MANF對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)小腸上皮細胞損傷的保護作用

陳 瀅，周 南，王 杰，倪倩倩，趙 倩

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)護理學(xué)院；2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科； 4. 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院新生兒科，安徽 合肥 230032)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)是蛋白質(zhì)折疊、翻譯后修飾以及分泌性蛋白和膜蛋白轉(zhuǎn)運的場所。環(huán)境和/或宿主的諸多因素可以造成ER應(yīng)激，繼而觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein reponse, UPR)[1]。此時細胞會產(chǎn)生一系列的保護反應(yīng)，通過抑制蛋白的翻譯、降解錯誤折疊蛋白以及促進錯誤蛋白的重新折疊，從而恢復(fù)ER的穩(wěn)態(tài)。但如果錯誤折疊蛋白超出了ER的清除能力，便會誘發(fā)持續(xù)的ER應(yīng)激，導(dǎo)致細胞凋亡，甚至細胞死亡[2]。

腸黏膜屏障是機體抵擋外來侵襲的一道重要防線。由于各種急慢性刺激，如病原菌入侵、缺血再灌注、膳食代謝物和毒素的影響等，均可導(dǎo)致腸上皮屏障的損傷，造成腸源性感染誘發(fā)腸道炎癥，繼而引起腸上皮細胞凋亡或壞死，甚至發(fā)展為全身炎癥反應(yīng)綜合征，直至患者死亡[2]。研究表明，多種細胞因子及其介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑參與腸道炎癥的發(fā)生和發(fā)展。其中，杯狀細胞、潘氏細胞等具有強大分泌功能的腸上皮細胞，其蛋白質(zhì)合成和加工的負荷較重，對ER應(yīng)激尤為敏感。近年來的研究表明，ER應(yīng)激參與腸上皮屏障功能的調(diào)節(jié)，是腸道炎癥發(fā)生的重要發(fā)病機制之一[5-6]。

中腦星形膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF)是一個高度保守的可溶性蛋白，分子量約為18 ku。運用微陣列技術(shù)篩選與ER應(yīng)激相關(guān)的基因發(fā)現(xiàn)，MANF是對ER應(yīng)激最為敏感的基因[7]。之后，多項研究均證明MANF在ER應(yīng)激相關(guān)疾病中具有明確的保護作用[8-12]。腦缺血可觸發(fā)ER應(yīng)激并增強MANF的表達，重組人MANF可促進神經(jīng)元的增殖，防止神經(jīng)元凋亡[8-9]。ER應(yīng)激相關(guān)蛋白在胰腺細胞特異性MANF缺陷小鼠中表達上調(diào)，重組MANF能促進胰腺β細胞的增殖，可能成為糖尿病再生治療的潛在靶點[10]。此外，我們前期的研究還表明，炎癥可以觸發(fā)ER應(yīng)激，促進MANF定位于細胞核，干擾p65與其靶基因啟動子結(jié)合，抑制NF-κB通路激活，從而抑制炎性滑膜細胞增殖[11]。MANF還可以通過抑制NF-κB/Snail信號通路，在肝臟ER應(yīng)激與炎癥的關(guān)系中發(fā)揮重要作用，可能是肝癌的潛在治療靶點[12]。

但是MANF在腸道炎癥中的作用尚無報道。由于MANF與ER應(yīng)激密切相關(guān)，且ER應(yīng)激是腸道炎癥發(fā)生發(fā)展的重要分子機制之一。本實驗擬在正常人小腸上皮細胞系FHs 74 Int中過表達MANF，并用ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑TM或TNF-α刺激，探究MANF對ER應(yīng)激誘導(dǎo)的腸道上皮細胞損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株及質(zhì)粒 細胞系FHs 74 Int購自北納生物公司；pEGFP-C2-MANF質(zhì)粒為安徽醫(yī)科大學(xué)沈玉先教授課題組惠贈；pEGFP-C2載體質(zhì)粒為本課題組保存。

1.1.2試劑 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、ECL發(fā)光液(美國Thermo Fisher Scientific公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；Tunicamycin(上海生工)；TNF-α(美國MCE公司)；MANF、cleaved caspase-3、CHOP、Bip、β-actin抗體(英國Abcam公司)；Bcl-2、Bax抗體(中國proteintech公司)；CCK8試劑盒(上海碧云天)；PE Annexin Ⅴ凋亡檢測試劑盒 (美國BD公司)。

1.1.3儀器 超凈工作臺(江蘇蘇靜集團)；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；CytoFLEX分析流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)

1.2 方法

1.2.1MANF過表達正常人小腸上皮細胞FHs 74 Int細胞 參照Lipofectamine 2000說明書將MANF-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染FHs 74 Int細胞，同步轉(zhuǎn)染空載體GFP為對照。轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡觀察各組轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2免疫印跡法(Western blot) 用裂解液裂解細胞，提取總蛋白，金屬浴煮沸樣品10 min，上樣15 μL至SDS-PAGE膠電泳，槽式濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至NC膜，封閉緩沖液封閉1 h后分別用MANF、Bip、CHOP、cleaved-caspase-3、β-actin等抗體于4 ℃冰箱過夜，二抗在室溫條件下孵育1 h后蛋白顯影。

1.2.3CCK8檢測細胞增殖 將FHs 74 Int細胞按相應(yīng)組別接種于96孔培養(yǎng)板中，按說明書加入CCK8溶液，孵育1 h，上機測定OD值。

1.2.4流式細胞術(shù)(flow cytometry)檢測細胞凋亡 分別收集相應(yīng)組別的FHs 74 Int細胞。以1 000 r·min-1轉(zhuǎn)速收集細胞沉淀，PBS清洗2遍。將10×Binding buffer用雙蒸水稀釋成1×Binding buffer，用1×Binding buffer將FHs 74 Int細胞重懸為1×109L-1細胞懸液。吸取100 μL加入流式管中，按照說明書添加5 μL的PE Annexin Ⅴ和7-AAD至各組樣品管，用移液器充分混勻后，室溫避光孵育15 min，上機前補加400 μL 1×Binding buffer用于檢測。

2 結(jié)果

2.1 ER應(yīng)激可誘導(dǎo)小腸上皮細胞內(nèi)MANF表達增多在正常人小上皮細胞FHs 74 Int細胞培養(yǎng)基中給予ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑TM (2 mg·L-1) 或TNF-α (0.785 μg·L-1)刺激后，MANF分別從加藥后3 h(Fig 1)和9 h(Fig 2)開始表達增多，并呈時間依賴關(guān)系。提示腸上皮細胞內(nèi)發(fā)生ER應(yīng)激的早期即可以誘導(dǎo)MANF的表達。

Fig 1 TM induced MANF expression in intestinal A: MANF protein levels at indicated time points were assessed by Western blot; B: The gray value was detected for A, *P<0.05, **P<0.01 vs 0 h.

Fig 2 TNF-α induced MANF expression in intestinal A: MANF protein levels at indicated time points were assessed by Western blot; B: The gray value was detected for A, **P<0.01 vs 0 h.

2.2 MANF抑制小腸上皮細胞內(nèi)的ER應(yīng)激分別將MANF-GFP與空載體GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染FHs 74 Int細胞，觀察到綠色熒光，提示外源性MANF在小腸上皮細胞中成功表達(Fig 3)。轉(zhuǎn)染后16 h，用TM刺激細胞24 h后觀察ER應(yīng)激指標。結(jié)果顯示，過表達MANF可以減少TM刺激后的ER應(yīng)激相關(guān)蛋白Bip、CHOP的表達(Fig 4)，提示MANF具有抑制ER應(yīng)激的作用。

Fig 3 Successful expression of exogenous MANF in intestinal epithelial cells Cell status was observed under a microscope (Left panel), and the expression of green fluorescent protein was observed under a fluorescence microscope (right panel) (magnification 200×).

Fig 4 MANF protected intestinal epithelial cells A: ER stress related proteins were detected via Western blot; B: The gray value was detected for A, **P<0.01 vs GFP+TM.

2.3 MANF促進腸上皮細胞增殖用TM誘導(dǎo)腸上皮細胞發(fā)生ER應(yīng)激后，CCK8細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)細胞增殖能力減弱，并呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系(Fig 5)。過表達MANF后可明顯提高小腸上皮細胞的增殖活性(Fig 6)。結(jié)果表明腸上皮細胞中過表達MANF可以促進細胞增殖。

Fig 5 ER stress had effects on proliferation of The CCK8 assay showed that TM inhibited cell viability in a dose-dependent manner. **P<0.01 vs control.

Fig 6 MANF promoted proliferation of intestinal epithelial cells1：GFP+DMSO； 2：MANF-GFP+DMSO； 3：GFP+TM； 4：MANF-GFP+TM. The influence of MANF on intestinal epithelial cell proliferation was detected by CCK8 assay. **P<0.01 vs GFP+DMSO； ##P<0.01 vs GFP+TM.

2.4 MANF抑制ER應(yīng)激誘導(dǎo)的小腸上皮細胞的凋亡Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染MANF-GFP質(zhì)?？梢燥@著降低TM誘導(dǎo)后FHs 74 Int細胞中促凋亡蛋白cleaved-caspase-3和Bax的生成，提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(Fig 7)；flow cytometry顯示，TM刺激后，GFP組發(fā)生凋亡的細胞比例(27.9±0.535 4)，高于MANF-GFP組發(fā)生凋亡的細胞比例(17.93±0.495 7)(Fig 8)。結(jié)果表明過表達MANF可以抑制ER應(yīng)激誘導(dǎo)的小腸上皮細胞的凋亡。

Fig 7 MANF inhibited TM-induced ER stress-mediated A: The expression of apoptosis-related proteins was detected by Western blot; B: The gray value was detected for A. **P<0.01 vs GFP+TM.

Fig 8 MANF inhibited TM-induced ER stress-mediated A: Representative flow cytometry density plots of apoptosis rates of intestinal epithelial cells; B: Statistical bar chart of A. 1：GFP+DMSO； 2：MANF-GFP+DMSO； 3：GFP+TM； 4：MANF-GFP+TM. **P<0.01 vs GFP+DMSO;##P<0.01 vs GFP+TM.

3 討論

功能失調(diào)的ER應(yīng)激和UPR是腸道炎癥的發(fā)病原因之一。因此，以減輕ER應(yīng)激為靶點的藥物可能是治療腸炎的有效選擇[13]。本研究表明，MANF可以明顯抑制小腸上皮細胞內(nèi)的ER應(yīng)激，促進腸上皮細胞的增殖能力并減少其凋亡。

MANF是一種對ER應(yīng)激敏感的可溶性分泌蛋白[7]。在腦缺血的早期即可上調(diào)表達，甚至早于ER應(yīng)激的標志性蛋白CHOP[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)FHs 74 Int細胞發(fā)生ER應(yīng)激后，內(nèi)源性的MANF分別從TM處理后3 h和TNF-α處理后9 h開始表達增多，再次證明ER應(yīng)激早期即可以誘導(dǎo)MANF的表達。

有研究表明[14-15]，MANF的表達上調(diào)是對ER應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，MANF的表達有助于緩解UPR。UPR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用主要依賴PERK、IRE1和ATF6 3種ER跨膜蛋白。在穩(wěn)態(tài)情況下，Bip結(jié)合并封閉上述3個信號分子，使其保持于非激活的狀態(tài)，并穩(wěn)定在ER膜上。但Bip和非折疊蛋白有更強的親和力，當(dāng)ER中滯留非折疊蛋白時，Bip則會同其結(jié)合，并釋放PERK、IRE1和ATF6，繼而激活UPR的3條信號通路。PERK和ATF6均可誘導(dǎo)CHOP的表達，故一般認為Bip和CHOP均為ER應(yīng)激的標志蛋白[1, 16]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑后，Bip和CHOP的表達增多。相較轉(zhuǎn)染空載體的對照組，MANF可以明顯抑制ER應(yīng)激相關(guān)蛋白Bip和CHOP的表達，表明MANF發(fā)揮抑制ER應(yīng)激的作用。

當(dāng)ER應(yīng)激持續(xù)加重，則會通過激活caspase-12和CHOP途徑誘導(dǎo)細胞的凋亡。ER應(yīng)激可以激活caspase-12，繼而切割caspase-9，使caspase-3激活，導(dǎo)致細胞凋亡[17]。在腸炎模型中，與全身缺失CHOP的小鼠相比，野生型小鼠腸黏膜中有大量凋亡細胞，提示CHOP基因表達上調(diào)加重了細胞凋亡和結(jié)腸炎的發(fā)生[18]。在本研究中，我們用Bcl-2, Bax和cleaved-caspase-3以及Annexin Ⅴ和7-AAD凋亡流式檢測來表征細胞凋亡的水平，發(fā)現(xiàn)MANF可以抑制ER應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡。同時我們還觀察到ER應(yīng)激抑制腸上皮細胞增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴的關(guān)系，提示ER應(yīng)激越嚴重，對上皮細胞的增殖抑制作用越明顯，但過表達MANF可明顯緩解此現(xiàn)象。

以上結(jié)果提示，MANF在腸上皮細胞發(fā)生ER應(yīng)激的早期即可明顯上調(diào)，并具有抑制ER應(yīng)激，促進腸上皮細胞增殖，抑制其凋亡的保護作用。從而發(fā)揮腸黏膜屏障保護和抑制腸道炎癥的潛在治療作用。然而MANF影響ER應(yīng)激發(fā)生的具體分子機制尚待闡明。本研究為MANF促進腸上皮細胞功能修復(fù)提供一定的理論依據(jù)。