基于 TCGA 與 GTEx 數(shù)據(jù)庫分析 AEBP1 基因在不同分型膠質(zhì)瘤中的表達及對預(yù)后的影響

王 偉，王茂德，姜海濤，李傳坤，答 嶸

（1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061；2. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，陜西西安 710061）

膠質(zhì)瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)惡性腫瘤，缺乏明確的早期標志物而預(yù)后不良[1]。膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma, GBM）是侵襲性最強的顱內(nèi)惡性腫瘤，即使經(jīng)過積極的手術(shù)切除、局部放療和全身化療的綜合治療，其生存期仍在10～12 個月[2]。脂肪細胞增強子結(jié)合蛋白1（adipocyte enhancer binding protein 1,AEBP1）編碼羧酸肽酶A 蛋白家族的一個成員，最初被認為是負調(diào)控脂肪生成的轉(zhuǎn)錄抑制因子[3]。

由于AEBP1 和NF-κB 通路之間存在調(diào)控關(guān)系，而NF-κB 的組成性激活廣泛參與致癌作用，提示AEBP1 過表達與腫瘤的發(fā)生和進展有關(guān)[4]。茹曉宇等研究發(fā)現(xiàn)，AEBP1 mRNA 高表達是GBM 患者預(yù)后的獨立因素，AEBP1 是GBM 患者治療的潛在靶點[5]。AEBP1 表達在原發(fā)性GBM 中上調(diào)，而并非進展期的繼發(fā)性GBM[6]。通過對公共數(shù)據(jù)庫進行分析并通過定量PCR 與免疫印跡方法對膠質(zhì)瘤腫瘤組織中AEBP1 的表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)AEBP1 在低級別膠質(zhì)瘤（low-grade glioma, LGG）與GBM 中的表達均上調(diào)，AEBP1 敲低會抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲及NF-κB 信號通路，并引起細胞早期凋亡[7]。AEBP1下調(diào)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細胞死亡與PTEN 狀態(tài)有關(guān)[2]。與正常星形細胞相比，患者膠質(zhì)瘤原代分離的腫瘤干細胞對ACT001 具有良好反應(yīng)，其機制是阻斷TGF-β激活的AEBP1/AKT 信號通路[8]。也有研究發(fā)現(xiàn)AEBP1 主要通過mTOR 通路促進膠質(zhì)瘤的產(chǎn)生[9]。一個RNA 轉(zhuǎn)錄本通過選擇性剪切能夠產(chǎn)生不同的mRNA 剪接異構(gòu)體，產(chǎn)生功能和結(jié)構(gòu)不同或者拮抗的蛋白[10]。選擇性剪接會導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域的全面喪失，尤其是功能被癌癥基因突變牽連的那些結(jié)構(gòu)域，從而使健康細胞癌變[11]。目前關(guān)于AEBP1 在膠質(zhì)瘤中的研究非常有限，而且不同分型的膠質(zhì)瘤中AEBP1表達以及剪接異構(gòu)體的分布未見報道。GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis ，http://gepia.cancer-pku.cn）[12]即基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析，是北京大學(xué)開發(fā)的采用標準化管線進行RNA序列分析的可視化網(wǎng)站，其數(shù)據(jù)包括TCGA 與GTEx 數(shù)據(jù)庫中9 736 個腫瘤樣本與8 587 個正常組織的信息。本研究擬通過GEPIA 獲取腫瘤組織與正常組織的RNA 數(shù)據(jù)信息，分析AEBP1 在不同分型的膠質(zhì)瘤組織和相應(yīng)正常組織中的表達情況以及對預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 AEBP1 在膠質(zhì)瘤與正常組織中的表達分析

本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫與GTEx 數(shù)據(jù)庫，使用GEPIA2 可視化網(wǎng)絡(luò)分析工具[13]（http://gepia2.cancer-pku.cn/）進行分析。在表達分析（Expression Analysis）中，選擇 GBM 與 LGG 數(shù)據(jù)，輸入AEBP1 基因名稱，P-value Cutoff 值為 0.05，使用 Log Scale[log2（TPM+1）]，Jitter Size 為 0.4，與 TCGA normal 和GTEx 數(shù)據(jù)作為正常對照進行比較。腫瘤組織顯示為紅色，正常組織顯示為灰色，繪制箱線圖。對TCGA 數(shù)據(jù)庫中GBM 的4 種分型，包括經(jīng)典型、間充質(zhì)型、神經(jīng)元型、原神經(jīng)元型，與LGG 的3 種分型，包括星型細胞瘤、少突星型細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤，與TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫中人體正常組織樣本采用單因素方差分析（one-way ANOVA）法比較AEBP1 基因表達水平。

1.2 AEBP1 剪接異構(gòu)體在GBM 與LGG 中的表達分析

利用Isoform Usage 模塊，輸入AEBP1 基因名稱，坐標軸默認X 軸為腫瘤類型，Y 軸為剪接異構(gòu)體，選擇GBM 與LGG 數(shù)據(jù)，進行小提琴圖的繪制，分析AEBP1 基因同源蛋白異構(gòu)體的表達分布情況。

1.3 AEBP1 對膠質(zhì)瘤預(yù)后的影響

利用生存分析模塊，輸入AEBP1 基因名稱，方法分別選擇總生存期（overall survival, OS）或無進展生存期（disease-free survival, DFS），Group Cutoff 選擇中位數(shù)，將不同分型膠質(zhì)瘤組內(nèi)分為AEBP1 低表達組與高表達組。選擇GBM 與LGG 數(shù)據(jù)，低表達組顯示為藍色，高表達組顯示為紅色，坐標軸單位選擇月，繪制Kaplan-Meier 生存曲線與Logrank 檢驗。對TCGA 數(shù)據(jù)庫中GBM 的4 種分型，包括經(jīng)典型、間充質(zhì)型、神經(jīng)元型，原神經(jīng)元型，與LGG 的3 種分型，包括星型細胞瘤、少突星型細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤分別繪制Kaplan-Meier 生存曲線，并采用Logrank檢驗分析AEBP1 基因低表達組與高表達組的預(yù)后。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

AEBP1 在膠質(zhì)瘤與正常組織以及不同分子型別膠質(zhì)瘤中的差異表達分析使用單因素方差分析（One-way ANOVA）。AEBP1 對膠質(zhì)瘤預(yù)后影響的分析中生存期差異比較采用Logrank 檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AEBP1 在 GBM 與 LGG 中表達均高于正常對照，但膠質(zhì)瘤分型影響AEBP1 表達

AEBP1 基因在GBM 與LGG 腫瘤組織中表達均高于正常對照組織，箱線圖顯示GBM 腫瘤組織中AEBP1 的表達與正常對照組織中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但是 LGG 腫瘤組織中AEBP1 的表達與正常對照組織中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1A）。對GBM 不同分型的研究結(jié)果顯示，在經(jīng)典型（classical）、間充質(zhì)型（mesenchymal）、神經(jīng)元型（neural）與原神經(jīng)元型（proneural）4 種型別腫瘤組織中AEBP1 的表達與正常對照組織中差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1B）。對LGG 不同亞型的研究結(jié)果表明在星型細胞瘤（astrocytoma）與少突星型細胞瘤（oligoastrocytoma）中腫瘤組織中AEBP1 的表達與正常對照組織中差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但是少突膠質(zhì)細胞瘤（oligodendroglioma）腫瘤組織中AEBP1 的表達與正常對照組織中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1C）。

圖1 AEBP1 在GBM 與LGG 腫瘤組織與正常組織之間的表達差異Fig.1 Difference of AEBP1 expression in GBM and LGG tumor tissues and normal tissues

2.2 AEBP1 剪接異構(gòu)體在 GBM 與 LGG 腫瘤組織中的表達差異

在 GBM 與 LGG 腫 瘤 組 織 中 ，AEBP1 具 有 9 種剪接異構(gòu)體。小提琴圖顯示GBM 腫瘤組織中9 種AEBP1 剪接異構(gòu)體表達都高于LGG 腫瘤組織。AEBP1-001、AEBP1-002、AEBP1-003 與AEBP1-008 的分布趨勢在GBM 與LGG 腫瘤組織中相反（圖2）。

圖2 AEBP1 剪接異構(gòu)體在GBM 與LGG 腫瘤組織中的表達差異Fig. 2 Difference of AEBP1 isoform expression in GBM and LGG tumor tissues

2.3 AEBP1 對膠質(zhì)瘤預(yù)后的影響

GBM 患者中AEBP1 低表達組的OS 優(yōu)于高表達組（P＜0.05，圖3A）。但是 4 種 GBM 分型中，僅有原神經(jīng)元型GBM 患者AEBP1 低表達組的OS 優(yōu)于高表達組（P＜0.05，圖3B）。經(jīng)典型（附圖S1）、間充質(zhì)型（附圖S2）與神經(jīng)元型（附圖S3）的GBM 患者AEBP1 低表達組的OS 均與高表達組無差異。GBM患者中AEBP1 低表達組的DFS 與高表達組無差異（附圖S4），在經(jīng)典型（附圖S5）、間充質(zhì)型（附圖S6）、神經(jīng)元型（附圖S7）與原神經(jīng)元型（附圖S8）4 種GBM 分型患者中AEBP1 低表達組的DFS 與高表達組亦無顯著差異。LGG 患者中AEBP1 低表達組的OS 優(yōu)于高表達組（P＜0.05，圖 3C）。但是 3 種分型LGG 中，僅有星型膠質(zhì)細胞瘤患者中AEBP1 低表達組的OS 優(yōu)于高表達組（P＜0.05，圖3D）。但是少突星型細胞瘤（附圖S9）與少突膠質(zhì)細胞瘤（附圖S10）AEBP1低表達組的OS均與高表達組無差異。LGG患者中AEBP1低表達組的DFS優(yōu)于高表達組（P＜0.05，圖3E）。但是僅有星型膠質(zhì)細胞瘤患者中AEBP1 低表達組的DFS 優(yōu)于高表達組（P＜0.05，圖3F），而少突星型細胞瘤（附圖S11）與少突膠質(zhì)細胞瘤（附圖S12）的患者中AEBP1 低表達組的DFS 與高表達組亦無顯著差異。

圖3 AEBP1 對膠質(zhì)瘤預(yù)后的影響Fig.3 The effect of AEBP1 on the prognosis of glioma patients

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是由于膠質(zhì)細胞癌變所導(dǎo)致的最常見的原發(fā)性顱腦惡性腫瘤，GBM 是最常見的侵襲性腦內(nèi)惡性腫瘤，盡管目前有多種治療方法，但總體預(yù)后不佳，生存期僅僅10～12 個月[2]。二代測序技術(shù)在膠質(zhì)瘤分子診斷中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)GBM 存在明顯異常的代謝重組[14]，以及顯著的細胞和分子異質(zhì)性[15]，這些可能導(dǎo)致各種新型治療以失敗告終。

AEBP1 是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，參與調(diào)節(jié)多種重要的生物過程，包括脂肪形成、乳腺發(fā)育、炎癥、巨噬細胞膽固醇穩(wěn)態(tài)和動脈粥樣硬化的發(fā)生。近年來，由于NF-κB 信號在炎癥和癌癥等關(guān)鍵細胞過程中的作用，AEBP1 與NF-κB 通路之間的調(diào)控關(guān)系引起了許多研究者的關(guān)注。由于NF-κB 的組成性激活廣泛涉及多種組織癌變，提示AEBP1 的過表達與腫瘤的發(fā)生和進展密切相關(guān)。AEBP1 在多種惡性腫瘤(如乳腺癌、GBM、膀胱癌、胃癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌和皮膚癌)中過表達，并能夠通過其他關(guān)鍵通路[如PI3KAkt、sonic hedgehog (Shh)、p53、PARP-1 和 PTEN]調(diào)控細胞增殖和凋亡。AEBP1 可能成為評估癌癥預(yù)后的潛在生物標志物，并可能會成為預(yù)防和/或治療多種類型癌癥的新治療靶點[4]。AEBP1 通過調(diào)節(jié)PI3KCB的表達作為GBM 中潛在的致癌蛋白，在多種癌癥中越來越被認為是一個重要的分子[2]。但是AEBP1 在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用及其表達水平對患者預(yù)后的影響研究較少，而且AEBP1 在不同分型膠質(zhì)瘤中的不同表現(xiàn)以及剪接異構(gòu)體的表達均未見報道。

本研究為系統(tǒng)掌握AEBP1 基因在人腦膠質(zhì)瘤中的表達情況，利用GEPIA 分析工具挖掘TCGA 數(shù)據(jù)庫與GTEx 數(shù)據(jù)庫中AEBP1 基因在GBM 與LGG中的表達情況。研究者通過微陣列分析確定GBM的特異性診斷和預(yù)后標志物，發(fā)現(xiàn)AEBP1 在原發(fā)性GBM 中表達上調(diào)超過4倍[6]。本研究發(fā)現(xiàn)AEBP1基因在GBM 腫瘤組織中表達高于正常對照組織，而且GBM 的4 種分型包括經(jīng)典型、間充質(zhì)型、神經(jīng)元型與原神經(jīng)元型的腫瘤組織中AEBP1 的表達亦均高于正常對照組織。雖然LGG 腫瘤組織中并未發(fā)現(xiàn)AEBP1 的表達與正常對照組織間存在統(tǒng)計學(xué)差異，但是除了少突膠質(zhì)細胞瘤，其他兩種LGG 包括星型細胞瘤與少突星型細胞瘤腫瘤組織中AEBP1 的表達均高于正常對照組織。AEBP1 具有9 種剪接異構(gòu)體在GBM 與LGG 中均有表達，但是分布趨勢有所差異，其中AEBP1-001、AEBP1-002、AEBP1-003 與AEBP1-008 的分布趨勢在GBM 與LGG 腫瘤組織中相反。AEBP1 在人類膠質(zhì)瘤中高度表達，抑制AEBP1 能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖與侵襲，并誘導(dǎo)細胞凋亡，同時下調(diào) NF-κB 的表達[7,16]；而上調(diào)AEBP1表達能夠通過激活NF-κB 通路促進GBM 細胞的增殖，增強遷移與侵襲能力，促進腫瘤生長[17]。提示AEBP1 基因在膠質(zhì)瘤的發(fā)生中具有重要意義。在其他腫瘤中AEBP1 同樣發(fā)揮重要作用，AEBP1 能夠通過激活胃癌NF-κB 通路促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，敲除AEBP1 能夠顯著抑制胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移[18]。在結(jié)腸腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)AEBP1 是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要調(diào)控基因[19]。兒童急性淋巴細胞白血病的研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)異常高表達的AEBP1 能夠通過p53 依賴性信號通路抑制腫瘤生長[20]。此外，AEBP1在靶向治療獲得性耐藥中發(fā)揮重要作用，在RAF 抑制劑PLX4032 獲得性耐藥的BRAFV600E突變黑色素瘤中AEBP1 表達顯著升高[21]。

生存分析結(jié)果顯示，GBM 患者中AEBP1 低表達組的OS 優(yōu)于高表達組，但在4 種分型中僅有原神經(jīng)元型GBM 患者中AEBP1 低表達組的OS 優(yōu)于高表達組。LGG 患者中AEBP1 低表達組的OS 與DFS 均優(yōu)于高表達組，但是3 種分型中僅有星型膠質(zhì)細胞瘤患者中AEBP1 低表達組的OS 與DFS 均優(yōu)于高表達組。本研究結(jié)果提示，AEBP1 表達水平對GBM 尤其是原神經(jīng)元型GBM 的OS 影響較大，但是對LGG 尤其是星型膠質(zhì)細胞瘤的OS 與DFS 均影響較大。在胃癌的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，AEBP1 高表達的早期與晚期胃癌患者的OS 均較非高表達患者短，患者的預(yù)后差[18]。同樣，AEBP1 高表達的結(jié)腸腺癌患者的 OS 短于AEBP1 低表達患者[19]。

本研究結(jié)果顯示，AEBP1 基因在4 種分型的GBM 及2 種分型的LGG（星型細胞瘤與少突星型細胞瘤）較正常組織中高表達。同時發(fā)現(xiàn)AEBP1 影響膠質(zhì)瘤的預(yù)后，AEBP1 對LGG 特別是星型膠質(zhì)細胞瘤預(yù)后影響最大，不僅影響OS，同時影響DFS；而在GBM 中，AEBP1 僅影響原神經(jīng)元型 GBM 的 OS。本研究結(jié)果提示AEBP1 在GBM 與LGG 的發(fā)病與發(fā)展中具有重要臨床價值，可作為評估原神經(jīng)元型GBM 與星型膠質(zhì)細胞瘤患者預(yù)后的標志物，并可能成為靶向治療的候選基因。