方面配伍改善代謝與免疫微環(huán)境重塑的中藥是否可能有協(xié)同起效的作用？因此，仍然需要繼續(xù)對中醫(yī)藥的療效進行深度挖掘并加以創(chuàng)新。此外，未來或許可能利用構(gòu)建的體外PMN進行有效的中藥配伍成分的篩選。