小兒呼吸道合胞病毒肺炎風(fēng)熱郁肺證脂類及氨基酸類代謝組學(xué)研究

徐超， 遲磊， 崔振澤

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是嬰幼兒時期呼吸道感染的重要病原之一[1]，輕者僅有上呼吸道癥狀，重者表現(xiàn)為毛細支氣管炎及肺炎，甚至可因呼吸衰竭而死亡[2]。而更值得業(yè)界關(guān)注的是，RSV感染后易發(fā)生反復(fù)喘息，與小兒支氣管哮喘的形成和反復(fù)發(fā)作的關(guān)系最為密切，在哮喘的發(fā)生發(fā)展和加重中被認為是一個重要的危險因子[3-4]。

RSV感染屬于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中小兒外感熱病的范疇，古代醫(yī)家稱之為“風(fēng)溫”“肺熱病”“肺炎喘嗽”。針對RSV感染的反應(yīng)不同，中醫(yī)開展辨證施治，研究資料顯示，風(fēng)熱郁肺證常作為小兒RSV肺炎起初的重要證候。如何利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段科學(xué)全面地闡述這一中醫(yī)證候的本質(zhì)與內(nèi)涵，成為亟需解決的迫切問題。中醫(yī)學(xué)認為證候是對機體在疾病發(fā)展過程中某一階段病因、病理、病機、病位的概括，具有多因素、多層次、整體性的特點[5]。而代謝組學(xué)是運用現(xiàn)代分析技術(shù)獲得內(nèi)源性代謝產(chǎn)物譜以認識機體的整體功能狀態(tài)，具有時相性、動態(tài)性、整體性、系統(tǒng)性等特點，與中醫(yī)證候特點相吻合[6]。基于上述中醫(yī)證候與代謝組學(xué)的相通之處，應(yīng)用現(xiàn)代微觀的代謝組學(xué)技術(shù)研究中醫(yī)宏觀證候本質(zhì)已成為目前中醫(yī)研究的重要手段之一。本研究擬采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)技術(shù)從整體角度探討小兒RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證患兒血清的內(nèi)源性差異代謝特征，闡釋小兒RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證的差異代謝證候?qū)嵸|(zhì)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2017年11月至2018年4月大連市兒童醫(yī)院住院的毛細支氣管炎和(或)肺炎患兒30例，其中男17例，女13例，男女比例1.3∶1，月齡4～24個月，平均(11.37±5.82)個月。同期選取我院健康體檢兒童30例為對照組，其中男18例，女12例，男女比例1.5∶1，月齡2～24個月，平均(10.34±4.78)個月。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南(2013修訂)》中毛細支氣管炎和(或)肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照世界中醫(yī)藥學(xué)會聯(lián)合會兒科分會制定的《小兒病毒性肺炎中醫(yī)診療指南》[8]?！胺窝状浴憋L(fēng)熱郁肺證辨證分型：發(fā)熱惡風(fēng)、咳嗽、氣喘、痰黃或聞喉間痰鳴、有汗、鼻流清涕或黃涕、咽紅腫、口渴欲飲、納呆、面色紅、舌質(zhì)紅、苔薄黃，指紋浮紫。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合毛細支氣管炎和(或)肺炎的中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡2個月至2歲；(3)病程在72 h以內(nèi)；(4)經(jīng)檢測鼻咽部分泌物RSV抗原和(或)檢測血清RSV-IgM陽性者；(5)患兒家屬簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 重癥肺炎及其他呼吸系統(tǒng)疾病。

1.5 檢測方法

1.5.1 試劑與儀器 乙腈(Merck,Germany)；甲酸(Sigma-Aldrich,USA)；超純水由MilliQ系統(tǒng)制備(Millipore，USA)；ACQUITY UPLC BEH C8色譜柱、Waters ACQUITY超高效液相色譜系統(tǒng)(Waters，USA)；AB triple TOFTM 5600質(zhì)譜(Applied Biosystems，USA)。

1.5.2 樣品采集及處理 留取門診體檢健康兒童及入院24 h內(nèi)患兒空腹血清，約2 mL，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。測定前，室溫解凍血清，8 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，加入400 μL純水，渦旋1 min，8 000 r/min再次離心10 min，取上清液即可。

1.5.3 LC-MS代謝組學(xué)分析 (1)液相條件：色譜分離系統(tǒng)采用Waters ACQUITY超高效液相色譜。采用ACQUITY UPLC BEH C8(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色譜柱，柱溫60 ℃，進樣量5 μL。流動相A相和B相分別為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈。洗脫梯度：5%B保持0.5 min，2 min時線性升至60%B，8 min時線性升至100%B，保持2 min，0.1 min內(nèi)回到初始比例5%B以平衡色譜柱，總分析時長12 min。流動相流速為0.4 mL/min。

(2)質(zhì)譜條件：使用AB triple TOFTM 5600質(zhì)譜(Applied Biosystems,USA)作為檢測系統(tǒng)。霧化氣流流速55 psi，輔助加熱氣流流速55 psi；氣簾氣流速35 psi；質(zhì)譜掃描范圍為m/z80～1 000，碰撞電壓10 V；信息依賴型采集(IDA)模式掃描范圍為m/z60～1 000，碰撞電壓40 V。正離子噴霧電壓范圍5.5 kV，離子源溫度550 ℃；負離子噴霧電壓范圍4.5 kV，離子源溫度450 ℃。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Marker View 1.2.1.1軟件(Applied Biosystems,USA)提取離子原始峰表。導(dǎo)出的峰表經(jīng)過濾，用總峰面積進行標(biāo)準(zhǔn)化歸一處理，通過已知代謝物數(shù)據(jù)庫對代謝物進行定性。采用SIMCA-P 11.0軟件(Umetrics)進行多元統(tǒng)計分析，建立主成分分析(principle component analysis，PCA)及正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)數(shù)學(xué)模型，并對相應(yīng)主成分的變量重要性(variable importance in the project，VIP)進行計算，選取VIP值>2的變量，采用SPSS 17.0軟件對其進行非參數(shù)檢驗，同時滿足VIP值>2且P<0.05的物質(zhì)為最終的差異性代謝物。

2 結(jié)果

2.1 RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證患兒樣本代謝輪廓分析及模式識別 采用SIMCA-P軟件首先對樣本數(shù)據(jù)建立非監(jiān)督的PCA分析，得分圖如圖1，圖中橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)分別代表主成分中的第一個和第二個主成分，得分圖反應(yīng)了各個樣本在兩個主成分組成的坐標(biāo)體系中的分布情況，模型參數(shù)R2X=0.722，Q2=0.36，模型分析了72.2%的原始數(shù)據(jù)，由圖1可見，兩組之間存在一定的交叉重疊，分離不明顯。

圖1 正常兒童與RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證患兒的PCA得分圖(黑色代表RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證患兒，灰色代表正常兒童)

進一步建立OPLS-DA模型，如圖2所示，兩組樣本分別集中分布在中線的兩側(cè)，分離趨勢明顯，說明兩組在代謝產(chǎn)物方面具有一定的差異。響應(yīng)置換檢驗(permutation test)參數(shù)：R2Y=0.86，Q2=0.649，以上數(shù)據(jù)說明數(shù)學(xué)模型可靠穩(wěn)定。

2.2 RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證患兒差異代謝產(chǎn)物分析結(jié)果 基于有效OPLS-DA模型下篩選出有差異代謝產(chǎn)物，獲得S-Plot示意圖(圖3)，圖3顯示了代謝產(chǎn)物的分布情況，偏離中心越遠的產(chǎn)物，表明該變量對模型的貢獻越大，成為差異性代謝產(chǎn)物的可能性也就越大。其次，計算OPLS-DA模型中的變量VIP值(圖4)提取VIP值>2的變量，并進行t檢驗(表1)，共篩選出5個RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證的差異代謝物(P<0.05)，兩組的差異代謝物相對含量見圖5。分別為：苯丙氨酸(phenylalanine，Phe);色氨酸(tryptophan，Try);磷脂酰膽堿(34∶3)(phosphatidylcholine 34∶3，PC 34∶3)；2個鞘磷脂(sphingomyelin,SM)，包括SM36∶1，SM34∶0。

圖2 正常兒童與RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證患兒的OPLS-DA得分圖(黑色代表RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證患兒，灰色代表正常兒童)

圖3 基于OPLS-DA分析的S-PLOT圖

圖4 基于OPLS-DA分析的VIP圖

圖5 兩組兒童差異代謝產(chǎn)物的相對含量(黑色代表RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證患兒，灰色代表正常兒童)

表1 兩組兒童差異代謝產(chǎn)物的VIP值、t值及變化趨勢

3 討論

謝玉瓊的《麻科活人全書》對“肺炎喘嗽”進行首次描述：“氣促之證，多緣肺熱不清所致……如肺炎喘嗽?！逼渲小胺巍敝覆∥?，“炎”指病性即肺臟熱盛，“喘”和“嗽”則指臨床癥狀和體征?！端貑枴ねㄔu虛實論》曰：“乳子中風(fēng)熱，喘鳴肩息者……”，一方面描述出嬰兒喘鳴癥狀與病毒性感染所引起的吸氣性三凹征等喘憋性肺炎極為相似；另一方面引出病因即風(fēng)熱，推測小兒肺炎喘嗽多為熱證?！安卣撸加谏辖埂钡拿枋?，揭示出在嬰幼兒時期的肺臟是較易患相關(guān)感染性疾病的。肺為華蓋，又屬嬌臟，易最先受邪，加之小兒“肺常不足”，素體“陽常有余”，故肺部受邪后導(dǎo)致肺氣不宣，淸肅不行，出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、喘促等癥狀，且外感易于熱或外感寒邪速入里化熱，則易發(fā)為風(fēng)熱郁肺證。

筆者基于LC-MS技術(shù)的代謝組學(xué)平臺分析范圍廣、靈敏性高，可全面地表征RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證患兒血清代謝組的特異性變化，為進一步探討小兒RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證的發(fā)病機制及與哮喘的相關(guān)性提供參考依據(jù)。本研究采用LC-MS技術(shù)檢測風(fēng)熱郁肺證肺炎與正常兒童的血清代謝物后發(fā)現(xiàn)，風(fēng)熱郁肺證肺炎與正常兒童的代謝譜存在顯著差異，部分差異代謝物結(jié)構(gòu)已經(jīng)確認，主要有脂類物質(zhì)(PC 34∶3、SM36∶1、SM34∶0)和氨基酸類(Phe-Phe、Tryptophan)，其中磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC 34∶3)和苯丙氨酸(Phe-Phe)明顯低于正常兒童，鞘磷脂(SM36∶1、SM34∶0)和色氨酸(Tryptophan)明顯高于正常兒童，均有統(tǒng)計學(xué)意義。

從上述結(jié)果可見，風(fēng)熱郁肺證RSV肺炎患兒血清異常代謝物的脂類物質(zhì)主要是甘油磷脂代謝途徑的磷脂酰膽堿和鞘脂代謝途徑的鞘磷脂，與文獻報道一致，即脂肪酸的代謝直接或間接與熱證相關(guān)聯(lián)[9]。磷脂酰膽堿是肺泡表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant，PS)的最主要成分，而PS又具有先天免疫功能，有助于肺部感染的預(yù)防和炎癥控制[10]，而RSV感染所引起的炎癥和免疫反應(yīng)亦與PS的變化有關(guān)[11]，表面活性磷脂促進病毒進入宿主細胞，同時又具有抗病毒感染作用，可通過阻礙病毒配體與細胞表面受體結(jié)合以破壞細胞膜間的作用[12]。由此可以表明RSV肺炎易感原因之一，即機體的甘油磷脂代謝紊亂，磷脂酰膽堿含量降低，進而導(dǎo)致機體免疫功能減弱，抗病毒能力降低，從而易感。本實驗結(jié)果顯示RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證患兒血清中鞘磷脂(SM36∶1、SM34∶0)含量呈上升趨勢，這一現(xiàn)象表明RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證患兒鞘脂代謝也受到了擾亂。首先，鞘磷脂類及其代謝產(chǎn)物參與了多種信號傳導(dǎo)通路，在諸多病理過程中發(fā)揮重要作用，部分化合物的異常會導(dǎo)致一系列的效應(yīng)，引起過敏和炎癥[13]。其次，富含鞘磷脂的特殊膜結(jié)構(gòu)脂筏是多種病毒復(fù)制過程中的重要因素，如病毒入胞、胞內(nèi)定向轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)運病毒蛋白等[14]，RSV感染時脂筏主要與病毒顆粒的釋放有關(guān)[15]。由此揭示了RSV肺炎機體鞘磷脂代謝與RSV復(fù)制及病毒顆粒釋放有關(guān)，可能呈現(xiàn)正相關(guān)的趨勢。

本實驗結(jié)果顯示，RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證患兒機體不僅存在脂類代謝異常，氨基酸代謝也出現(xiàn)了異常的紊亂，即苯丙氨酸含量降低、色氨酸含量升高。氨基酸在許多物質(zhì)代謝通路中起重要作用，它們不僅是重要的酶底物，也是重要的調(diào)節(jié)物，蘊含著重要的反映機體代謝和功能狀態(tài)的生物化學(xué)信息[16]。任何一種氨基酸的缺失都會影響免疫系統(tǒng)和其他器官功能的正常發(fā)揮[17]。研究表明，苯丙氨酸在體內(nèi)氧化生成酪氨酸，酪氨酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨基作用最終代謝成延胡索酸和乙酰乙酸，兩者均是含有苯環(huán)。且苯丙氨酸是一種必需氨基酸，這些含苯基的化合物主要經(jīng)由腸道內(nèi)的菌群代謝產(chǎn)生，即苯丙氨酸的代謝與腸道菌群代謝具有一定的相關(guān)性[18]。前期基礎(chǔ)實驗也表明，RSV感染會影響大鼠機體內(nèi)的菌群代謝[19]。綜上筆者推測，RSV感染是由于干擾了腸道的正常菌群代謝，使苯丙氨酸生成減少。色氨酸也是人體的必需氨基酸之一，在代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起重要作用，研究表明，色氨酸代謝主要發(fā)生于炎癥組織中[20]，被吲哚胺2,3-雙加氧酶誘導(dǎo)的色氨酸降解是有效的抗病毒途徑[21]。本研究結(jié)果顯示，RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證患兒血清中色氨酸含量升高，提示病程初期RSV病毒的復(fù)制增多與色氨酸含量高，沒被降解有關(guān)。另一方面色氨酸代謝還具有免疫調(diào)節(jié)作用，是T細胞活化增殖過程中合成蛋白質(zhì)所必需的氨基酸，即氨基酸的增多可促進T細胞的活化，誘導(dǎo)免疫級聯(lián)反應(yīng)，從而加重炎癥反應(yīng)[22]，進一步揭示了RSV肺炎病情嚴(yán)重可能與色氨酸升高有關(guān)。

綜上所述，本實驗基于GC-MS技術(shù)對RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證患兒的血清進行研究，利用OPLS-DA的方法探討血清內(nèi)源性代謝物的模式變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了與RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證密切相關(guān)的多種代謝物。但也存在一定的局限性，本研究僅觀察了發(fā)現(xiàn)集，發(fā)現(xiàn)RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證患兒的血清中磷脂酰膽堿、鞘磷脂、苯丙氨酸、色氨酸發(fā)生了明顯的變化。下一步研究考慮對驗證集的觀察，以驗證RSV肺炎風(fēng)熱郁肺證的代謝標(biāo)志物，為中醫(yī)證候的客觀性提供了實驗依據(jù)。