飼糧中添加不同組合的酸化劑對肉雞腸道微生物菌群、腸道形態(tài)以及胃蛋白酶活性的影響

劉新澤 胡友軍 趙曉南 張瑞陽 朱宇旌 張 勇 李方方**

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學動物科學與醫(yī)學學院，沈陽 110866；2.廣東酸動力生物科技有限公司，清遠 511500)

我國是畜禽養(yǎng)殖大國，同時也是獸用抗菌類藥物生產(chǎn)和使用大國?？咕愃幬镌趧游锛膊》乐巍⑻岣呱a(chǎn)效益、保證畜禽產(chǎn)品安全方面上發(fā)揮了重要的作用，伴隨著生產(chǎn)中的大量使用，更引發(fā)了一系列公共衛(wèi)生問題[1-2]。尋找抗生素有效替代產(chǎn)品尤為關鍵，目前常用的飼用抗生素替代物有益生菌、抗菌肽、植物提取物、酸化劑、寡糖、酶制劑等[3]。酸化劑作為其中一種新型的綠色添加劑在生產(chǎn)中得到了越來越多的應用。酸化劑是指提高飼料酸度，動物采食以后降低消化道的pH，促進胃內(nèi)酶原活化和營養(yǎng)物質的消化，尤其是蛋白質的吸收，改善胃腸道微生物區(qū)系平衡，抑制有害微生物的繁殖，從而達到防病促生長的目的[4-5]。研究表明，飼糧中添加甲酸可顯著提高肉雞生長性能、免疫性能以及改善腸道健康[6]。Khan等[7]報道，飼糧中添加0.3%甲酸銨可提高21日齡肉雞平均日增重。研究表明，植物精油具有提高肉雞生長性能、免疫性能、抗氧化能力、改善腸道菌群以及肉品質等作用，目前植物精油的研究主要集中在生長性能和免疫性能等方面[8]。徐青青[9]和劉柏松等[10]研究表明，在飲水或者飼糧中添加酸化劑可改善肉雞的生長性能及腸道健康狀況[9-10]。因此，本試驗旨在研究不同組合的酸化劑對肉雞腸道微生物菌群、腸道形態(tài)以及胃蛋白酶活性的影響，為改善肉雞胃腸道環(huán)境和消化功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用酸化劑由某生物科技有限公司提供，甲酸甲酸銨復合酸化劑主要成分為甲酸、甲酸銨，有效成分含量≥60%；緩釋甲酸主要成分為甲酸，有效成分含量≥40%，精油主要成分為桉葉素、肉桂醛、香芹酚，有效成分含量≥40%。

1.2 試驗設計

試驗采用單因素完全隨機設計，將1 080只肉雞隨機分為9組，每組6個重復，每個重復20只雞，試驗設計見表1。

表1 試驗設計

1.3 試驗動物及飼養(yǎng)管理

試驗在遼寧春天養(yǎng)殖場進行，選取體況良好的7日齡愛拔益加(AA)肉雞1 080只，初始體重差異不顯著(P>0.05)的前提下，將肉雞按性別和平均體重一致性原則隨機分配到9組中，試驗期42 d。飼養(yǎng)試驗在同一棟雞舍內(nèi)進行，溫度和濕度適宜，并保持良好的通風。按常規(guī)的管理和免疫接種程序進行飼養(yǎng)。試驗期間，肉雞自由采食，充足飲水。

1.4 試驗飼糧

基礎飼糧為參照NRC(2012)營養(yǎng)需要配制的玉米-豆粕型顆粒配合飼料，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.5 指標測定與方法

1.5.1 腸道形態(tài)與腸道微生物菌群

試驗結束時，從每個重復中隨機挑選2只體況健康且體重相近的肉雞，屠宰前正常飼喂，屠宰后收集回腸和盲腸食糜于凍存管中，標記投入液氮中速凍，迅速轉移至-80 ℃超低溫冰箱中待測，測試前需要將樣品從-80 ℃超低溫冰箱中轉移至4 ℃冰箱中解凍，并測定微生物總數(shù)以及乳酸菌、大腸桿菌數(shù)量。具體操作步驟參照孫建華等[11]腸道微生物的測定方法。

剪切3～5 cm的回腸和空腸腸段，使用0.9%生理鹽水緩慢沖洗腸道內(nèi)容物，盡量不要力度過大，以免損壞腸道形態(tài)，小心將其放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上，進行常規(guī)石蠟脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片與烤片、切片脫蠟與水化，用蘇木精-伊紅(HE)染色法進行染色，在倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS CKX53，日本)下觀察拍照，使用IPP 6.0軟件對圖像進行絨毛高度和隱窩深度測量，并計算絨隱比(絨毛高度與隱窩深度的比值，V/C)。

1.5.2 胃食糜pH和蛋白酶活性

肉雞屠宰后，取肌胃和腺胃食糜裝入凍存管中，標記后放入液氮中速凍，立即轉入-20 ℃保存，避免反復凍融。利用酸度計測定肌胃和腺胃食糜的pH變化，利用雙抗體夾心法測定肌胃和腺胃食糜的蛋白酶活性。使用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD)值，通過標準曲線計算蛋白酶活性，試劑盒購于江蘇寶萊生物科技有限公司，按試劑盒說明書進行操作。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行初步整理，采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，當差異顯著時采用Duncan氏法進行多重比較。P<0.05表示差異顯著，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結 果

2.1 不同組合的酸化劑對肉雞腸道微生物菌群的影響

2.1.1 不同組合的酸化劑對肉雞回腸微生物菌群的影響

由表3可知，與對照組相比，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組的回腸大腸桿菌數(shù)量顯著降低(P<0.05)，分別降低了19.28%、15.51%、14.93%；Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組的回腸乳酸桿菌數(shù)量顯著提高(P<0.05)，分別提高了25.44%、18.68%、16.62%。Ⅴ組的回腸微生物總數(shù)顯著低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ組(P<0.05)。

表3 不同組合的酸化劑對肉雞回腸微生物菌群的影響

2.1.2 不同組合的酸化劑對肉雞盲腸微生物菌群的影響

由表4可知，各組之間盲腸大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量無顯著差異(P>0.05)。Ⅴ組的盲腸微生物總數(shù)顯著低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ組(P<0.05)，分別降低了47.72%、29.12%、32.14%、36.18%。

表4 不同組合的酸化劑對肉雞盲腸微生物菌群的影響

2.2 不同組合的酸化劑對肉雞腸道形態(tài)的影響

2.2.1 不同組合的酸化劑對肉雞空腸形態(tài)的影響

由表5和圖1可知，與對照組相比，Ⅲ組的空腸絨毛高度顯著提高(P<0.05)，提高了15.87%；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組的空腸隱窩深度顯著降低(P<0.05)，分別降低了32.87%、19.04%、24.66%、20.63%；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的空腸絨隱比顯著提高(P<0.05)，分別顯著提高了26.24%、40.68%、23.00%。

表5 不同組合的酸化劑對肉雞空腸形態(tài)的影響

圖1 各組空腸切片

2.2.2 不同組合的酸化劑對肉雞回腸形態(tài)的影響

由表6和圖2可知，與對照組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ組的回腸絨毛高度顯著提高(P<0.05)，分別提高了35.29%、23.68%、34.06%、12.82%、15.80%、62.15%。Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ組的回腸絨隱比顯著高于Ⅲ組(P<0.05)。

表6 不同組合的酸化劑對肉雞回腸形態(tài)的影響

圖2 各組回腸切片

2.3 不同組合的酸化劑對肉雞胃食糜pH和胃蛋白酶活性的影響

由表7可知，與對照組相比，其他各組肌胃和腺胃食糜pH均顯著降低(P<0.05)；Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ組腺胃食糜胃蛋白酶活性顯著提高(P<0.05)，分別提高了5.23%、2.91%、11.75%；Ⅱ、Ⅵ、Ⅸ組肌胃食糜胃蛋白酶活性顯著提高(P<0.05)，分別提高了4.38%、16.42%、4.18%。

表7 不同組合的酸化劑對肉雞胃食糜pH和蛋白酶活性的影響

3 討 論

3.1 不同組合的酸化劑對肉雞腸道微生物菌群的影響

家禽的腸道內(nèi)生存著500多種微生物，主要以有益微生物為主，這些有益微生物能夠維持腸道健康、殺滅有害菌[12]。正常情況下，有益微生物數(shù)量和有害微生物數(shù)量保持在一個平衡的狀態(tài)，當有益微生物數(shù)量占有優(yōu)勢時，有益微生物能夠利用寡糖發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，動物腸道內(nèi)的pH降低，大腸桿菌和沙門氏菌的增長便得到了抑制，腸道內(nèi)環(huán)境得到保護，畜禽機體實現(xiàn)健康生長；當有害微生物數(shù)量占有優(yōu)勢時，會抑制畜禽機體生長，引發(fā)疾病[13-14]。孫建華等[11]研究表明，飲水中添加酸化劑促進了肉雞空腸和回腸中乳酸桿菌生長，抑制了空腸和回腸中大腸桿菌繁殖。范覺鑫等[15]研究表明，肉雞飼糧中添加3 kg/t的復合酸化劑顯著增加了盲腸乳酸桿菌數(shù)量。羅四維[16]研究表明，復合酸化劑降低了肉雞盲腸和空腸大腸桿菌數(shù)量。郭志有等[17]研究表明，飼糧和飲水中添加酸化劑可以降低肉雞盲腸大腸桿菌數(shù)量，增加盲腸乳酸桿菌數(shù)量。本試驗的研究結果與孫建華等[11]、范覺鑫等[15]、羅四維[16]、郭志有等[17]研究結果基本一致。本試驗中，飼糧中添加0.1%(甲酸甲酸銨+精油)復合酸化劑可以有效地降低肉雞盲腸和回腸大腸桿菌數(shù)量以及回腸微生物總數(shù)，提高盲腸和回腸乳酸桿菌數(shù)量。

3.2 不同組合的酸化劑對肉雞腸道形態(tài)的影響

腸道屬于動物營養(yǎng)物質消化吸收的重要場所之一，營養(yǎng)物質進入動物體內(nèi)經(jīng)過物理反應過程最終被小腸上皮細胞吸收，動物的消化吸能力可以通過腸道黏膜的發(fā)育情況得以反映。由于小腸絨毛的特殊結構所以更利于營養(yǎng)物質的吸收。當小腸絨毛高度增加時，同時也增加了它與消化道內(nèi)容物的接觸面接，使其加強了對營養(yǎng)物質的消化吸收。小腸絨毛根部上皮下陷至固有層形成的管狀腺體叫做小腸隱窩，由于隱窩底部的上皮細胞不斷地向上分化新的絨毛，所以隱窩深度在一定的程度上可以反映小腸絨毛的更新速度[18]。羅四維[16]研究表明，飼糧添加復合酸化劑可以提高了肉雞21日齡十二指腸和空腸以及42日齡空腸的絨毛高度，降低了21日齡十二指腸的隱窩深度。瞿蕾[19]研究表明，飼糧中添加復合酸化劑可以顯著增加肉雞腸道絨毛高度，但對隱窩深度無顯著影響。王淑琴[20]研究表明，飼糧中添加0.75%的檸檬酸一定程度上增加了肉雞小腸絨毛高度，降低了十二指腸隱窩深度；飼糧中添加1.50%的檸檬酸增加了肉雞回腸的絨毛高度和隱窩深度，降低了十二指腸和空腸絨毛高度和隱窩深度。本試驗結果與羅四維[16]研究結果有一定相似之處；而王淑琴[20]研究為單一檸檬酸，采用的酸化劑與本文試驗采用酸化劑有較大差別，酸化劑的類型不同可能會導致結果的差異。本試驗中，飼糧中添加0.2%甲酸甲酸銨復合酸化劑能有效地降低肉雞空腸絨毛高度，提高空腸絨隱比和回腸絨毛高度，飼糧中添加0.1%(甲酸甲酸銨+精油)復合酸化劑能有效地降低空腸隱窩深度，提高空腸絨隱比。

3.3 不同組合的酸化劑對肉雞胃食糜pH和蛋白酶活性的影響

酸化劑可有效降低消化道pH，李連缺等[21]研究表明，飼糧中添加0.2%檸檬酸和0.2%復合酸能顯著降低飼糧pH，0.2%復合酸組44周齡蛋雞嗉囊、腺胃pH極顯著低于0.2%檸檬酸組和基礎飼糧組，0.2%復合酸組48周齡蛋雞嗉囊、腺胃pH顯著低于0.2%檸檬酸組和基礎飼糧組，表明酸化劑可降低飼糧pH，改善老齡蛋雞消化道內(nèi)環(huán)境，且復合酸的效果優(yōu)于檸檬酸。本研究結果同樣表明飼糧中添加不同組合的酸化劑均顯著降低肌胃和腺胃食糜pH。有研究表明，肉雞腺胃分泌的消化液中不僅含有胃蛋白酶和鹽酸，還含有胃蛋白酶原。胃蛋白酶原是非活性的初級蛋白酶原，其活化成胃蛋白酶的適宜pH為2.0～3.5，當pH大于6.0時，胃蛋白酶失活[22]；腺胃分泌胃液，但是腺胃體積較小，食物在腺胃停留時間較短，所以肌胃是胃液消化作用的主要場所[23]。郭鵬等[24]研究表明，飼糧中添加復合酸化劑能夠降低21日齡肉雞腺胃和肌胃的胃蛋白酶活性，但差異不顯著。冷向軍等[25]研究表明，飼糧中添加0.25%復合酸可以刺激胃蛋白酶分泌，而添加1.5%檸檬酸和0.6%鹽酸無顯著效果；飼糧中添加2.4%的鹽酸嚴重導致了胃蛋白酶分泌降低。本試驗中，飼糧中添加0.1%和0.2%(甲酸甲酸銨+精油)復合酸化劑的腺胃蛋白酶活性結果和添加0.2%緩釋甲酸、0.1%(緩釋甲酸+精油)復合酸化劑的肌胃蛋白酶活性結果與郭鵬等[24]和冷向軍等[25]的研究結果相似。肖芹等[26]研究表明，飼糧中添加不同水平的磷酸可顯著影響42日齡肉雞腺胃和肌胃的胃蛋白酶活性。本試驗研究結果與肖芹等[26]研究結果相似。綜合本試驗結果來看，飼糧中添加0.2%(緩釋甲酸+精油)復合酸化劑可以有效地降低肉雞肌胃和腺胃食糜pH，從而提高腺胃和肌胃的蛋白酶活性，并提高蛋白質的消化率。

4 結 論

飼糧中添加0.1%(甲酸甲酸銨+精油)復合酸化劑提高了肉雞回腸乳酸桿菌數(shù)量、空腸絨隱比和胃蛋白酶活性，降低了空腸隱窩深度和回腸大腸桿菌數(shù)量。本試驗條件下，推薦在肉雞飼糧中添加0.1%(甲酸甲酸銨+精油)復合酸化劑。