LPS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞促炎癥因子基因表達(dá)的影響

宋金婷，張金友，*，莊雨龍，李 偉，宋偉紅，李長(zhǎng)志

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150038）

乳腺炎是奶牛主要傳染性疾病之一，嚴(yán)重影響產(chǎn)奶量和牛奶質(zhì)量。乳腺炎會(huì)破壞牛奶合成組織，導(dǎo)致產(chǎn)奶量減少和牛奶成分改變。根據(jù)疾病的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度，受感染奶牛的生產(chǎn)性能可能會(huì)在哺乳周期的剩余時(shí)間內(nèi)下降［1］。研究表明，乳腺上皮細(xì)胞除了具有乳汁合成和分泌的功能之外，還在先天性免疫防御過程中發(fā)揮著不可替代的作用。先天免疫系統(tǒng)被認(rèn)為是機(jī)體對(duì)抗感染的第一道防線，在受到感染的早期階段能夠及時(shí)作出免疫識(shí)別和反應(yīng)［2］。在奶牛乳腺中，先天性免疫主要采取的是非特異性防御機(jī)制，包括乳頭孔封閉、吞噬細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）、可溶性因子（如乳鐵蛋白和細(xì)胞因子）等免疫防御方式。當(dāng)機(jī)體受到感染，在先天性免疫機(jī)制無法滿足抵御病原體入侵需要的情況下，機(jī)體才會(huì)激活并啟動(dòng)第二個(gè)層級(jí)的防御機(jī)制，即獲得性免疫防御機(jī)制，從而產(chǎn)生特異性抗體以便清除病原體［3］。盡管如此，在奶牛的乳腺組織受到病原體入侵而感染時(shí)，非特異性的先天免疫機(jī)制卻是處于優(yōu)勢(shì)地位的防御機(jī)制，對(duì)應(yīng)對(duì)初期感染發(fā)揮著重要作用。先天免疫系統(tǒng)對(duì)大量病原體的固有反應(yīng)能力是由其識(shí)別多種病原體共有的高度保守序列所介導(dǎo)的。這些序列通常被稱為病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），包括一些細(xì)菌細(xì)胞壁成分，如脂多糖（LPS）、肽聚糖和脂磷壁酸［4］。

已有的研究證實(shí)，乳腺上皮細(xì)胞在受到感染后，具有大量合成多種促炎癥因子和乳鐵蛋白等先天性免疫物質(zhì)的能力。比如，泌乳期奶牛的乳腺組織受到LPS的刺激后會(huì)大量合成白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）［5］。在感染后的6 h內(nèi)，乳腺細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）表達(dá)量的大量增加主要來自于乳腺上皮細(xì)胞［6］。相似的研究同樣證實(shí)，LPS刺激乳腺上皮細(xì)胞后，會(huì)讓后者產(chǎn)生大量LF、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）和TNF-α［7-8］。這些證據(jù)表明，在乳腺感染初期先天免疫反應(yīng)發(fā)揮了重要作用。因此，更好地了解與細(xì)菌入侵的最初識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的介質(zhì)，將有助于制訂調(diào)節(jié)和提高與奶牛乳腺防御和抗感染能力有關(guān)的策略。為了研究和發(fā)現(xiàn)更多的乳腺上皮細(xì)胞感染信號(hào)、了解LPS與奶牛乳腺上皮細(xì)胞部分促炎癥因子基因表達(dá)量之間的關(guān)系，也為進(jìn)一步研究影響乳腺上皮細(xì)胞免疫反應(yīng)的機(jī)制提供基礎(chǔ)性依據(jù)，進(jìn)行了LPS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞促炎癥因子基因表達(dá)的影響試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

乳腺組織，采自哈爾濱地區(qū)屠宰企業(yè)新鮮宰殺的泌乳期荷斯坦奶牛的健康乳腺。

1.2 主要試劑和儀器

青霉素，購(gòu)自哈藥集團(tuán)有限公司；硫酸鏈霉素，購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；β-酪蛋白抗體，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；抗熒光淬滅封片劑和DAPI，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；無糖DMEM、高糖DMEM和鼠尾膠原，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DMEM／F12、BODIPY493／503、Ⅰ型膠原酶和TRIzol，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶，購(gòu)自以色列BioInd公司；胰島素、氫化可的松、催乳素和LPS，購(gòu)自西格瑪奧德里奇（Sigma-Aldrich）（上海）貿(mào)易有限公司；角蛋白18抗體和β-actin抗體，購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公 司；Prime Script?RT reagent Kit和SYBR?Premix ExTaqTM，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo Forma公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡、正置熒光顯微鏡，均為L(zhǎng)eica公司產(chǎn)品；PCR儀，Eppendoff公司產(chǎn)品。以上儀器、設(shè)備均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞與遺傳工程黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 乳腺上皮細(xì)胞的分離與純化

奶牛乳腺上皮細(xì)胞分離、純化方法詳見前期報(bào)道［9］，簡(jiǎn)要操作流程：乳腺組織→75%乙醇清洗2次→用含雙抗的D-Hank’s溶液清洗3次→剔除多余組織→氟康唑注射液清洗3次→用含有雙抗的D-Hank’s溶液清洗4次→剪碎成1 mm3左右的組織塊→用不含雙抗的D-Hank’s溶液清洗3次→放入膠原酶消化液中→37℃消化2～3 h，至形成組織混濁液→濾網(wǎng)過濾→收集濾液并離心→棄去上清液，向沉淀加入DMEM／F12吹打混勻，離心→重復(fù)前一步驟→第3次離心后棄去上清液→向沉淀中加入含有10%FBS的DMEM／F12培養(yǎng)液→將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)皿→37℃、5%CO2培養(yǎng)至80%鋪滿→進(jìn)行細(xì)胞差異性貼壁純化操作［9］。

1.4 乳腺上皮細(xì)胞的鑒定

乳腺上皮細(xì)胞的鑒定方法詳見參考文獻(xiàn)［9］。簡(jiǎn)要步驟：細(xì)胞爬片→甲醇固定→PBS清洗→用含5%牛血清白蛋白（BSA）的TBST（Tris buffered saline with tween）封閉→角蛋白18抗體孵育過夜→TBST溶液清洗→山羊抗兔二抗孵育→TBST清洗細(xì)胞→PI溶液避光孵育→TBST清洗，加抗熒光淬滅封片劑→共聚焦顯微鏡觀察。

1.5 乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與處理

經(jīng)過純化的乳腺上皮細(xì)胞分成兩組進(jìn)行葡萄糖饑餓培養(yǎng)1 h［9］；棄去培養(yǎng)液，在對(duì)照組細(xì)胞中加入含有0.5 mg／mL葡萄糖的完全培養(yǎng)液［9］繼續(xù)培養(yǎng)，在處理組細(xì)胞中加入含有0.5 mg／mL葡萄糖 +1 g／mL LPS（LPS組）的完全培養(yǎng)液［9］繼續(xù)培養(yǎng)；兩組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，收集細(xì)胞提取RNA，用于檢測(cè)相關(guān)基因mRNA表達(dá)量，包括TNF-α、IL-6、LF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）和IL-8。

1.6 引物的設(shè)計(jì)與合成

在GenBank上查詢牛TNF-α、IL-6、LF、TGFβ1、iNOS和IL-8基因登錄號(hào)、序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1。經(jīng)過BLAST同源性分析，確定引物的專一性。

表1 引物信息Tab.1 Primer information bp

1.7 熒光定量PCR

提取總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系參見表2。反應(yīng)條件為37℃15 min，85℃5 s。

表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系 Tab.2 Reverse transcription reaction system μL

實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系參見表3。擴(kuò)增程序詳見參考文獻(xiàn)［9］。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系Tab.3 Real time fluorescence quantitative PCR amplification system μL

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 23.0軟件中的Indendent-Samples t檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

試驗(yàn)采用差速貼壁法對(duì)乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行純化處理，經(jīng)純化后的乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)為卵圓形，呈典型的鋪路石樣貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)；在標(biāo)志性蛋白鑒定方面，經(jīng)過細(xì)胞免疫熒光染色法檢測(cè)后顯示，絕大部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光表達(dá)陽(yáng)性，即角蛋白18陽(yáng)性［10］。說明試驗(yàn)得到了純度較高的原代乳腺上皮細(xì)胞。見圖1。

圖1 乳腺上皮細(xì)胞鑒定Fig.1 Identification of mammary epithelial cells

2.2 LPS對(duì)IL-8、TGF-β1和IL-6基因mRNA表達(dá)量的影響

采用熒光定量PCR對(duì)添加和不添加LPS的培養(yǎng)體系中乳腺上皮細(xì)胞的TGF-β1、IL-6和IL-8基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，LPS組TGF-β1基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量沒有顯著提高（P＞0.05），乳腺上皮細(xì)胞中IL-6和IL-8基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）提高。

2.3 LPS對(duì)TNF-α、LF和iNOS基因mRNA表達(dá)量的影響

采用熒光定量PCR對(duì)添加和不添加LPS的培養(yǎng)體系中乳腺上皮細(xì)胞的TNF-α、LF和iNOS基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，LPS組TNF-α和iNOS基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著提高（P＜0.01），LF基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高（P＜0.05）。

圖2 LPS對(duì)IL-8、TGF-β1和IL-6基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of LPSon mRNA expression of IL-8，TGF-β1 and IL-6

3 討論

TGF-β1可以抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和胸腺細(xì)胞生長(zhǎng)［11-12］。TGF-β1缺陷的小鼠在新生兒期會(huì)出現(xiàn)明顯的急性炎癥反應(yīng)［13］。在本試驗(yàn)中加入LPS刺激細(xì)胞后，其TGF-β1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量并沒有發(fā)生明顯變化，這可能是保證乳腺細(xì)胞在感染后可以迅速啟動(dòng)免疫機(jī)制的原因之一。

圖3 LPS對(duì)iNOS、TNF-α和LF基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of LPSon mRNA expression of iNOS，TNF-αand LF

作為TNF／TNFR細(xì)胞因子超家族成員之一，TNF-α能夠參與維持機(jī)體的免疫系統(tǒng)和防御機(jī)制。目前已知乳腺中TNF-α主要由乳腺上皮細(xì)胞合成，而且它還是中性粒細(xì)胞激活因子，因此TNF-α也是抵御乳房感染的重要細(xì)胞因子［14-15］。乳鐵蛋白是一種單體糖蛋白，具有殺菌活性。乳腺上皮細(xì)胞可以合成乳鐵蛋白，另外在受到感染的乳腺組織中也可由中性粒細(xì)胞合成并釋放乳鐵蛋白［15-17］。研究表明，如果動(dòng)物擁有特定乳鐵蛋白基因型，那么它的臨床乳腺炎發(fā)病率會(huì)相對(duì)較低［18］。在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中，iNOS可以結(jié)合鈣調(diào)素，釋放出一氧化氮（NO）。后者作為免疫防御物質(zhì)，在抵御感染過程中發(fā)揮作用［19］。由于激活iNOS基因的啟動(dòng)子是依賴于Ⅰ干擾素調(diào)節(jié)因子1（RF1）和核因子κB（NFκB）的，因此可以認(rèn)為iNOS基因的轉(zhuǎn)錄是基于炎癥介導(dǎo)過程的［20］。由此可知，被感染后的乳腺上皮細(xì)胞可以大量合成iNOS，參與抵御病菌［21-22］。當(dāng)機(jī)體受到感染后，包括NF-κB在內(nèi)的一系列信號(hào)通路被激活，刺激了IL-6的轉(zhuǎn)錄水平，提高了這種炎癥細(xì)胞因子的合成能力［23］。參與先天免疫應(yīng)答的細(xì)胞可以合成并分泌中性粒細(xì)胞趨化因子IL-8，該因子具有誘導(dǎo)很多靶細(xì)胞（比如中性粒細(xì)胞和其他粒細(xì)胞）趨化行為的功能，并誘導(dǎo)這些細(xì)胞向受到感染的部位遷移。很多研究已經(jīng)證實(shí)，作為促炎癥因子，IL-6和IL-8在乳腺上皮細(xì)胞受到炎癥刺激后表達(dá)量顯著提高［22，24-25］。此外，在多個(gè)乳腺上皮細(xì)胞體外炎癥模型中，也檢測(cè)到了TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8基因的表達(dá)［26-28］。在本試驗(yàn)中，乳腺細(xì)胞被LPS刺激后iNOS、LF、TNF-α、IL-8和IL-6基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比均明顯提高。由此可知，乳腺上皮細(xì)胞作為乳腺先天性免疫防御的重要屏障，在乳腺受到感染后通過大量產(chǎn)生免疫因子和促炎癥因子等物質(zhì)在免疫識(shí)別和信號(hào)傳遞等方面發(fā)揮著不可或缺的防御作用。

盡管如此，在奶牛產(chǎn)后的一段時(shí)間內(nèi)乳腺炎的發(fā)病率相對(duì)較高。而這種生理性的代謝變化是如何影響奶牛的免疫反應(yīng)能力，從而增加奶牛乳腺炎發(fā)病率的具體機(jī)制仍未明確。因此，對(duì)這個(gè)問題的深入研究對(duì)理解奶牛乳腺免疫防御機(jī)制和制訂抗感染策略等方面具有重要的理論和實(shí)踐意義。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，乳腺上皮細(xì)胞受到LPS刺激后可以通過大量產(chǎn)生iNOS、LF、TNF-α、IL-8和IL-6，迅速啟動(dòng)先天性免疫防御機(jī)制以抵抗病菌的入侵。