腸毒性大腸桿菌eutR和eutB基因敲除對(duì)其生長(zhǎng)繁殖和生物被膜生成量的影響

魯 曦 吳定燕 任 珂 朱振寶 錢衛(wèi)生

(1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，西安 710021；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院，西安 710038)

腸毒性大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)是導(dǎo)致仔豬腹瀉的常見(jiàn)病原微生物之一，約50%的仔豬死亡與ETEC感染有關(guān)[1]。2016年我國(guó)新生活仔豬8.79億頭，其中1.53億頭因腹瀉等疾病在斷奶前后死亡，直接導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)240億元[2]。此外，ETEC也是導(dǎo)致發(fā)展中國(guó)家兒童腹瀉和旅行者腹瀉最常見(jiàn)的病原體之一[3-5]，而全世界有10%～60%的腹瀉患者由ETEC感染導(dǎo)致，嚴(yán)重威脅著人體健康[6-7]。

生物被膜(biofilm，BF)是細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中的天然保護(hù)機(jī)制[8]，通過(guò)增加病原微生物對(duì)腸道黏膜表面的黏附從而增強(qiáng)耐受力[9-11]。ETEC感染機(jī)體腸道的第1步是在定植因子的介導(dǎo)下黏附于小腸上皮細(xì)胞上，而生物被膜無(wú)疑大大增強(qiáng)了ETEC的致病性[12-13]。此外，大腸桿菌致病性還受宿主腸道微環(huán)境中信號(hào)分子的影響[14]。其中，N-乙酰乙醇胺(N-acylethanolamine)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)作為哺乳動(dòng)物小腸上皮細(xì)胞膜和細(xì)菌細(xì)胞膜的主要成分，可在體內(nèi)分解為乙醇胺(ethanolamine，EA)而被腸道微生物直接利用。前人研究發(fā)現(xiàn)，腸內(nèi)乙醇胺濃度約為4 mmol/L[15]，乙醇胺不僅能夠調(diào)節(jié)出血性大腸桿菌O157∶H7編碼志賀毒素和毒力相關(guān)基因的表達(dá)量[14]，也會(huì)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌在宿主腸道內(nèi)的適應(yīng)性與毒力表達(dá)起到促進(jìn)作用[16]。而病原菌eut操縱子在其中發(fā)揮了重要作用，該操縱子編碼了乙醇胺受體eutR基因和參與乙醇胺代謝的eutB等10余個(gè)基因[17-20]。

為了研究乙醇胺對(duì)ETEC生物被膜的調(diào)控作用，本研究首先使用Red重組系統(tǒng)(λ噬菌體γ、β和exo同源重組系統(tǒng))對(duì)eutR和eutB基因進(jìn)行敲除，然后在體外模擬腸內(nèi)缺氧條件下，利用乙醇胺對(duì)野生型ETEC(WT)和eutR、eutB基因敲除株(△eutR和△eutB)進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)對(duì)ETEC生長(zhǎng)情況、生物被膜生成量進(jìn)行測(cè)定，探討了腸內(nèi)乙醇胺對(duì)ETEC致病表型的可能影響。本研究揭示了乙醇胺影響ETEC生物被膜生成量的一般規(guī)律，為預(yù)防和控制ETEC對(duì)仔豬腸道損傷提供理論依據(jù)，也為緩解畜禽腹瀉問(wèn)題提供新的可能突破口。

1 材料與方法

1.1 主要菌株、質(zhì)粒與試劑

本試驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒信息見(jiàn)表1[21]。pfu DNA聚合酶、Taq聚合酶、dNTP、切膠純化試劑盒等分子生物學(xué)試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司(以下簡(jiǎn)稱生工)。乙醇胺、L-阿拉伯糖、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氯霉素(Cm)和卡那霉素(Kn)購(gòu)自西格瑪奧德里奇有限公司(Sigma-Aldrich)。

表1 菌株和質(zhì)粒信息

1.2 主要儀器設(shè)備

伯樂(lè)Western blotting電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad Mini-Protean Tetra System)、厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)(Gene Science A30)、伯樂(lè)電穿孔(Bio-Rad Gene Pluser Xcell)和生化培養(yǎng)箱(Heal Force)、Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(Thermo)。

1.3 菌株的培養(yǎng)

菌株培養(yǎng)參見(jiàn)文獻(xiàn)[22]。試驗(yàn)條件下利用無(wú)氧培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)ETEC進(jìn)行培養(yǎng)，其中厭氧氣體成分為：80.0%氮?dú)狻?.6%二氧化碳及10.4%氫氣，重復(fù)置換3次后放置在37 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4 打靶片段的設(shè)計(jì)與制備

1.4.1eutB基因敲除打靶片段的設(shè)計(jì)與制備

根據(jù)ETEC H10407菌株的eutB基因及上、下游序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，通過(guò)PCR反應(yīng)獲得外側(cè)50 bp序列為eutB基因的同源重組臂，內(nèi)側(cè)20～30 bp序列為卡那霉素抗性基因表達(dá)框。引物由生工合成。eutB-F、eutB-R引物用于擴(kuò)增eutB基因兩翼的同源序列中間為卡那霉素抗性基因的打靶DNA片段。引物信息參見(jiàn)表2，其中大寫(xiě)序列為ATCC35401菌株eutB基因的同源重組臂；小寫(xiě)序列為卡那霉素抗性基因的特異引物序列。

以pET28a質(zhì)粒為模板，eutB-F、eutB-R為擴(kuò)增引物，利用pfu DNA酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：pET28a質(zhì)粒(10 ng/μL)0.5 μL、10×pfu Buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)4 μL、eutB-F(50 pmol/μL)0.5 μL、eutB-R(50 pmol/μL)0.5 μL、pfu DNA polymerase(MBI,5 U/μL)0.5 μL，加dH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：首先95 ℃ 5 min；隨后95 ℃變性30 s，55 ℃退火(每循環(huán)降低0.5 ℃)45 s，72 ℃延伸90 s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃反應(yīng)終止。利用生工膠純化試劑盒進(jìn)行純化回收，去除非特異性片段和PCR反應(yīng)組分并調(diào)整濃度為20 ng/μL。

1.4.2eutR基因敲除打靶片段的設(shè)計(jì)與制備

根據(jù)ETEC H10407菌株的eutR基因及上、下游序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，通過(guò)PCR反應(yīng)獲得外側(cè)50 bp序列為eutR基因的靶向同源重組臂，內(nèi)側(cè)20～30 bp序列為氯霉素抗性基因表達(dá)框。引物由生工合成。eutR-F、eutR-R引物用于擴(kuò)增eutR基因兩翼的同源序列中間為卡那霉素抗性基因的打靶DNA片段。引物信息參見(jiàn)表2，其中大寫(xiě)序列為ATCC35401菌株eutR基因的同源重組臂；小寫(xiě)序列為氯霉素抗性基因的特異引物序列。

表2 PCR引物信息

以pKD3質(zhì)粒為模板，eutR-F、eutR-R為擴(kuò)增引物，利用pfu DNA酶擴(kuò)增。pKD3質(zhì)粒(10 ng/μL)0.5 μL、10×pfu DNA Buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L )4 μL、eutR-F(50 pmol/μL)0.5 μL、eutR-R(50 pmol/μL)0.5 μL、pfu DNA polymerase(MBI,5 U/μL)0.5 μL，加dH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：同1.4.1。利用生工膠純化試劑盒進(jìn)行純化回收，去除非特異性片段和PCR 反應(yīng)組分并調(diào)整濃度為20 ng/μL。

1.5 ETEC H10407菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備及eutB和eutR基因打靶

1.5.1 ETEC H10407菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備及eutB基因打靶

首先制備ETEC H10407菌株的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，然后將pKD46質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化進(jìn)入ETEC H10407感受態(tài)細(xì)胞，將其涂布在含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜培養(yǎng)。接著挑選H10407/pKD46單克隆，制備成電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。最后將eutB打靶片段轉(zhuǎn)化進(jìn)入H10407/pKD46感受態(tài)細(xì)胞，隨后涂布添加有卡那霉素的LB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。在上述含有抗生素的LB平板上隨機(jī)挑取正常生長(zhǎng)的淡黃色菌落，各接種至3 mL LB(含50 μg/mL卡那霉素)，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。用基因組上同源手臂外側(cè)的1對(duì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。引物序列eutB-outF和eutB-outR見(jiàn)表2；反應(yīng)體系：菌液0.5 μL、10×Taq Buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)4 μL、eutB-outF(50 pmol/μL)0.5 μL、eutB-outR(50 pmol/μL) 0.5 μL、Taq DNA polymerase(5 U/μL) 0.5 μL、dH2O 39 μL，總共50 μL；擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

1.5.2 ETEC H10407菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備及eutR基因打靶

方法同上(1.5.1)，最后將eutR打靶片段轉(zhuǎn)化進(jìn)入H10407/pKD46感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含有卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜培養(yǎng)。利用eutB-outF/CmSeqR2和CmSeqF2/eutB-outR(具體序列見(jiàn)表2)引物組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，反應(yīng)體系：菌液0.5 μL、10×Taq Buffer 5 μL、dNTP (2.5 mmol/L )4 μL、eutR-outF/CmSeqR2 (50 pmol/μL) 0.5 μL、CmSeqF2/eutR-outR (50 pmol/μL)0.5 μL、Taq DNA polymerase(5 U/μL) 0.5 μL、dH2O 39 μL，總共50 μL；擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；9 5℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

1.6 WT和△eutR和△eutB生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

為了在體外模擬宿主腸道乙醇胺濃度，本研究選用4 mmol/L作為試驗(yàn)濃度，將活化培養(yǎng)好的WT和△eutR和△eutB按照1∶100的比例接種至含有乙醇胺或者不含有乙醇胺的LB肉湯培養(yǎng)基中，用Varioskan LUX多測(cè)定功能酶標(biāo)儀測(cè)定生長(zhǎng)曲線，孵育溫度為37 ℃(在此溫度下乙醇胺穩(wěn)定)，共測(cè)定12 h。

1.7 ETEC的eutR和eutB基因敲除后生物被膜生成量的測(cè)定

分別挑取WT、ΔeutR和ΔeutB單菌落，至3 mL的LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)。次日將WT、ΔeutR和ΔeutB菌液以1∶100的比例接種至含有不同濃度乙醇胺的新鮮LB肉湯培養(yǎng)基的樣品瓶中，在37 ℃搖床上，160 r/min有氧培養(yǎng)12 h。接著取出樣品瓶，倒掉菌液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去殘留菌體，放置晾干。向樣品瓶中加入0.5 mL 2.5%的結(jié)晶紫溶液，染色1 min，然后用無(wú)菌水洗去染液，放置晾干。最后向樣品瓶中加入1 mL 33%的冰乙酸，在吸光度(OD)570 nm處測(cè)定。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)qesE基因表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量，首先使用Steadypure Universal RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA提取，并利用Evo-M-MLV Premix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系如下：2×SYBR Green pro Taq HS Premix 10 μL，50 pmol/μL引物各0.2 μL，模板cDNA 1 μL，dH2O補(bǔ)足20 μL，其中引物序列見(jiàn)表2。以gyrA基因作為內(nèi)參，結(jié)果采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(means±SD)，使用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理分析以及圖像的繪制，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 打把片段的制備與純化

利用PCR擴(kuò)增出了eutB基因打靶片段，其兩側(cè)為60～80 bp的eutB基因同源重序列，內(nèi)側(cè)為卡那霉素抗性基因序列；同理擴(kuò)增出eutR基因打靶片段，其內(nèi)側(cè)為氯霉素抗性基因序列。PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1，其中eutR和eutB基因打靶片段長(zhǎng)度分別為1 106和967 bp，片段大小與預(yù)期相符。隨后使用膠回收試劑盒對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行純化。

圖A:1為eutB基因打靶片段；M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL 5 000)；圖B：1為eutR基因打靶片段；M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) (DL 5 000)。

2.2 △eutR和△eutB的PCR驗(yàn)證

2.2.1 △eutB的PCR驗(yàn)證

在卡那霉素平板上篩選eutB敲除成功的菌株：隨機(jī)挑取了12個(gè)單菌落，同時(shí)用出發(fā)菌株(H10407)作為陰性對(duì)照，提取DNA后使用eutB-outF和eutB-outR引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。出發(fā)菌株擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 525 bp，而eutB基因被卡那霉素抗性基因替換后擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)為1 045 bp。結(jié)果如圖2所示，除了第2、6、11號(hào)菌落外，其余擴(kuò)增產(chǎn)物大小均與預(yù)期相符，可能為替換成功的陽(yáng)性克隆。選擇第1號(hào)菌落，在含有卡那霉素的LB平板上連續(xù)傳代3次后隨機(jī)挑取單菌落，接種至3 mL含卡那霉素的LB肉湯培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，離心后提取菌體DNA，用eutB-outF和eutB-outR引物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果顯示與預(yù)期相符，提示eutB基因敲除成功，該菌命名為：Ecoli10407/ΔEutB::Kn。

+: 原始菌株的擴(kuò)增結(jié)果。M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL 5 000)。1～12：第1～12號(hào)菌落的擴(kuò)增結(jié)果。

2.2.2 △eutR的PCR驗(yàn)證

同理，誘導(dǎo)eutR基因敲除后在氯霉素平板篩選，結(jié)果僅有單一菌落生長(zhǎng)。用于敲除的氯霉素抗性基因長(zhǎng)度與目標(biāo)基因長(zhǎng)度一致，因此難以通過(guò)eutR-outF和eutR-outR擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度進(jìn)行分辨(圖3-A)，因此我們選擇eutR-outF與CmSeqF2對(duì)氯霉素LB平板上的唯一菌落進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示(圖3-B)PCR擴(kuò)增為陽(yáng)性，且產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)計(jì)(638 bp)相符，提示此菌落可能為成功敲除菌株。為進(jìn)一步驗(yàn)證，同理，將此菌落在氯霉素抗性平板上連續(xù)劃線傳代3次，用雙外側(cè)引物對(duì)菌體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果顯示與設(shè)計(jì)一致，提示eutR基因敲除成功，該菌命名為：Ecoli10407/ΔEutR::Cm。

圖A為利用外側(cè)引物(eutR-outF和eutR-outR)PCR擴(kuò)增敲除菌株驗(yàn)證結(jié)果。其中，1為陽(yáng)性克隆PCR擴(kuò)增結(jié)果(理論長(zhǎng)度1 250 bp)；M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL 5 000)；2為原始菌株外側(cè)引物PCR擴(kuò)增結(jié)果(理論長(zhǎng)度1 267 bp)。Figure A shows the validation results of PCR amplification using external primers (eutR-outF and eutR-outR) to knock out strains. Among them, 1 was PCR amplification results of positive clone (theoretical length: 1 250 bp); M was DNA marker (DL 5 000); 2 was PCR amplification results of primers on the outer side of the original strain (theoretical length: 1 267 bp).

為探討eutR和eutB基因敲除對(duì)ETEC生長(zhǎng)繁殖的影響，我們對(duì)WT和ΔeutR和ΔeutB進(jìn)行了生長(zhǎng)曲線測(cè)定，結(jié)果如圖4-A：ΔeutR和ΔeutB在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度與WT相比并未出現(xiàn)明顯差異(P>0.05)。接著，使用含有4 mmol/L乙醇胺的LB培養(yǎng)基模擬腸內(nèi)乙醇胺濃度條件下，檢測(cè)了上述3株ETEC在37 ℃培養(yǎng)12 h后的OD600值，并以不含乙醇胺的LB培養(yǎng)基作為對(duì)照。結(jié)果如圖4-B所示，4 mmol/L乙醇胺并不能夠改變3株ETEC在LB肉湯培養(yǎng)基中12 h時(shí)的生長(zhǎng)。

圖A為WT、ΔeutR和ΔeutB在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線；圖B為4 mmol/L乙醇胺對(duì)WT、ΔeutR和ΔeutB在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h時(shí)OD600值的影響。ns表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2.3eutR和eutB基因敲除對(duì)ETEC生物被膜生成量的影響

雖然ETEC對(duì)乙醇胺的感知與代謝并不影響其在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)繁殖，但為了進(jìn)一步探究乙醇胺對(duì)ETEC致病能力的影響，本研究在4 mmol/L乙醇胺條件下，對(duì)WT、ΔeutR和ΔeutB生物被膜生成量進(jìn)行測(cè)定，并以不含乙醇胺的LB培養(yǎng)基作為對(duì)照，探討乙醇胺的識(shí)別和利用對(duì)ETEC生物被膜生成的影響。結(jié)果如圖5所示，相比對(duì)照條件，4 mmol/L乙醇胺可以顯著提高WT生物被膜生成量(P<0.05)。然而，當(dāng)eutB或eutR基因敲除后，4 mmol/L乙醇胺不能夠顯著改變其生物被膜的生成量(P>0.05)。以上數(shù)據(jù)提示：1)腸道中乙醇胺濃度可以顯著提高野生型ETEC生物被膜的體外生成；2)eutR和eutB基因在乙醇胺促進(jìn)ETEC生物被膜產(chǎn)生的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。

ns為無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；*為差異顯著(P<0.05)。下同圖。

接下來(lái)，為了進(jìn)一步探討乙醇胺識(shí)別和利用通過(guò)何種途徑影響了ETEC生物被膜的生成，本研究測(cè)定了乙醇胺對(duì)生物被膜調(diào)控基因qesE表達(dá)量的影響，結(jié)果如圖6所示，4 mmol/L乙醇胺可以顯著提高野生型ETEC的qesE基因表達(dá)量(P<0.05)，但無(wú)法對(duì)ΔeutR和ΔeutB敲除qesE基因表達(dá)量產(chǎn)生影響。這一結(jié)果提示，環(huán)境中乙醇胺對(duì)ETEC生物被膜生成量的影響，或許是通過(guò)提高qesE基因表達(dá)量導(dǎo)致。

圖6 乙醇胺對(duì)WT、ΔeutB和

3 討 論

研究表明，宿主腸道中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、細(xì)胞代謝產(chǎn)物等可以作為信號(hào)分子影響腸道病原菌的毒力表達(dá)[15,23]。乙醇胺作為宿主腸道上皮細(xì)胞膜和腸道微生物細(xì)胞膜的主要成分，對(duì)腸道病原菌毒力表達(dá)已有相關(guān)報(bào)道，例如：食源性鼠傷寒沙門氏菌會(huì)識(shí)別腸道環(huán)境中的乙醇胺促進(jìn)對(duì)宿主環(huán)境的適應(yīng)和定植，且eutR基因可以促進(jìn)乙醇胺的代謝、影響病沙門氏菌毒力表達(dá)和傳播，而eutB基因在乙醇胺信號(hào)傳導(dǎo)、影響鼠傷寒沙門氏菌毒力表達(dá)中也起到重要作用[14,16,24]。此外，在對(duì)出血性大腸桿菌(EHEC)H7∶O157的研究中發(fā)現(xiàn)：EHEC將乙醇胺作為信號(hào)分子在多種環(huán)境因素共同作用下激活EHEC的毒力表達(dá)。以上研究提示，乙醇胺對(duì)腸道致病菌的毒力表達(dá)起到關(guān)鍵作用，然而，乙醇胺是如何影響ETEC毒力表型尚不明確。

為了探究乙醇胺對(duì)ETEC毒力表型的影響，本研究首先利用λ噬菌體Red重組系統(tǒng)對(duì)ETEC編碼乙醇胺受體和乙醇胺代謝關(guān)鍵基因eutR和eutB分別敲除成功。該技術(shù)在大腸桿菌基因敲除中具有較高的敲除效率[25]。接下來(lái)，對(duì)生長(zhǎng)情況進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除株與突變株的生長(zhǎng)情況并無(wú)顯著差異，造成這一現(xiàn)象的原因可能是乙醇胺識(shí)別和利用功能的缺失，并不會(huì)影響ETEC對(duì)培養(yǎng)基中其他碳源或者氮源的利用。

環(huán)境中的乙醇胺并不會(huì)影響ETEC在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)和繁殖。根據(jù)這一結(jié)果我們推測(cè)：1)4 mmol/L乙醇胺對(duì)ETEC致病性的影響可能并非通過(guò)促進(jìn)其生長(zhǎng)繁殖的方式來(lái)體現(xiàn)；2)從ETEC的營(yíng)養(yǎng)利用角度看，可能在LB肉湯培養(yǎng)基中的乙醇胺作為碳源或氮源與其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并無(wú)顯著區(qū)別?？墒窃诤罄m(xù)研究中，可以通過(guò)將乙醇胺作為唯一碳源或唯一氮源，在不同濃度條件下進(jìn)一步深入研究乙醇胺作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)ETEC生長(zhǎng)繁殖的影響。

雖然腸道中乙醇胺濃度并不能顯著影響ETEC的生長(zhǎng)繁殖，但在接下來(lái)的研究中發(fā)現(xiàn)，這一濃度的乙醇胺可以顯著提高WT生物被膜的生成。對(duì)于△eutR和△eutB，由于它們無(wú)法識(shí)別和利用環(huán)境中的乙醇胺，因此不論乙醇胺是否存在，均不會(huì)影響敲除株的生物被膜生成量。這一數(shù)據(jù)提示：1)腸道濃度的乙醇胺可能影響ETEC生物被膜的生成；2)編碼乙醇胺受體的eutR基因和編碼乙醇胺代謝的關(guān)鍵基因eutB在這一過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。眾所周知，生物被膜可以增強(qiáng)細(xì)菌的抵抗力，從而保護(hù)自身免受宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，而ETEC進(jìn)入宿主腸道后，首先會(huì)在定植因子的介導(dǎo)下黏附在小腸上皮細(xì)胞上，然后進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖、表達(dá)毒力，其生物被膜的產(chǎn)生會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)ETEC對(duì)宿主的抵抗力從而增強(qiáng)其對(duì)宿主的損傷作用。綜合以上數(shù)據(jù)，由于△eutB的基因組上依然編碼有乙醇胺受體基因eutR，因此，△eutB依然能夠感知環(huán)境中乙醇胺的存在。而eutB敲除卻能夠抑制乙醇胺對(duì)ETEC生物被膜生成的促進(jìn)作用。這一數(shù)據(jù)提示，乙醇胺對(duì)ETEC對(duì)生物被膜生成的影響，可能受到了乙醇胺代謝或其代謝物的影響，而不僅僅是ETEC對(duì)乙醇胺信號(hào)分子的識(shí)別。

雖然，本研究并未揭示乙醇胺促進(jìn)ETEC生物被膜生成的確切機(jī)制，例如：這一促進(jìn)作用是通過(guò)ETEC對(duì)乙醇胺代謝后產(chǎn)生的何種物質(zhì)起到關(guān)鍵作用，但是本研究發(fā)現(xiàn)qesE基因在4 mmol/L乙醇胺處理?xiàng)l件下表達(dá)量發(fā)生顯著上調(diào)。前人研究也發(fā)現(xiàn)，該基因參與生物被膜的生成過(guò)程，但乙醇胺對(duì)ETEC生物被膜的促進(jìn)作用是否由qesE基因?qū)е?，仍需要進(jìn)一步研究。另外，本研究也并未對(duì)乙醇胺影響ETEC其他毒力表型進(jìn)行研究，例如，對(duì)LT毒素表達(dá)、黏附作用以及耐藥表型進(jìn)行研究。但本研究數(shù)據(jù)足以說(shuō)明，腸道中乙醇胺濃度在體外厭氧條件下可以提高ETEC生物被膜的生成，應(yīng)當(dāng)引起足夠重視。最后，通過(guò)阻斷對(duì)乙醇胺的利用，或許能夠成為緩解ETEC感染造成仔豬死亡率的靶點(diǎn)之一。

4 結(jié) 論

本研究利用λ噬菌體Red同源重組系統(tǒng)，成功敲除了ETEC基因組中參與乙醇胺識(shí)別和利用的eutR和eutB基因。研究發(fā)現(xiàn)，eutR和eutB敲除并不會(huì)影響ETEC在LB培養(yǎng)基中的正常生長(zhǎng)，但4 mmol/L的EA可以顯著促進(jìn)ETEC的生物被膜的生成量，且這一作用可能與eutR和eutB基因密切相關(guān)。