7種中草藥對(duì)肉牛瘤胃體外發(fā)酵及甲烷產(chǎn)量的影響

丁子悅 薛 白 蔡凌云 任伊凡 王之盛 王立志 彭全輝 胡 瑞 鄒華圍

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，四川省牛低碳養(yǎng)殖與安全生產(chǎn)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130；2.凱里學(xué)院大健康學(xué)院，凱里 556011)

全球變暖早已成為世界共為關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題之一，我國(guó)也于2020年提出了碳達(dá)峰、碳中和的戰(zhàn)略目標(biāo)。甲烷(CH4)是一種溫室作用比二氧化碳(CO2)強(qiáng)20～30倍的溫室氣體，在由農(nóng)業(yè)活動(dòng)排放的CH4中，反芻動(dòng)物被認(rèn)為是主要排放源，全球反芻動(dòng)物每年產(chǎn)生CH4約8×107t，占全球人類(lèi)活動(dòng)排放量的28%[1]。不僅如此，反芻動(dòng)物瘤胃產(chǎn)生的CH4不能被機(jī)體利用而以噯氣的形式排出體外，造成了反芻動(dòng)物2%～15%的能量浪費(fèi)[2-3]，不利于畜產(chǎn)品的綠色高效生產(chǎn)。隨著我國(guó)居民對(duì)優(yōu)質(zhì)肉、蛋、奶產(chǎn)品的需求不斷提升和反芻動(dòng)物養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，探求減少反芻動(dòng)物CH4排放的方法已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。一些抗生素如莫能菌素已被廣泛證實(shí)具有降低CH4產(chǎn)生的作用[4-5]，但隨著全球范圍內(nèi)飼料“禁抗”的推行，亟需探尋新的產(chǎn)品或方法來(lái)減少CH4的排放。

中草藥的應(yīng)用和研究在我國(guó)具有悠久的歷史，近年來(lái)更是發(fā)現(xiàn)其提取物具有添加量小、毒副性小、無(wú)殘留或殘留極小及不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)[6]，被廣泛應(yīng)用于藥品、食品和飼料添加劑領(lǐng)域。目前，已有多個(gè)報(bào)道表明飼糧中添加中草藥添加劑會(huì)對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生影響。Bodas等[7]評(píng)估了450種植物作為抗微生物飼料添加劑的潛力，其中35種植物的添加較對(duì)照組降低了CH4產(chǎn)量15%以上，且對(duì)消化率、總產(chǎn)氣量和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)沒(méi)有不利影響。García-González等[8]研究了掌葉大黃根和歐鼠李樹(shù)皮對(duì)體外發(fā)酵的影響，表明掌葉大黃根可以使CH4產(chǎn)量顯著下降。Durmic等[9]篩選了128種多年生木本植物，研究其對(duì)體外發(fā)酵的影響，其中有59種植物降低了CH4產(chǎn)量。因此，中草藥及其提取物有望成為一種新的瘤胃發(fā)酵調(diào)控劑來(lái)減少反芻動(dòng)物的CH4排放。

貴州地區(qū)有極其豐富的中草藥資源，全省共有動(dòng)、植、礦物藥4 300余種，其中植物藥4 000余種[10]。帶纖毛的原蟲(chóng)能與產(chǎn)甲烷菌形成內(nèi)源共生系統(tǒng)，有約20%的產(chǎn)甲烷菌寄生在原蟲(chóng)表面。中草藥中的有效成分多為植物次生代謝物，基本可分為黃酮類(lèi)、醌類(lèi)、酚類(lèi)、酯類(lèi)、萜類(lèi)、甾體及其苷、有機(jī)酸、生物堿、多糖類(lèi)、揮發(fā)油幾大類(lèi)，有些成分可以顯著抑制瘤胃原蟲(chóng)的生長(zhǎng)活性[11-12]，介此可以間接減少產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量，進(jìn)而降低反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)CH4的產(chǎn)生。本試驗(yàn)選用了7種不同中草藥，分別是野葛根、荊芥、柴胡、金銀花、鉤藤、仙鶴草、五香血藤。這些中草藥富含豐富的活性成分，但目前僅見(jiàn)到少量關(guān)于野葛根、柴胡及金銀花的提取物在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用的報(bào)道[13-16]，且這些中草藥對(duì)瘤胃發(fā)酵調(diào)控及對(duì)CH4排放的影響方面尚缺乏研究。鑒于此，本試驗(yàn)采用體外產(chǎn)氣法研究這7種中草藥對(duì)肉牛瘤胃體外發(fā)酵的影響，篩選出有利于瘤胃發(fā)酵或抑制CH4生成的中草藥類(lèi)添加劑和添加劑量，旨在為開(kāi)發(fā)天然的反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵調(diào)控劑和反芻動(dòng)物CH4減排產(chǎn)品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的7種中草藥均來(lái)自貴州省黔東南苗族侗族自治州凱里市。7種中草藥的主要活性成分及含量見(jiàn)表1，將中草藥粉碎過(guò)40目篩，密封備用。發(fā)酵所用底物來(lái)自于肉牛全混合日糧，成分及配比見(jiàn)表2，將其65 ℃烘干，粉碎過(guò)40目篩并密封待用。體外發(fā)酵所用的瘤胃液采集自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)場(chǎng)的3頭體況相近的健康筠連黃牛。試驗(yàn)當(dāng)天在晨飼前通過(guò)連接真空泵的瘤胃管經(jīng)口腔抽取瘤胃液，并轉(zhuǎn)移至經(jīng)39 ℃生理鹽水預(yù)熱的保溫瓶中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)4層紗布過(guò)濾后，于39 ℃水浴條件下快速進(jìn)行后續(xù)操作。

表1 7種中草藥的主要活性成分及含量

表2 體外發(fā)酵所用飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用7×3+1兩因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置7種不同中草藥，分別為野葛根、荊芥、柴胡、金銀花、鉤藤、仙鶴草和五香血藤；3個(gè)添加劑量，分別為15、20、25 mg(額外添加于200 mg發(fā)酵底物中)；并設(shè)置1個(gè)不添加中草藥的對(duì)照，共計(jì)22個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 體外發(fā)酵培養(yǎng)

準(zhǔn)確稱(chēng)取200 mg發(fā)酵底物置于帶有刻度的發(fā)酵針管(上海鴿牌全玻璃100 mL注射器)底部，并按試驗(yàn)設(shè)計(jì)額外加入相應(yīng)品種和劑量的中草藥粉末。在針管活塞上涂抹適量凡士林，以增強(qiáng)針管的氣密性。額外設(shè)置3個(gè)空白管(不添加發(fā)酵底物)以消除產(chǎn)氣量誤差。參照Menke等[22]的方法配制人工瘤胃緩沖液各組分，成分及配比見(jiàn)表3，將其按比例充分混勻后持續(xù)通入CO2，直至溶液顏色由粉紅色變?yōu)闊o(wú)色透明。隨后預(yù)熱至39 ℃，與過(guò)濾保溫的瘤胃液以2∶1的比例混合均勻。向每根發(fā)酵針管中加入30 mL混合人工瘤胃培養(yǎng)液，倒立排盡空氣后用止水夾密封針管并置于預(yù)設(shè)為39 ℃的恒溫振蕩水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng)，SHZ-88)中開(kāi)始培養(yǎng)。分別于0、2、4、8、12、24 h讀取針管刻度并計(jì)算產(chǎn)氣量。培養(yǎng)24 h后，取出置于冰水中終止發(fā)酵。將氣體收集至集氣袋中立即分析氣體成分，將發(fā)酵液搖勻并轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，置于-20 ℃保存等待后續(xù)分析。

表3 人工瘤胃緩沖液各組分及組成

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

發(fā)酵底物中干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、鈣(Ca)和磷(P)的含量參照張麗英[23]的方法測(cè)定。

1.4.2 產(chǎn)氣量(GP)的測(cè)定

GP(mL/mg)=200×(發(fā)酵24 h時(shí)記錄的各管GP-該時(shí)間點(diǎn)空白管的GP)/發(fā)酵底物重量。

1.4.3 氨態(tài)氮(NH3-N)濃度的測(cè)定

采用堿性次氯酸鈉-苯酚分光光度法[24]測(cè)定發(fā)酵液中NH3-N濃度。以氯化銨作為標(biāo)準(zhǔn)品，在650 nm條件下進(jìn)行比色。

1.4.4 VFA濃度的測(cè)定

以巴豆酸為內(nèi)標(biāo)物，采用氣相色譜儀(美國(guó)瓦里安CP-3800)測(cè)定發(fā)酵液中VFA中乙酸、丙酸、丁酸的濃度。色譜柱為4 mm(內(nèi))×2 m玻璃柱，內(nèi)部充滿(mǎn)3%游離脂肪酸相。柱溫為140 ℃，汽化室溫度為200 ℃，氫火焰檢測(cè)器(FID)溫度為180 ℃。使用氮?dú)?N2)作為載氣，流速為40 mL/min；氫氣(H2)流速為50 mL/min；氧氣(O2)流速為50 mL/min；樣品進(jìn)樣量為1 μL?？倱]發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度為乙酸、丙酸、丁酸濃度之和。

1.4.5 氣體成分的測(cè)定

利用氣相色譜儀(福立GC9790Ⅱ)測(cè)定氣體中CH4、CO2、H2的百分濃度，各成分氣體產(chǎn)量=GP×百分濃度。使用氬氣(Ar)作為載氣，氣體流量為20 mL/min，進(jìn)樣量為0.5 mL；使用熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)，色譜柱型號(hào)為T(mén)DX-01(1 m×1/8)，柱箱溫度為80 ℃，檢測(cè)器溫度為120 ℃，進(jìn)樣口溫度為120 ℃。

1.4.6 微生物蛋白(MCP)濃度的測(cè)定

采用差速離心法分離MCP[25]，然后加入200 μL裂解液(北京索萊寶科技有限公司)并超聲冰浴裂解沉淀(變幅桿Φ02，10 s/10 s，20 min，功率237.5 W)，用二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定其中總蛋白濃度即為MCP濃度，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先由Excel 2016進(jìn)行初步整理，之后運(yùn)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件的一般線(xiàn)性模型(GLM)對(duì)所有處理進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)剔除對(duì)照處理之后的其余處理進(jìn)行兩因素方差分析，主效應(yīng)為中草藥種類(lèi)和添加劑量，并檢驗(yàn)二者的交互效應(yīng)，差異顯著時(shí)采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。用線(xiàn)性插值的方法對(duì)缺失值進(jìn)行替換。結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)的形式表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 不同中草藥和添加劑量對(duì)體外發(fā)酵24 h后GP及NH3-N和MCP濃度的影響

不同中草藥和添加劑量對(duì)體外發(fā)酵24 h后GP、NH3-N和MCP濃度的影響見(jiàn)表4。兩因素方差分析結(jié)果顯示，中草藥種類(lèi)對(duì)GP、NH3-N和MCP濃度均有極顯著影響(P<0.001)；添加劑量對(duì)NH3-N濃度有顯著影響(P=0.046)，對(duì)MCP濃度有極顯著影響(P<0.001)；中草藥種類(lèi)與添加劑量的交互效應(yīng)對(duì)NH3-N濃度有顯著影響(P=0.010)。在7種中草藥中，GP以添加荊芥時(shí)最高，顯著高于添加五香血藤、金銀花、仙鶴草或鉤藤時(shí)，以添加鉤藤時(shí)最低(P<0.05)；NH3-N濃度以添加荊芥時(shí)最高，顯著高于添加其他6種中草藥時(shí)(P<0.05)，以添加五香血藤時(shí)最低；MCP濃度以添加仙鶴草時(shí)最高，顯著高于添加其他6種中草藥時(shí)(P<0.05)，以添加野葛根時(shí)最低。與其他添加劑量相比，25 mg的添加劑量顯著提高了NH3-N和MCP濃度(P<0.05)。單因素方差分析結(jié)果顯示，與不添加中草藥的對(duì)照相比，添加20和25 mg荊芥顯著提高了NH3-N濃度(P<0.05)；添加20和25 mg五香血藤則顯著降低了NH3-N濃度(P<0.05)；添加25 mg仙鶴草顯著提高了MCP濃度(P<0.05)。

表4 不同中草藥和添加劑量對(duì)體外發(fā)酵24 h后GP及NH3-N和MCP濃度的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

2.2 不同中草藥和添加劑量對(duì)體外發(fā)酵24 h后VFA濃度的影響

不同中草藥和添加劑量對(duì)體外發(fā)酵24 h后VFA濃度的影響見(jiàn)表5。兩因素方差分析結(jié)果顯示，中草藥種類(lèi)對(duì)TVFA(P<0.001)、乙酸(P<0.001)、丙酸(P=0.002)、丁酸濃度(P<0.001)和乙酸/丙酸(A/P)值(P<0.001)均有極顯著影響；添加劑量對(duì)TVFA(P=0.041)和丙酸濃度(P=0.010)有顯著影響，乙酸濃度有受添加劑量影響的趨勢(shì)(P=0.052)；中草藥種類(lèi)與添加劑量互作效應(yīng)對(duì)TVFA(P=0.029)、乙酸(P=0.042)和丁酸濃度(P=0.019)均有顯著影響，丙酸濃度有受中草藥種類(lèi)與添加劑量互作效應(yīng)影響的趨勢(shì)(P=0.052)。在7種中草藥中，TVFA、乙酸、丁酸濃度和A/P值均以添加荊芥時(shí)最高，顯著高于添加其他6種中草藥時(shí)(P<0.05)；丙酸濃度以添加金銀花時(shí)最高，顯著高于添加柴胡或五香血藤時(shí)(P<0.05)；A/P值以添加金銀花、五香血藤時(shí)較低，顯著低于添加其他5種中草藥時(shí)(P<0.05)；添加五香血藤時(shí)TVFA、乙酸、丙酸和丁酸濃度顯著低于添加其他6種中草藥時(shí)(P<0.05)。與20 mg的添加劑量相比，25 mg的添加劑量顯著提高了TVFA、乙酸和丙酸濃度(P<0.05)。單因素方差分析結(jié)果顯示，與不添加中草藥的對(duì)照相比，添加15和25 mg野葛根顯著提高TVFA和乙酸濃度(P<0.05)，添加15和25 mg荊芥顯著提高TVFA濃度(P<0.05)，添加15和20 mg荊芥顯著提高了乙酸濃度(P<0.05)，添加15和20 mg五香血藤則顯著降低了TVFA和乙酸濃度(P<0.05)；添加25 mg金銀花或野葛根顯著提高了丙酸濃度(P<0.05)；添加3種劑量的荊芥或15 mg野葛根顯著提高了丁酸濃度(P<0.05)，添加20 mg五香血藤則顯著降低了丁酸濃度(P<0.05)；添加3種劑量的五香血藤或金銀花均顯著降低了A/P值(P<0.05)。

表5 不同中草藥和添加劑量對(duì)體外發(fā)酵24 h后VFA濃度的影響

續(xù)表5中草藥種類(lèi) Species of Chinese herb添加劑量 Additional dose/mg總揮發(fā)性脂肪酸TVFA/(mmol/L)乙酸Acetic acid/(mmol/L)丙酸 Propionic acid/(mmol/L)丁酸Butyric acid/(mmol/L)乙酸/丙酸 A/P五香血藤Schisandra sphenantheraRehder & E. H. Wilson1556.96e36.76f12.04ef8.16fg3.05efg2053.33e34.46f11.24f7.63g3.07defg2566.11cd42.43de14.32abcd9.36def2.97g均值標(biāo)準(zhǔn)誤 SEM0.77 0.52 0.14 0.15 0.02 P值 P-value<0.001<0.0010.001<0.001<0.001中草藥種類(lèi) Species of herb野葛根 Pueraria montana (Lour.) Merr.71.13ab46.37ab14.15ab10.61b3.28b荊芥 Nepeta cataria L.73.37a47.90a13.95ab11.52a3.44a柴胡 Bupleurum chinense DC.68.34b44.66bc13.50b10.17bc3.31b金銀花 Lonicera japonica Thunb.66.81b43.12c14.49a9.19d2.98c鉤藤 Uncaria rhynchophylla (Miq.)68.40b44.79bc13.76ab9.84cd3.26b仙鶴草 Agrimonia pilosa Ledeb.67.83b44.43bc13.84ab9.57cd3.21b五香血藤 Schisandra sphenanthera Rehder & E. H. Wilson58.80c37.88d12.53c8.39e3.03c添加劑量 Additional dose/mg1568.03ab44.22ab13.78ab10.03 3.21 2066.00b43.05b13.28b9.66 3.24 2569.41a45.23a14.17a10.00 3.20 P值 P-value中草藥種類(lèi) Species of Chinese herb<0.001<0.0010.002 <0.001<0.001添加劑量 Additional dose0.0410.0520.010 0.199 0.412 中草藥種類(lèi)×添加劑量 Species of Chinese herb×additional dose0.0290.0420.052 0.019 0.626

2.3 不同中草藥和添加劑量對(duì)體外發(fā)酵24 h后H2、CH4和CO2產(chǎn)量的影響

不同中草藥和添加劑量對(duì)體外發(fā)酵24 h后H2、CH4和CO2產(chǎn)量的影響見(jiàn)表6。兩因素方差分析結(jié)果顯示，中草藥種類(lèi)對(duì)H2、CH4和CO2產(chǎn)量均有極顯著影響(P<0.001)，但添加劑量以及中草藥種類(lèi)與添加劑量的交互效應(yīng)對(duì)上述氣體產(chǎn)量的影響均不顯著(P>0.05)。在7種中草藥中，H2、CH4和CO2產(chǎn)量均以添加荊芥時(shí)最高，H2產(chǎn)量以添加鉤藤時(shí)最低，CO2和CH4產(chǎn)量以添加仙鶴草時(shí)最低；添加鉤藤或仙鶴草時(shí)H2顯著低于添加荊芥、野葛根或柴胡時(shí)(P<0.05)，添加仙鶴草時(shí)CH4產(chǎn)量顯著低于添加荊芥、野葛根或柴胡時(shí)(P<0.05)，添加仙鶴草、鉤藤或金銀花時(shí)CO2產(chǎn)量顯著低于添加荊芥、野葛根或柴胡時(shí)(P<0.05)。單因素方差分析結(jié)果顯示，與不添加中草藥的對(duì)照相比，添加20 mg荊芥或25 mg野葛根使H2產(chǎn)量顯著增加(P<0.05)，添加20 mg荊芥還使CH4產(chǎn)量顯著增加(P<0.05)；添加20 mg金銀花顯著降低了CH4和CO2的產(chǎn)量(P<0.05)，添加25 mg仙鶴草也使CO2產(chǎn)量顯著降低(P<0.05)。綜上可知，本試驗(yàn)中添加鉤藤、仙鶴草和金銀花可以降低體外發(fā)酵溫室氣體的產(chǎn)量。

表6 不同中草藥和添加劑量對(duì)體外發(fā)酵24 h后H2、CH4和CO2產(chǎn)量的影響

續(xù)表6中草藥種類(lèi) Species of Chinese herb添加劑量 Additional dose/mg氫氣 H2/(μL/mg)甲烷 CH4/(mL/mg)二氧化碳 CO2/(mL/mg)P值 P-value中草藥種類(lèi) Species of Chinese herb<0.001<0.001<0.001添加劑量 Additional dose0.390 0.590 0.242 中草藥種類(lèi)×添加劑量 Species of Chinese herb×additional dose0.887 0.513 0.278

3 討 論

3.1 不同中草藥和添加劑量對(duì)體外發(fā)酵GP及NH3-N和MCP濃度的影響

GP作為體外發(fā)酵體系中評(píng)定反芻動(dòng)物瘤胃微生物發(fā)酵的重要指標(biāo)，綜合性地反映了發(fā)酵底物的發(fā)酵程度和降解特性，一定程度上能衡量瘤胃微生物發(fā)酵的活躍程度和總趨勢(shì)。本試驗(yàn)中添加荊芥使GP提高的程度高于其他6種中草藥，而添加鉤藤和仙鶴草時(shí)GP較低。但單因素方差分析結(jié)果顯示，中草藥種類(lèi)和添加劑量均未對(duì)GP造成顯著影響，說(shuō)明各添加中草藥的處理與不添加中草藥的對(duì)照相比并未對(duì)瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生顯著影響。

NH3-N濃度是反映瘤胃氮代謝的重要參數(shù)，是微生物合成MCP的前體物質(zhì)，取決于瘤胃微生物對(duì)飼糧中蛋白質(zhì)的降解與微生物合成蛋白質(zhì)時(shí)的氨利用水平[26]，NH3-N濃度的提高意味著瘤胃中蛋白質(zhì)降解率的提高或者瘤胃微生物對(duì)NH3-N利用率的降低[11]。Satter等[27]研究發(fā)現(xiàn)，體外條件下，保證瘤胃微生物最快生長(zhǎng)的NH3-N濃度為20～50 mg/dL，本試驗(yàn)中的NH3-N濃度基本上均處于此范圍。與不添加中草藥的對(duì)照相比，添加20和25 mg荊芥使發(fā)酵液中NH3-N濃度顯著提高，添加15和20 mg五香血藤則使其顯著降低，然而卻未對(duì)MCP濃度造成顯著影響，且各中草藥之間也是添加荊芥時(shí)NH3-N濃度最高，添加五香血藤時(shí)最低，而MCP濃度卻并無(wú)同樣的突出變化，提示荊芥可能會(huì)提高瘤胃微生物對(duì)氨基酸的脫氨基作用以及對(duì)飼糧中蛋白質(zhì)的降解速率，而五香血藤則可能使瘤胃微生物的脫氨作用被抑制。

MCP是反芻動(dòng)物代謝蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一，可以提供約40%、最多可達(dá)80%的氮源[28]。Dijkstra等[29]研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃原蟲(chóng)可以吞噬細(xì)菌以獲取蛋白質(zhì)源，這種吞噬作用會(huì)造成細(xì)菌數(shù)量減少和MCP產(chǎn)量降低[30]。在本試驗(yàn)中，添加25 mg仙鶴草較不添加中草藥的對(duì)照顯著提高了發(fā)酵液中MCP濃度，而未對(duì)GP和NH3-N濃度造成顯著影響，且各中草藥之間添加也添加仙鶴草時(shí)MCP濃度最高，其GP和NH3-N濃度并無(wú)同樣的突出變化，說(shuō)明添加仙鶴草可能抑制了瘤胃原蟲(chóng)的活性。仙鶴草中富含鞣質(zhì)(又稱(chēng)單寧或單寧酸[31])等多酚化合物[32]。楊凱[33]的研究表明，飼糧中添加26.0 g/kg DM單寧酸可以顯著降低原蟲(chóng)的相對(duì)數(shù)量。Pieiro-Vázquez等[34]指出，縮合單寧能夠降低瘤胃原蟲(chóng)和古細(xì)菌的活性，使瘤胃原蟲(chóng)數(shù)量減少最高達(dá)79%。本試驗(yàn)中添加金銀花未對(duì)發(fā)酵液MCP和NH3-N濃度造成顯著影響，但唐志文等[35]的結(jié)果表明，添加金銀花提取物顯著提高了發(fā)酵液MCP和NH3-N濃度，推測(cè)所得結(jié)果不同可能是由于金銀花添加形式的不同所導(dǎo)致，金銀花提取物中的活性成分含量更高，根據(jù)作者給出的金銀花提取物中綠原酸含量估算，是本試驗(yàn)添加劑量中活性成分含量的2～8倍。

除柴胡和金銀花外，本試驗(yàn)選用的其余5種中草藥對(duì)瘤胃或體外發(fā)酵參數(shù)的影響均未見(jiàn)報(bào)道。

3.2 不同中草藥和添加劑量對(duì)體外發(fā)酵VFA濃度的影響

在反芻動(dòng)物瘤胃中，飼糧碳水化合物被微生物發(fā)酵的主要產(chǎn)物是VFA，其能為動(dòng)物機(jī)體活動(dòng)提供能量，并維持瘤胃功能，還可為微生物合成MCP提供碳架[36]。瘤胃液A/P值可反映飼糧在瘤胃中的發(fā)酵模式，鑒于微生物生長(zhǎng)對(duì)底物的選擇性，A/P值也會(huì)影響MCP的合成以及不同區(qū)系瘤胃微生物(細(xì)菌、原蟲(chóng)等)的群體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響整個(gè)機(jī)體的消化與營(yíng)養(yǎng)代謝，一般來(lái)說(shuō)，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(NSC)在瘤胃中的發(fā)酵率較高，且產(chǎn)生VFA中丙酸比例較高，而結(jié)構(gòu)性碳水化合物(SC)則相反[37]。本試驗(yàn)中，由于發(fā)酵底物相同，不存在瘤胃壁的吸收作用，所以VFA組成的改變是由于改變了微生物活動(dòng)或微生物酶活性。與不添加中草藥的對(duì)照相比，添加20 mg荊芥顯著提高了乙酸、丁酸、TVFA濃度和A/P值，添加15 mg荊芥也顯著提高了乙酸、丁酸和TVFA濃度，結(jié)合其還提高了GP和NH3-N濃度，說(shuō)明荊芥有可能具有促進(jìn)瘤胃微生物發(fā)酵NSC的作用；添加3種劑量的五香血藤均顯著降低了A/P值，添加15、20 mg五香血藤時(shí)還顯著降低了乙酸和TVFA濃度，說(shuō)明添加五香血藤可能會(huì)抑制瘤胃微生物對(duì)NSC的發(fā)酵；添加3種劑量的金銀花均顯著降低了A/P值，添加25 mg金銀花時(shí)還顯著提高了丙酸濃度，而未影響其他指標(biāo)，說(shuō)明添加金銀花改變了瘤胃的發(fā)酵模式，使其更趨向于丙酸型發(fā)酵。黃祥元等[38]研究了金銀花提取物對(duì)肉牛體外發(fā)酵的影響，結(jié)果表明，在發(fā)酵12 h時(shí)隨著添加劑量的增加，A/P值呈顯著線(xiàn)性升高，而在24 h時(shí)各添加劑量組的A/P值與對(duì)照組無(wú)顯著差異。本試驗(yàn)條件下，添加3個(gè)劑量的柴胡對(duì)各VFA濃度均未產(chǎn)生顯著影響，而潘龍等[39]的研究則發(fā)現(xiàn)添加柴胡皂苷可以顯著提高發(fā)酵48 h后TVFA和乙酸濃度，其中0.25 g/kg的添加劑量還顯著提高了GP和丙酸、丁酸濃度，推測(cè)試驗(yàn)結(jié)果的不同可能是由于柴胡的添加形式和發(fā)酵時(shí)間的不同所導(dǎo)致。

除柴胡和金銀花外，本試驗(yàn)選用的其余5種中草藥對(duì)瘤胃或體外發(fā)酵VFA濃度的影響均未見(jiàn)報(bào)道。

3.3 不同中草藥和添加劑量對(duì)體外發(fā)酵H2、CH4和CO2產(chǎn)量的影響

反芻動(dòng)物通過(guò)瘤胃微生物發(fā)酵利用其他動(dòng)物不能利用的纖維素、半纖維素等結(jié)構(gòu)性碳水化合物的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的H2和CO2，瘤胃中的產(chǎn)甲烷菌能夠利用H2和CO2進(jìn)行還原反應(yīng)并生成CH4。H2不僅可以被產(chǎn)甲烷菌消耗合成CH4，還會(huì)被細(xì)菌利用合成VFA[40]。已有研究表明，CH4產(chǎn)量與乙酸濃度呈正相關(guān)，與丙酸濃度呈負(fù)相關(guān)，即丙酸產(chǎn)量增加、A/P值較小的同時(shí)CH4的排放量減少，更有利于動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解與利用[41-42]。CH4產(chǎn)量的減少還可能與抗原蟲(chóng)作用有關(guān)[43]。

本試驗(yàn)中，添加20 mg荊芥雖然促進(jìn)了發(fā)酵，但是較不添加中草藥的對(duì)照顯著增加了H2和CH4產(chǎn)量，且添加25 mg荊芥時(shí)顯著增加了CO2產(chǎn)量，與試驗(yàn)?zāi)康牟环?；與不添加中草藥的對(duì)照相比，添加25 mg野葛根顯著提高了H2產(chǎn)量，未影響其他氣體成分的產(chǎn)量，結(jié)合其還提高了乙酸、丙酸和TVFA濃度，說(shuō)明添加野葛根可能會(huì)促進(jìn)瘤胃微生物發(fā)酵并利用H2合成VFA；與不添加中草藥的對(duì)照相比，添加20 mg金銀花顯著降低了CH4和CO2產(chǎn)量，卻未對(duì)所有其他指標(biāo)產(chǎn)生影響，提示金銀花或許具有抗原蟲(chóng)作用。Kim等[44]用金銀花提取物與瘤胃液孵育的體外試驗(yàn)和定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)物中纖毛蟲(chóng)相關(guān)的產(chǎn)甲烷菌數(shù)量比對(duì)照組顯著降低，而纖維分解菌數(shù)量增加。黃祥元等[38]的體外研究顯示，隨著金銀花提取物添加水平的升高，CH4生成量表現(xiàn)為顯著線(xiàn)性降低，與本試驗(yàn)結(jié)果部分不符。7種中草藥中，仙鶴草使CH4和CO2產(chǎn)量的降低程度最大，添加25 mg仙鶴草顯著降低了CO2產(chǎn)量，但對(duì)CH4產(chǎn)量的降低未與對(duì)照形成統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。劉美[12]用人工瘤胃液為10 mL(瘤胃液與人工唾液比例為1∶9)、底物為100 mg的發(fā)酵體系篩選了100種中草藥的70%乙醇提取物對(duì)體外發(fā)酵CH4產(chǎn)量的影響，百種中草藥中包含有柴胡、荊芥、仙鶴草，但是其研究表明這3種中草藥均未對(duì)CH4產(chǎn)量產(chǎn)生顯著影響，與本試驗(yàn)結(jié)果部分不符。本試驗(yàn)中，添加不同劑量的柴胡、鉤藤和五香血藤均未對(duì)體外發(fā)酵H2、CH4和CO2產(chǎn)量造成顯著影響。

除金銀花、柴胡、荊芥、仙鶴草外，本試驗(yàn)選用的其余3種中草藥對(duì)瘤胃或體外發(fā)酵H2、CH4和CO2產(chǎn)量的影響未見(jiàn)報(bào)道。

4 結(jié) 論

在體外發(fā)酵條件下，添加20 mg金銀花或25 mg仙鶴草于200 mg發(fā)酵底物中具有降低溫室氣體產(chǎn)量的作用，且沒(méi)有對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)造成不良影響。