香芹酚對肉兔腸道形態(tài)、胃腸道pH、盲腸發(fā)酵和微生物區(qū)系的影響

劉福鑫 來寧潔 于志凱 蔡宇恒 孫 磊 劉亞娟,3 陳賽娟,3* 陳寶江*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)山區(qū)研究所，保定 071001；3.河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，保定 071001)

胃腸道作為機(jī)體最大的免疫器官，在營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收和代謝中起重要作用，其腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、腸道內(nèi)環(huán)境及微生物區(qū)系等因素直接關(guān)系畜禽腸道功能，腸道感染病原微生物是引起動物腸道黏膜和上皮細(xì)胞損傷、腸道菌群失調(diào)、免疫力下降進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉、細(xì)菌感染、生長速度緩慢甚至死亡的重要原因[1]。腸道功能的優(yōu)化對動物生長發(fā)育各階段的整體代謝、生理、疾病狀態(tài)和生長性能具有重要意義，為解決畜禽腸道健康問題，近年來研究人員尋找了多種代替抗生素的綠色添加劑，其中植物精油(essential oils，EO)是熱門研究之一，植物精油是從天然植物中提取的，具有多種生物活性，其中香芹酚(carvacrol)是牛至、百里香等常用精油中的主要成分，具有促進(jìn)動物生長、改善腸道形態(tài)、調(diào)節(jié)腸道菌群[2-3]、提高消化酶活性[4]、提高免疫力和抗氧化能力等諸多作用。曾子悠等[5]研究發(fā)現(xiàn)，植物精油(香芹酚和百里香酚)和酸化劑可提高麻黃肉雞絨隱比，改善腸道形態(tài)。同時，香芹酚和百里香酚可破壞病原微生物結(jié)構(gòu)，殺滅病原菌[6]，提高仔豬結(jié)腸內(nèi)有益菌的相對豐度，降低有害菌的相對豐度，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)腸道微生物的代謝功能[7]。綜合發(fā)現(xiàn)，香芹酚作為添加劑多在豬和禽上使用，且多為聯(lián)合使用，單獨(dú)使用較少，在兔中應(yīng)用更是鮮有報(bào)道。本課題組前期飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，香芹酚添加水平為300 g/t時肉兔的料重比最低，養(yǎng)分表觀消化率最高[8]，在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)旨在從腸道形態(tài)、胃腸道pH、盲腸發(fā)酵和盲腸微生物區(qū)系等方面進(jìn)一步研究香芹酚添加水平對肉兔腸道健康的影響，為香芹酚作為新型飼料添加劑在肉兔養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)及實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼糧

香芹酚由廣州某公司提供(含量為4.56%)，基礎(chǔ)飼糧參照谷子林等[9]推薦的肉兔飼糧營養(yǎng)水平進(jìn)行配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

選取120只35日齡健康新西蘭肉兔，體重為(1.06±0.04) kg，公母各占1/2，隨機(jī)分為4組，每組30個重復(fù)，每個重復(fù)1只。對照組(CON組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組(T1、T2、T3組)飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加150、300和450 g/t香芹酚的試驗(yàn)飼糧。自由采食與飲水，預(yù)試期7 d，正試期28 d。

1.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.1 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的測定

試驗(yàn)結(jié)束后，每組選取10只平均體重相近的肉兔進(jìn)行屠宰，屠宰后各取1 cm空腸和回腸腸段固定備測。采用BA210 Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)對腸段切片進(jìn)行圖像采集，測量腸道絨毛高度和隱窩深度，每張切片測量10次取平均值，并計(jì)算絨隱比。

1.3.2 胃腸道內(nèi)環(huán)境的測定

胃腸道pH：屠宰后取胃、空腸、回腸和盲腸，用pH SJ-3F型pH計(jì)插入腸道內(nèi)測定pH，每個部分測定3次取平均值。

盲腸揮發(fā)性脂肪酸含量：取1 g盲腸內(nèi)容物3倍稀釋，10 000×g離心10 min，取1 mL上清液和0.2 mL含有內(nèi)標(biāo)物2-乙基丁酸(2EB)的25%偏磷酸溶液，混勻，冰浴30 min以上，再次離心10 min，去除樣品中蛋白質(zhì)沉淀物，取上清液使用Agilent 6890N氣相色譜儀進(jìn)行測定。

取盲腸食糜裝入5 mL無菌凍存管中，-80 ℃保存?zhèn)錅y。在杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司對樣品進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA的高通量測序分析。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA) ，Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，微生物多樣性數(shù)據(jù)顯著性采用Graphpad Software非參數(shù)檢驗(yàn)分析，以P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 香芹酚對肉兔腸道形態(tài)的影響

由表2可知，添加不同水平香芹酚僅對肉兔空腸絨毛高度有顯著影響(P<0.05)，其中T1組的絨毛高度顯著低于其他3組(P<0.05)，與T1組相比，CON、T2和T3組空腸絨毛高度分別提高25.39%、30.61%和38.94%。飼糧添加香芹酚降低了肉兔空腸隱窩深度，提高了空腸絨隱比，但無顯著影響(P>0.05)。飼糧添加香芹酚水平對肉兔回腸腸道形態(tài)無顯著影響(P>0.05)。

表2 香芹酚對肉兔腸道形態(tài)的影響

2.2 香芹酚對肉兔胃腸道pH的影響

由表3可知，飼糧添加香芹酚對肉兔胃、空腸、回腸和盲腸內(nèi)pH均無顯著影響(P>0.05)，其中，T1、T2和T3組的肉兔胃、空腸和回腸的pH均略低于CON組。

表3 香芹酚對肉兔胃腸道pH的影響

2.3 香芹酚對肉兔盲腸揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

由表4可知，飼糧添加香芹酚，肉兔盲腸的丙酸、丁酸、異戊酸和戊酸含量均略有增加，但差異不顯著(P>0.05)，對戊酸含量有增加趨勢(0.05≤P<0.10)，對異丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量無顯著影響(P>0.05)，其中T2組的丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量最高，較CON組分別提高了16.35%和4.03%。

表4 香芹酚對肉兔盲腸揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

2.4 香芹酚對盲腸微生物組成的影響

2.4.1 特征值(feature)分布Venn圖

由圖1可知，根據(jù)feature豐度表，計(jì)算各組共有feature的數(shù)量，并通過Venn圖直觀地呈現(xiàn)各組共有和特有的feature數(shù)目，若feature只存在于1個分組，則該feature為該分組特有。由圖1可以看出，CON、T1、T2、T3組特有的feature數(shù)目分別為2 362、2 471、2 715和2 197。

CON、T1、T2、T3分別代表對照組、試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組。下圖同

2.4.2 Alpha多樣性分析

由表5可知，在物種豐富度上，T3組盲腸微生物Chao1指數(shù)和操作分類單元(OTU)數(shù)量指數(shù)顯著低于T1和T2組(P<0.05)，與CON組無顯著差異(P>0.05)。飼糧添加香芹酚對盲腸菌群的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和覆蓋度指數(shù)無顯著影響(P>0.05)。

表5 香芹酚對肉兔盲腸微生物菌群Alpha多樣性指數(shù)的影響

2.4.3 香芹酚對肉兔盲腸微生物物種豐富度的影響

2.4.3.1 門水平分析

門水平上以微生物豐度前10作為各組的優(yōu)勢菌門進(jìn)行分析。由圖2可知，肉兔盲腸微生物在門水平上均主要由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和放線菌門(Actinobacteria)4種菌門組成，各組4種菌門相對豐度總和分別為96.67%、95.18%、96.21%和95.96%。對微生物群落構(gòu)成比例進(jìn)一步分析結(jié)果見表6，與CON組相比，飼糧添加香芹酚對盲腸內(nèi)厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門、放線菌門、未分類菌群(unclassified)、變形菌門(Proteobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)、髖骨細(xì)菌門(Patescibacteria)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)和藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)相對豐富度均無顯著影響(P>0.05)。

表6 香芹酚對肉兔盲腸菌群門水平的影響

圖2 門水平上盲腸微生物菌群相對豐度

2.4.3.2 屬水平分析

微生物菌群在屬水平上以微生物豐度前30作為各組的優(yōu)勢菌屬進(jìn)行分析(圖3)，并選取豐度>1%的24類菌屬進(jìn)行顯著性分析。由表7可知，T1組的肉兔盲腸瘤胃球菌科 NK4A214群(Ruminococcaceae_NK4A214_group)相對豐度顯著高于T2和T3組(P<0.05)，與CON組相比無顯著差異(P>0.05)；CON和T3組梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)相對豐度顯著低于T1和T2組(P<0.05)；飼糧添加香芹酚有降低肉兔盲腸瘤胃球菌科_UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)的趨勢(0.05≤P<0.10)，對其他菌屬相對豐度均無顯著影響(P>0.05)。

表7 香芹酚對肉兔盲腸菌群屬水平的影響

續(xù)表7項(xiàng)目Items組別 GroupsCON(對照 Control)T1T2T3P值P-value未分類菌屬Unclassified0.71±0.151.45±0.461.38±0.321.33±0.680.571梭狀芽孢桿菌屬Clostridium0.64±0.09b1.10±0.04a0.95±0.08a0.65±0.10b0.038瘤胃球菌科_UCG-010Ruminococcaceae_UCG-0101.40±0.761.43±0.351.43±0.600.81±0.340.546真桿菌科未分類菌屬Eubacteriaceae_unclassified0.46±0.151.34±0.620.54±0.160.58±0.130.392另支菌屬Alistipes1.70±0.830.66±0.140.37±0.200.83±0.330.320瘤胃球菌科UCG-005Ruminococcaceae_UCG-0050.54±0.181.08±0.631.05±0.420.55±0.140.773Kineothrix0.96±0.650.29±0.130.68±0.442.00±0.940.257

圖3 屬水平上盲腸微生物菌群相對豐度

3 討 論

3.1 香芹酚對肉兔腸道形態(tài)的影響

小腸是機(jī)體內(nèi)養(yǎng)分消化吸收的主要場所，其中絨毛高度、隱窩深度以及絨隱比等決定著小腸的消化吸收功能，絨毛高度越大，小腸吸收面積越大，隱窩深度越淺，細(xì)胞生成速度越快，絨隱比越大，機(jī)體的消化吸收能力越強(qiáng)。大多數(shù)研究表明，香芹酚單獨(dú)使用或與其他植物精油聯(lián)合使用，可改善動物的腸道形態(tài)。宋轉(zhuǎn)等[10]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加肉桂醛、百里香和牛至油的復(fù)合植物精油可改善仔豬腸道形態(tài)，緩解氧化應(yīng)激引起的腸道損傷。Mohiti-Asli等[11-12]研究發(fā)現(xiàn)，添加300 mg/kg牛至油可以顯著提高肉雞的腸道絨毛高度和絨隱比，添加500 mg/kg可緩解球蟲病引起的腸道損傷。本試驗(yàn)中，添加150 g/t香芹酚顯著降低了空腸的絨毛高度，小腸吸收面積減少，但隱窩深度在一定程度上變淺有利于腸上皮細(xì)胞成熟，由于空腸絨隱比沒有顯著差異，說明上述變化不會影響空腸整體的消化吸收能力。添加300和450g/t香芹酚提高了空腸絨毛高度和絨隱比，降低了隱窩深度，對回腸腸道形態(tài)無顯著作用。腸道絨毛發(fā)育受腸道環(huán)境、食糜黏度變化、飼糧組成和腸道微生物等多方面影響，其中食糜黏度降低，可減少有害菌數(shù)量，增加有益微生物繁殖，減少腸道損傷[13]。Hashemipour等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在黏性基礎(chǔ)飼糧中添加百里香酚+香芹酚可能有助于減輕黏性化合物在畜禽飼糧中的負(fù)面影響。牛金玲等[15]提出牛至精油和抗菌肽對腸道閉合蛋白1(Claudin1)基因相對表達(dá)量具有位置特異性，具體機(jī)制尚未清楚。本試驗(yàn)未研究香芹酚對腸道屏障相關(guān)基因表達(dá)的影響，150 g/t和300～450 g/t香芹酚對空腸絨毛高度的差異，可能是通過腸道黏膜相關(guān)基因表達(dá)量改變所引起的，具體作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。

3.2 香芹酚對肉兔胃腸道pH和盲腸發(fā)酵的影響

部分植物精油具有獨(dú)特香氣，影響畜禽采食量且能夠降低畜禽腸道pH，改善腸道內(nèi)環(huán)境，調(diào)整胃腸道菌群分布，影響腸道未消化的纖維顆粒發(fā)酵，提高畜禽飼料轉(zhuǎn)化率[16]。本試驗(yàn)中，添加香芹酚降低了胃、空腸和回腸內(nèi)的pH，且添加300 g/t香芹酚時盲腸pH最低，為胃腸道提供了酸性環(huán)境。腸道中的揮發(fā)性脂肪酸是微生物的代謝產(chǎn)物，短鏈脂肪酸甲酸、乙酸、丙酸和丁酸可發(fā)揮抑菌作用，提高腸道營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[17]。周瑞[18]發(fā)現(xiàn)牛至油可顯著提高羔羊盲腸總揮發(fā)性脂肪酸和乙酸含量，顯著降低異戊酸和戊酸含量，且發(fā)現(xiàn)牛至精油對微生物發(fā)酵可能具有一定的選擇性。本試驗(yàn)中，添加不同水平香芹酚對肉兔盲腸丙酸、丁酸、異戊酸和戊酸含量均略有增加，其中添加300 g/t香芹酚時盲腸內(nèi)丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量最高，丙酸經(jīng)過肝臟糖原異生作用生成葡萄糖為機(jī)體供能[19]，丁酸轉(zhuǎn)化為丁酸鹽可為結(jié)腸黏膜提供能量，增強(qiáng)腸道免疫功能[20]，為機(jī)體提供能量?？梢?，香芹酚在一定程度上提高肉兔盲腸揮發(fā)性脂肪酸的含量，并通過調(diào)節(jié)腸道pH，共同影響腸道的營養(yǎng)消化能力和機(jī)體健康，其揮發(fā)性脂肪酸組成不同，同時受腸道微生物、飼糧組成、飼料添加劑、不同日齡及品種等多方面影響[19]。

3.3 香芹酚對肉兔盲腸微生物區(qū)系的影響

肉兔腸道的微生物區(qū)系主要包括腸道微生物多樣性及其豐度，研究發(fā)現(xiàn)植物精油既可降低也可升高微生物多樣性[21-22]，通過有效抑制有害菌[1,23]，較弱抑制或提高有益菌來降低或升高微生物的多樣性[24]。腸道微生物區(qū)系的穩(wěn)定與變動雖與宿主的健康密切相關(guān)，但是腸道健康狀況的改變很可能是部分病原體的增加或減少引起的，而非整體菌群多樣性的變動導(dǎo)致。本試驗(yàn)中，肉兔盲腸內(nèi)的主要優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門和放線菌門，飼糧添加香芹酚對盲腸微生物門水平無顯著影響，對少數(shù)屬水平微生物有顯著影響。飼糧添加150 g/t香芹酚時瘤胃球菌科NK4A214相對豐度大幅度提高，添加150～300 g/t香芹酚時顯著增加了梭狀芽孢桿菌屬的相對豐度，添加150和300 g/t的香芹酚能顯著增加梭狀芽孢桿菌屬的相對豐度，梭狀芽孢桿菌屬在腸道健康中發(fā)揮作用主要有代謝物的產(chǎn)生和免疫系統(tǒng)的直接相互作用2種途徑，梭狀芽孢桿菌屬是碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸的主要力量，特別是丁酸鹽，作為杰出的導(dǎo)體，可以協(xié)調(diào)多種生理功能，維持腸道健康，與飼糧添加300 g/t香芹酚使丁酸含量最高的結(jié)果相對應(yīng)。與此同時，Atarashi等[25-26]研究發(fā)現(xiàn)，梭狀芽孢桿菌屬不僅可促進(jìn)結(jié)腸黏膜調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的積累，豐富結(jié)腸中的轉(zhuǎn)化生長因子-β，還可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞增殖和分化，口服梭狀芽孢桿菌屬可減輕小鼠的結(jié)腸炎和過敏性腹瀉，這可能是添加300 g/t香芹酚雖顯著降低采食量，但生長速度和腹瀉率較對照組減少的原因之一。Treg細(xì)胞是維持機(jī)體免疫耐受的重要因素之一，它由胸腺產(chǎn)生后輸出至外周，通過主動調(diào)節(jié)的方式，抑制存在于正常機(jī)體內(nèi)潛在自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化與增殖，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫力[27]，前期生長試驗(yàn)結(jié)果中，飼糧添加300 g/t香芹酚使胸腺指數(shù)增加趨勢明顯[8]，從側(cè)面也驗(yàn)證了梭狀芽孢桿菌屬可增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，通過釋放生長因子、增加腸道黏膜能量以及增強(qiáng)免疫力等方式在腸道健康中發(fā)揮著重要作用。飼糧添加150～450 g/t香芹酚增加了毛螺菌科NK4A136群、瘤胃球菌科UCG-005、克里斯滕森菌科R-7群和艾克曼菌屬的相對豐度，瘤胃球菌科和毛螺菌科是短鏈脂肪酸的產(chǎn)生者，在降解多種多糖和纖維中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[28]，克里斯滕森菌科屬和艾克曼菌屬在腸道黏膜中廣泛存在，是定植于黏膜層的腸道共存體[29]。綜上所述，香芹酚稍改善了肉兔的盲腸微生物區(qū)系，且抑菌作用可能需要某些特定的作用機(jī)制來實(shí)現(xiàn)，不同作用機(jī)制間又受到途徑反應(yīng)物或者生成物的影響，且最終作用途徑取決于中間產(chǎn)物pH、化學(xué)結(jié)構(gòu)、含量及機(jī)體細(xì)菌微生物的數(shù)量和類型[6,30-31]。綜合何楚俐等[32]在體外抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，香芹酚抑菌效果強(qiáng)于其他種類植物精油，且與其他添加劑聯(lián)合使用會有協(xié)同或相加效果，抑菌能力更強(qiáng)，以及考慮到斷奶肉兔腸道功能的復(fù)雜機(jī)制，香芹酚與其他抗炎、抗氧化和抗菌成分的飼料添加劑混合使用可能更有利于提高肉兔的腸道健康。

4 結(jié) 論

在肉兔飼糧中添加香芹酚可改善肉兔盲腸微生物內(nèi)環(huán)境與區(qū)系組成，促進(jìn)肉兔的腸道健康。