多發(fā)性內(nèi)分泌腺腫瘤綜合征臨診應(yīng)對
——1 個多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤2A 型家系報道

龔曉娟 ，李和平 ，萬灃霆 ，樊麗婭 ，劉 淑 ，劉霄炫 ，李雨欣 ，郭 輝 ，賀雅毅

（1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，陜西西安 710061；2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710061）

多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病（multiple endocrine neoplasia, MEN）是一組多個不同的內(nèi)分泌腺腫瘤或者增生在同一個體先后或同時發(fā)生、以功能亢進(jìn)為主要表現(xiàn)的遺傳性疾病。根據(jù)病因及腫瘤組合不同，MEN可分為MEN1 及MEN2。按照2015 年美國甲狀腺協(xié)會（ATA）最新發(fā)布的《甲狀腺髓樣癌管理指南修訂版》，MEN2 分為 2 個亞型：MEN2A 及 MEN2B，并且將MEN2A 進(jìn)行了新的分類[1]。其中經(jīng)典型MEN2A最為常見，可同時并發(fā)甲狀腺髓樣癌、嗜鉻細(xì)胞瘤和（或）甲狀旁腺功能亢進(jìn)。目前，國內(nèi)外已報道超過1 000 例的MEN2A 散發(fā)或家系病例，由于不同腺體的腫瘤或者增生先后出現(xiàn)，如果未能詳細(xì)詢問家族史，可能會導(dǎo)致疾病的漏診及治療延遲。故在臨床中早期明確診斷MEN2A，對患者治療方式的選擇以及遺傳干預(yù)有重要意義。本研究通過對1 例疑診甲狀腺髓樣癌的患者進(jìn)行家族史的深入探究，對先證者及其家系成員進(jìn)行臨床診療分析及致病基因鑒定，追溯出家系中多例甲狀腺髓樣癌患者，1 例嗜鉻細(xì)胞瘤患者及2 例甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥患者。通過臨床篩查及基因鑒定使多名家系成員得到及時救治及隨訪，避免了病情延誤。本研究通過探討MEN2A 患者的臨床表現(xiàn)、分子標(biāo)記物以及基因型與表型間的關(guān)系，旨在提高臨床醫(yī)師對甲狀腺髓樣癌以及可能潛在的多發(fā)性內(nèi)分泌腺腫瘤的重視和認(rèn)識，提高疾病的診斷率，為早期診治創(chuàng)造時機(jī)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的臨床診斷為MEN2A 的家系1 個。本研究經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批件號：XJTU1AF2021LSK-267）。家系內(nèi)所有參與研究的成員均簽署知情同意書。對經(jīng)手術(shù)確診為甲狀腺髓樣癌的6 例先證者及其家系成員進(jìn)行詳細(xì)病史回顧及資料收集（人口統(tǒng)計學(xué)資料、現(xiàn)病史、既往史、家族史及包括甲狀腺B 超、降鈣素和其他系統(tǒng)評估資料在內(nèi)的輔助檢查結(jié)果），繪制家系圖，完成RET基因檢測。

1.2 主要先證者病史

以本次就診的主要先證者（Ⅲ-10）為主線對病史展開敘述。52 歲女性，主因“發(fā)現(xiàn)甲狀腺結(jié)節(jié)3 月”入院。無頸部疼痛，無吞咽及呼吸困難，無怕熱、多汗等不適。查體：甲狀腺未觸及明顯腫大，無壓痛，雙側(cè)頜下淋巴結(jié)腫大，表面光滑，無壓痛。輔助檢查包括如下。

甲狀腺B 超見甲狀腺左葉8 mm×7 mm×7 mm極低回聲結(jié)節(jié)，邊界清，內(nèi)可見點(diǎn)狀強(qiáng)回聲；右葉19 mm×6 mm低回聲結(jié)節(jié)，內(nèi)似可見強(qiáng)回聲點(diǎn)。診斷“甲狀腺右葉結(jié)節(jié)TI-RADS5 類，甲狀腺左葉結(jié)節(jié)TI-RADS 4 類”。

甲狀腺腫瘤標(biāo)志物：降鈣素增高為135.8 pg/mL(正常：0～6.4 pg/mL)，CEA 升高為 8.32 ng/mL（正常：0～5 ng/mL）；甲狀旁腺激素升高為125.7 pg/mL（正常：15～65 pg/mL），維生素D3為9.6 ng/mL。甲狀旁腺掃描提示甲狀腺左葉上極后方結(jié)節(jié)灶，組織代謝增高，考慮功能亢進(jìn)之旁腺組織可能。甲狀腺功能、24 h尿兒茶酚胺、垂體磁共振及腎上腺CT 均正常。

先證者Ⅲ-10 疑診甲狀腺髓樣癌，行甲狀腺全切術(shù)+雙側(cè)頸部Ⅵ區(qū)淋巴結(jié)清掃，術(shù)后病理示甲狀腺左葉髓樣癌、右葉甲狀腺髓樣癌，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.3 主要先證者的家族史

1 個堂兄（Ⅲ-4）及 2 個侄子（Ⅳ-2，Ⅳ-7）曾因甲狀腺疾病行手術(shù)治療，后經(jīng)證實病理均為甲狀腺髓樣癌。

家系篩查及回顧：先證者1（Ⅲ-10）證實甲狀腺髓樣癌后對其家系部分成員進(jìn)行甲狀腺B 超及甲狀腺腫瘤標(biāo)志物篩查，抽取外周血行RET原癌基因檢測，并對既往家系中已經(jīng)確診為甲狀腺髓樣癌的家系成員進(jìn)行病例回顧。

1.4 RET 原癌基因檢測樣本的準(zhǔn)備

分別采集先證者及其家系成員的外周血于抗凝管中。用血液基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取外周血樣本DNA，用DENOVIX 超微量分光光度計（上海生物科技有限公司）檢測DNA 濃度及純度，并儲存于-80 ℃。

1.5 PCR 擴(kuò)增及RET 原癌基因突變檢測

從 UCSC 數(shù)據(jù)庫（http://ucscbrowser.genenetwork.org/）獲 取RET原癌基因 的 DNA 序列，使用NCBI-Primer 設(shè)計甲狀腺髓樣癌RET基因常見突變位點(diǎn)的引物6 對，由西安擎科生物有限公司進(jìn)行合成，引物序列如表1 所示。采用PCR 技術(shù)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 50 μL，包括 2×Master Mix 25 μL（西安潤德生物技術(shù)有限公司），上下游引物各2 μL，超純水 18 μL，DNA 樣本 3 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 3 min，變性 94 ℃ 30 s，退火 57 ℃ ～59 ℃（根據(jù)引物的不同進(jìn)行調(diào)整）30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)，終端延伸72 ℃5 min。反應(yīng)結(jié)束后取3 μL 反應(yīng)產(chǎn)物，置于20 g/L 瓊脂糖凝膠中電泳分離產(chǎn)物，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。選取片段位置正確的條帶進(jìn)行Sanger 測序檢測，測序由西安擎科生物有限公司完成。測序結(jié)果用DNA 序列分析軟件Chromas 進(jìn)行分析，結(jié)合人工校對，記錄后整理結(jié)果。

表1 RET 突變位點(diǎn)PCR 擴(kuò)增引物Tab. 1 PCR primers for RET mutation

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

致病性及保守性分析：利用在線軟件Uniport（https://www.uniprot.org/）獲取RET基因的 蛋白ID、FASTA 序列以及突變所在氨基酸位置，分析其在不同物種間的保守性。利用PolyPhen-2 軟件（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml）分析突變位點(diǎn)的致病性，HumDiv 和HumVar 模型均被評估。其中HumDiv 模型用來評估稀有等位基因、通過全基因組關(guān)聯(lián)研究確定區(qū)域的密集作圖和自然選擇分析，HumVar 是孟德爾遺傳病診斷的首選模型，它從所有剩余的人類變異(包括大量的輕度有害等位基因)中區(qū)分出具有嚴(yán)重影響的突變。

2 結(jié) 果

2.1 先證者及家系成員的一般情況及臨床特點(diǎn)

收集了36 個家系成員的人口統(tǒng)計學(xué)資料（包括年齡、性別、家系關(guān)系），部分家系成員完成甲狀腺功能、降鈣素、CEA 水平檢測（表2）及甲狀腺超聲檢查（表3）。其中經(jīng)手術(shù)病理證實為甲狀腺髓樣癌者6 人，2 人合并原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥，1 人合并嗜鉻細(xì)胞瘤。家系成員的家系圖譜如圖1 所示。

圖1 多發(fā)性內(nèi)分泌腺腫瘤2A 型患者的家系圖Fig.1 Pedigree of MEN2A family

2.2 RET 突變檢測及臨床資料分析結(jié)果

家系成員中有28 個家系成員（先證者Ⅳ-2 及其他7 位家系成員未采血）進(jìn)行了致病基因RET的突變鑒定（表2），發(fā)現(xiàn)先證者10 號外顯子上RET基因有1 個雜合子錯義種系點(diǎn)突變，每個突變攜帶者在RET中都只有1 個單點(diǎn)突變，均為c.1852T＞A，其編碼的蛋白質(zhì)第618 位的氨基酸由半胱氨酸變成了絲氨酸(p.Cys618Ser)（圖 2），而 8、11、14、15 和 16 外顯子中未發(fā)現(xiàn)任何RET突變。此外，除先證者外的其他家系成員中無證據(jù)表明RET存在雙突變或缺失/插入。PolyPhen2 軟件預(yù)測該突變可能具有致病性，其中HumDiv 模型預(yù)測得分為0.999，敏感性為0.14，特異性為0.99；HumVar 模型預(yù)測得分為0.968，敏感性為0.61，特異性為0.93。突變位點(diǎn)周圍區(qū)域與各種直系同源序列的多重比對顯示，p.Cys618Ser 在不同物種間高度保守。

圖2 先證者RET 基因10 號外顯子發(fā)生雜合錯義突變c.1852T＞A，導(dǎo)致p.Cys618SerFig. 2 Heterozygous missense mutation of c.1852T＞A,causing TGC（Cys）to TCC（Ser）at codon 618, in exon 10 of the RET proto-oncogene was detected in the proband

進(jìn)行RET基因檢查的28 名家系成員中，13 名(46.4%)檢測到RETCys618Ser 突變。在 13 例RET突變攜帶者中，12 例進(jìn)行了甲狀腺功能、降鈣素水平檢測及超聲學(xué)檢查，結(jié)果顯示12 例RETCys618Ser突變基因型攜帶者家系成員甲狀腺功能均正常，而血清降鈣素水平均有不同程度升高（表2）。上述12 例RETCys618Ser 突變基因型攜帶者家系成員均有甲狀腺超聲學(xué)異常改變（表3），其中3 例家系成員（Ⅳ-12、Ⅴ-2 及Ⅴ-10）表現(xiàn)為甲狀腺雙葉濾泡囊腫，年齡分別為33、10、7 歲，其余均表現(xiàn)為低回聲及混合回聲結(jié)節(jié)，部分結(jié)節(jié)內(nèi)鈣化。家系成員Ⅳ-3 基因型為野生型，但體檢時發(fā)現(xiàn)甲狀腺左葉實性結(jié)節(jié)，大小22 mm×14 mm，伴鈣化，但自測降鈣素水平正常，甲狀腺結(jié)節(jié)經(jīng)細(xì)針穿刺排除惡性病變。

表2 36 個家系成員的臨床特點(diǎn)及RET 基因檢測結(jié)果Tab.2 Clinical features and RET gene mutation of 36 family members

表3 13 例家系成員的甲狀腺超聲結(jié)果Tab.3 Ultrasound characteristics of 13 family mumbers

2.3 先證者資料分析情況

由于先證者Ⅳ-2 拒絕提供相關(guān)臨床資料，本研究對其他5 例甲狀腺髓樣癌先證者進(jìn)行詳細(xì)病例回顧（表3），其中4 例先證者在基因篩查前已被診斷為甲狀腺髓樣癌；1 例（Ⅳ-1）在RET基因檢測呈RET基因突變后進(jìn)行甲狀腺B 超及降鈣素水平篩查，后經(jīng)手術(shù)證實為甲狀腺髓樣癌；5 例先證者確診甲狀腺髓樣癌時降鈣素水平波動在135.8～2 000 pg/mL 以上。手術(shù)方式選擇見表4，其中3 例手術(shù)中發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。術(shù)后第2 天所有患者降鈣素水平呈急劇下降趨勢，后維持在正常水平或較術(shù)前明顯降低；CEA 呈緩慢下降，至術(shù)后1月降至正常水平；3例患者出現(xiàn)一過性甲狀旁腺激素水平下降及低鈣血癥，并伴有明顯手足抽搐，經(jīng)積極補(bǔ)鈣，補(bǔ)充維生素D 等對癥治療后，血清甲狀旁腺激素及血清鈣逐漸恢復(fù)正常水平（表5）。

表4 5 例甲狀腺髓樣癌先證者的手術(shù)術(shù)式及病理Tab. 4 The operative methods and pathology of 5 probands with medullary thyroid carcinoma

表5 5 例甲狀腺髓樣癌先證者血清指標(biāo)的隨訪記錄Tab.5 The laboratory records of 5 probands with medullary thyroid carcinoma

3 討 論

MEN2 是由RET基因突變引起的一組常染色體顯性遺傳性腫瘤綜合征。MEN2A 約占所有MEN2患者的95%，又可分為4 個亞型：①經(jīng)典型MEN2A指甲狀腺髓樣癌并發(fā)嗜鉻細(xì)胞瘤和（或）甲狀旁腺功能亢進(jìn)，最為常見；②MEN2A 伴皮膚苔蘚淀粉樣變；③MEN2A 伴先天性巨結(jié)腸；④家族性非多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤性甲狀腺髓樣癌（FMTC）[1-2]。由于MEN2A涉及多個腺體的腫瘤，而這些腫瘤往往不同時出現(xiàn)，經(jīng)典型MEN2A 診療過程中需要與FMTC 進(jìn)行鑒別。FMTC 為攜帶RET基因胚系突變但不合并嗜鉻細(xì)胞瘤或甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥的甲狀腺髓樣癌，早在1986 年由法恩登(Farndon)及其同事首次報道，定義為家族成員中有超過10 名的甲狀腺髓樣癌患者，多名RET基因突變攜帶者或存在50 歲以上的成員患病[3]。隨著對該病的逐步認(rèn)識，發(fā)現(xiàn)最初被定義為FMTC 的家系（如RET密碼子G533C 突變的六代巴西家系）在隨訪過程中家系成員逐漸出現(xiàn)嗜鉻細(xì)胞瘤[4-5]。目前，大多數(shù)臨床研究者觀點(diǎn)是，F(xiàn)MTC 應(yīng)該被認(rèn)為是MEN2A 的一個變體，確診需要足夠長的觀察時間。

本家系的診斷也是對MEN2A 的逐步明確過程，先證者Ⅲ-10 確診甲狀腺髓樣癌之前，家系中已經(jīng)有3 例成員確診為甲狀腺髓樣癌，但是術(shù)前未針對嗜鉻細(xì)胞瘤及甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥進(jìn)行系統(tǒng)評估及家系成員的篩查。在對先證者Ⅲ-10 反復(fù)詢問家族史后，初步懷疑該家系可能為FMTC。隨著對家系其他成員追蹤，更多證據(jù)支持該家系診斷應(yīng)為MEN2A。表現(xiàn)為2 位甲狀腺髓樣癌先證者同時罹患原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥，另1 例嗜鉻細(xì)胞瘤先證者降鈣素水平升高且攜帶RET原癌基因突變。

RET原癌基因的突變是MEN2A 發(fā)病的分子基礎(chǔ)，迄今為止所發(fā)現(xiàn)的MEN2A 均由RET原癌基因突變引致?；旧纤械腗EN2A 患者都會發(fā)生甲狀腺髓樣癌，嗜鉻細(xì)胞瘤或甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥的外顯率與RET突變的類型有關(guān)[1]。如RET基因11 號外顯子密碼子634 突變者嗜鉻細(xì)胞瘤及甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥外顯率較高，嗜鉻細(xì)胞瘤的外顯率隨年齡增長而增加，30 歲時外顯率25%，50 歲時外顯率可達(dá)52%，77 歲時為88%，而甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥者外顯率無明顯年齡差異，不同報道中約為10%～30%[6-7]；而RET基因10 號外顯子密碼子突變者嗜鉻細(xì)胞瘤（4%～26%）及甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥（2%～12%）外顯率更低[8-9]。本組中RET618 密碼子突變的1 例患者（7.7%）罹患嗜鉻細(xì)胞瘤，2 例患者（15.4%）罹患甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥。臨床工作中對甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥的篩查應(yīng)與嗜鉻細(xì)胞瘤的篩查同時進(jìn)行。

RET基因突變類型對疾病的診治及預(yù)后也起重要作用。95%的患者RET種系突變發(fā)生在外顯子10 的密碼子 609、611、618 或 620 或外顯子 11 的密碼子 634[10]。2015 年 ATA 及 2020 年 甲 狀 腺 髓 樣 癌 診 斷與治療中國專家共識（2020 版）均指出MEN2A 需要檢查的RET基因突變位點(diǎn)主要包括上述6 個位點(diǎn)[1-2]，若上述檢查未發(fā)現(xiàn)明確的突變位點(diǎn)，或臨床表型與檢查結(jié)果不一致時，應(yīng)進(jìn)一步采用全RET基因編碼區(qū)測序進(jìn)行篩查。結(jié)合第七屆國際MEN 協(xié)作組、北美神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤協(xié)會意見，2015 年ATA 指南修訂了MEN 的危險分級，并對其隨訪及治療提出建議，其中ATA“最高危組”包括M918T 密碼子突變（MEN2B相關(guān)RET基因），“高危組”包括C634 密碼子突變，“中危組”指除M918T 及C634 密碼子突變外的其他RET基因突變。對于不同的危險等級給出相應(yīng)的治療建議：“最高?！蓖蛔冾愋突颊呓ㄗh1 歲內(nèi)行甲狀腺切除術(shù)，“高危”突變類型患者在5 歲內(nèi)行預(yù)防性甲狀腺切除，“中?！蓖蛔冾愋突颊邼M5 歲后開始接受每半年或1 年的體格檢查、血清降鈣素及頸部超聲的篩查，如果出現(xiàn)降鈣素升高，則建議手術(shù)切除甲狀腺。本組病例突變檢測結(jié)果為第10 外顯子Cys618Ser 屬“中?！狈懂?，家族中最大年齡基因攜帶現(xiàn)存者已82歲，目前家系中所有基因攜帶者均出現(xiàn)不同程度的降鈣素水平升高及甲狀腺B 超的異常，但是出于各種原因，其他8 例攜帶者未選擇手術(shù)，仍處于密切監(jiān)測隨訪中。

本組中所有Cys618Ser 基因突變攜帶者均表現(xiàn)出降鈣素水平的升高，而降鈣素正常者無攜帶RET基因突變，體現(xiàn)了降鈣素水平與RET基因突變之間的高度一致性。3 例Cys618Ser 基因突變攜帶家系成員僅表現(xiàn)表現(xiàn)為甲狀腺濾泡囊腫，其年齡分布為7～33 歲，另 1 例RET基因突變攜帶者（Ⅳ-6）1 年前甲狀腺B 超提示甲狀腺彌漫性病變，后逐漸出現(xiàn)甲狀腺小結(jié)節(jié)，降鈣素水平也在逐漸升高（25.2 pg/mL 升至35.16 pg/mL）。據(jù)此推測，RET基因突變攜帶者在早期可能僅表現(xiàn)為甲狀腺濾泡旁細(xì)胞的增生或者甲狀腺囊腫，后期逐漸進(jìn)展為實質(zhì)性結(jié)節(jié)。而最終確診為甲狀腺髓樣癌的先證者其結(jié)節(jié)在超聲改變上多為實質(zhì)性結(jié)節(jié)，部分形態(tài)與甲狀腺腺瘤無明顯差別，與既往文獻(xiàn)中描述一致[11-12]，提示單純依靠甲狀腺超聲診斷甲狀腺髓樣癌存在誤診風(fēng)險[12]。建議有家族史的家系成員除了要進(jìn)行甲狀腺B 超的檢查外，還需要注重降鈣素水平的篩查。

綜上，早期識別是及時診治MEN2A 的關(guān)鍵，RET基因檢測對MEN2A 診斷及預(yù)后評估具有重要作用，降鈣素監(jiān)測與RET基因表型間一致性較好。臨床醫(yī)生需提高對該病認(rèn)識，尤其是注意家族史的仔細(xì)詢問及相關(guān)疾病的早期識別，及時篩查RET基因，以期改善患者的長期預(yù)后。