哺乳動物種間嵌合體的研究進展

張景瑤，閆鑫鵬，高 帥，張 魯*

（1.中國農業(yè)大學 動物科學技術學院，北京 100193；2.烏蘭察布市畜牧工作站，內蒙古烏蘭察布 012000）

在希臘神話中，嵌合體（chimera）是一種可怕的噴火野獸，有獅子的頭部，山羊的身體和蛇的尾巴。在現代生物科學中，嵌合體是由來自不同生物體的細胞組成的生物，是極具價值的基礎生物學研究工具。可移植器官的短缺阻礙了器官衰竭的治療，每年有數以萬計的患者在等待器官移植期間死亡，而種間嵌合體的研究將為再生醫(yī)學開辟新的機會，促進人類疾病建模和大型動物體內的人體器官生成。

1 關于種間嵌合體的早期研究

嵌合體是指人工地將兩個或兩個以上具有不同遺傳性狀的早期胚胎，或者把具有特種遺傳性狀的細胞和早期胚胎聚合或顯微注射所產生的生物。嵌合體不同于雜種（由不同物種之間的繁殖產生的后代）和鑲嵌體（帶有從相同合子起源的遺傳細胞不同的動物）。根據細胞系分別來自相同物種還是不同物種，嵌合體可以分為種內或種間嵌合體。

關于哺乳動物種間嵌合體的研究最早起源于20世紀70年代。1973年，R.L.Gardner等第一次嘗試用大鼠和小鼠的胚胎獲得種間嵌合體，利用這一嵌合體作為研究哺乳動物胚胎發(fā)育過程中細胞譜系和細胞命運的工具。當將大鼠內細胞（inner cell mass，ICM）注入小鼠囊胚并移植入小鼠子宮后，可以用物種特異性抗體在胚胎切片中觀察到大鼠來源細胞的分布；但是隨著發(fā)育的進行，嵌合體中來自大鼠的細胞所占比例越來越少。這種細胞的損失尚不清楚；但有人認為，兩個物種之間不同的發(fā)育速度可能是導致大鼠細胞難以繼續(xù)增殖的原因。J.Rossant等在進一步的研究中，通過將卡氏小鼠（Mus caroli）的ICM注入小家鼠（Mus musculus）的囊胚，獲得了由小家鼠與卡氏小鼠這兩種不同種的嚙齒動物細胞構成的種間嵌合體囊胚。將卡氏小鼠的囊胚注射入小家鼠子宮內時囊胚無法植入和存活；而且種間嵌合體的植入成功與否取決于滋養(yǎng)外胚層（trophectoderm，TE）細胞與母體子宮的物種起源是否匹配；除此之外，通過將卡氏小鼠的ICM與小家鼠TE重構的嵌合體囊胚注射入小家鼠子宮，首次得到可存活的哺乳動物種間嵌合體。由于種間嵌合體的ICM和TE來源于不同種小鼠，于是利用DNA-DNA原位雜交和兩個物種之間衛(wèi)星DNA的差異，分別描述了成年嵌合體不同組織中源自ICM 和TE的部分。因此，種間嵌合體的實現為研究細胞譜系提供了有效的模型系統(tǒng)。

在嚙齒動物種間嵌合體培育成功之后，還產生了其他的種間嵌合體，第一個山羊-綿羊嵌合體由C.B.Fehilly等在20世紀80年代培育，在1990年誕生了第一個婆羅門牛與家牛的種間嵌合體。反芻動物種間嵌合體的培育結果與嚙齒動物相似，同樣表明只有TE和子宮來自同一物種，種間嵌合體胚胎才能正常著床和發(fā)育。并且雖然誕生的山羊-綿羊嵌合體后代的表型是山羊和綿羊的混合特征，但與胚胎的宿主物種更為相似?？偠灾?，這些早期研究為了解胚胎發(fā)育過程中物種間的保守與不同打下了良好的基礎。

2 干細胞與種間嵌合體

隨著干細胞技術的發(fā)展，科研人員從早期胚胎的ICM中獲得了胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES細胞），通過細胞重編程從分化的細胞獲得了誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPS細胞）。得益于這兩種多能性干細胞（pluripotent stem cell，PS細胞）的產生，人們有了更高效地產生嵌合體的材料，這也重新激起了種間嵌合體的研究熱潮。

2008年，研究人員通過將姬鼠的ES細胞注射入小家鼠的囊胚，獲得了首個由多能干細胞構成的種間嵌合體，在嵌合體小鼠的所有主要器官（包括生殖細胞）中，姬鼠的細胞都占很大的比例（在某些組織中達到40%）。并且姬鼠與小家鼠嵌合體在眼睛大小及跳躍性等表型上顯示出介于兩個物種之間的中間特征。小鼠ES細胞培養(yǎng)條件的改進最終促成了具有生殖能力的大鼠ES細胞的生成。同在2008年，Ying Q.L.等通過改善培養(yǎng)條件，獲得了具有自我更新、自我復制能力的真正的大鼠ES細胞，并描述了干細胞多能性的基態(tài)（ground state）。T.Kobayashi等通過將大鼠PS細胞注射到小鼠囊胚中，并將小鼠PS細胞注射到大鼠囊胚中，成功獲得了成年的小鼠-大鼠種間嵌合體，且嵌合體的功能性胰腺完全由大鼠PS細胞發(fā)育而來，證明了種間囊胚互補產生異種器官的可行性。首先，在研究中發(fā)現小鼠-大鼠種間嵌合體的生成效率（胚胎發(fā)育率和嵌合度）低于種內嵌合體。其次，研究人員發(fā)現注射PS細胞的嵌合率要高于注射ICM，而PS細胞在發(fā)育后期的嵌合體胚胎中占比更高，這表明大鼠PS細胞可能比ICM更具有生長優(yōu)勢，而這可能是由于體外培養(yǎng)恢復了細胞的多能性。第三，除異種PS細胞在嵌合體中占比非常高的情況外，通常由大鼠代孕的嵌合體大小與大鼠相同，而由小鼠代孕的嵌合體大小與小鼠相同，這解釋了為何異種PS細胞占比過多常常導致形態(tài)異常及胚胎致死。第四，異種細胞在不同器官組織的嵌合效率似乎存在物種偏好。研究人員在大鼠囊胚來源的嵌合體肝臟中檢測到高百分比的小鼠CD45細胞，但在小鼠囊胚來源的嵌合體胎兒中很少檢測到大鼠CD45細胞。但該觀察結果僅限于種間嵌合體，因為相同的大鼠PS細胞系在種內嵌合體胎兒肝臟的CD45細胞中有很高的占比。最后，在該研究中還發(fā)現，小鼠-大鼠嵌合體胎兒中膽囊的存在與否（小鼠體內有膽囊，而大鼠沒有），似乎是由囊胚所屬物種決定的，這表明供體PS細胞的發(fā)育分化受宿主發(fā)育程序的調控，而這些發(fā)育程序會驅動器官的發(fā)生。

而在之后的研究中，Wu J.等發(fā)現，大鼠PS細胞可能參與了種間嵌合體膽囊的發(fā)育。在嵌合體的膽囊中檢測到大鼠細胞的存在，這表明小鼠胚胎微環(huán)境能夠解鎖大鼠細胞的膽囊發(fā)育程序，而該程序在大鼠發(fā)育過程中通常受到抑制。但小鼠囊胚來源的嵌合體中大鼠PS細胞的高占比是否會干擾小鼠膽囊的發(fā)育仍是一個未解決的問題。除此之外，他們通過將大鼠ES細胞及可以分化為生殖細胞的iPS細胞注射到豬囊胚中，并將嵌合體囊胚注射到受體母豬子宮中，發(fā)現雖然嚙齒動物原始態(tài)（na?ve，具有植入前胚胎特征）的PS細胞可以形成嚙齒動物間特異的種間嵌合體，但這些細胞無法形成正常發(fā)育的大鼠-豬種間嵌合體胚胎。而將人類的PS細胞移植到豬胚胎中可以形成嵌合體（盡管嵌合效率非常低），但將人的PS細胞移植到嚙齒動物胚胎中時無法獲得嵌合體，這說明進化距離對于產生種間嵌合體的重要性。同時該理論也使科學家首次成功培育出人-豬嵌合體胚胎，并在豬體內發(fā)育了21～28 d的時間。

2019年，通過分別培養(yǎng)三種狀態(tài)：始發(fā)態(tài)（primed，具有植入后胚胎特征）PS細胞、中間態(tài)（intermediate，特征介于植入前與植入后胚胎之間）PS細胞以及原始態(tài)（na?ve）PS細胞，篩選用于嵌合體的最佳多能性干細胞。并通過優(yōu)化干細胞培養(yǎng)和嵌合體系，增強食蟹猴胚胎干細胞的抗凋亡能力，從而改善嵌合胚胎的發(fā)育，最終成功獲得了兩個食蟹猴-豬嵌合體，這也是科學家首次獲得靈長類與豬的活體嵌合體。而在2021年，科學家首次獲得了人-猴嵌合體。人的ES細胞可以嵌合入食蟹猴胚胎，并且可以進入原腸運動，表達中、內胚層的標記基因。但人的ES細胞很難在食蟹猴胚胎中分化為TE細胞，而較容易分化為上胚層細胞，這一發(fā)現與之前的人-鼠嵌合體試驗不同。通過進一步結合單細胞轉錄組測序（single cell RNA sequencing，scRNA-Seq）技術，研究人員發(fā)現，隨著胚胎的發(fā)育，人ES細胞的表達狀態(tài)與受體食蟹猴胚胎細胞越來越相似，并且細胞之間的互作也增強了。這些互作涉及到PI3K-Akt和MAPK等信號通路，且人ES細胞在種間嵌合體胚胎中的發(fā)育進程減緩可能也與這些通路相關。

由于PS細胞的來源有限，研究人員嘗試用分化能力更有限的干細胞／祖細胞形成種間嵌合體。通過將由PS細胞分化而來的大鼠和人類神經嵴細胞移植到小鼠E8.5胚胎中，成功獲得了活的種間神經嵴嵌合體。并且成年嵌合體小鼠出現有色毛發(fā)，說明供體細胞能夠分化為功能性黑素細胞。研究人員還將人類神經干細胞移植到大鼠胚胎中，產生了種間嵌合大腦。而利用囊胚互補技術，在大動物體內產生了外源性器官。胰腺發(fā)育障礙的豬囊胚用同種異體卵裂球進行補充，產生的成年豬嵌合體擁有完全來自供體的胰腺。得益于這些前期工作，目前科學家已經成功在大動物體內培育了人源的內皮細胞及肌肉組織。

3 異種干細胞與宿主囊胚嵌合度的影響因素

3.1 供體細胞與宿主組織發(fā)育階段是否相匹配

供體細胞移植到發(fā)育階段匹配的宿主組織中對于成功嵌合至關重要。小鼠胚胎干細胞能夠在囊胚注射后繼續(xù)發(fā)育，但不能嵌合于植入后的胚胎上胚層。相反，盡管小鼠上胚層來源干細胞（epiblast stem cell，EpiS細胞）在生產囊胚嵌合體方面效率低下，但在將它們移植到小鼠E7.5胚胎的上胚層時很容易產生嵌合體。并且能夠增殖分化成三個胚層及原始生殖細胞，但不能有效地整合到E8.5胚胎中，這是由于該階段胚胎的多能性已經喪失。

3.2 是否為供體細胞提供選擇優(yōu)勢

首先，如果宿主細胞經過遺傳修飾，損害或阻止了某些細胞譜系的發(fā)育，則受體位置只能由供體細胞增殖分化形成，并且功能由供體細胞物種決定，這可以幫助提高該位置供體細胞的嵌合率。例如將造血干細胞在移植到接受致命照射的受者體內后能夠同時保留自我更新和多譜系分化能力，將ES及iPS細胞產生的原始生殖樣細胞注射入缺乏內源性生殖細胞的小鼠睪丸內，可以分化為精子。值得注意的是，Wu J.等利用CRISPR-Cas9技術編輯宿主胚胎以阻止目標器官的形成，此舉更加快速、便捷地實現了不同物種間的囊胚互補，并且這項技術可以用于多譜系互補。

其次，改變受體組織的狀態(tài)，創(chuàng)造有利于供體細胞存活生長的環(huán)境。H.Masaki等發(fā)現，來源于上胚層的EpiS細胞能夠產生囊胚嵌合體，是由于它們對注入囊胚后的細胞死亡具有抗性。進一步研究發(fā)現，過表達抗凋亡蛋白BCL2的EpiS細胞能夠整合入小鼠囊胚并有助于嵌合小鼠的產生。并且過表達BCL2的SOX17內胚層祖細胞能夠嵌合入囊胚中，但僅存在于成年嵌合體小鼠的腸道組織。這些結果表明，抑制凋亡能夠促進供體PS細胞在植入前胚胎中的存活，并且可以提高囊胚嵌合體與供體細胞異時性的相容度。一旦達到適當的分化階段，嵌合入胚胎的PS細胞便會參與胚胎發(fā)育并按照其發(fā)育命運分化。阻止細胞凋亡也有利于形成小鼠-大鼠種間嵌合體，表達BCL2蛋白的大鼠primed狀態(tài)PS細胞可以在注射入小鼠囊胚后形成嵌合體。

除此之外，T.Nishimura等通過敲除宿主細胞中Igf1r基因在小鼠胚胎中創(chuàng)造了一種“細胞競爭微環(huán)境”，大大增加了嚙齒動物種內和種間嵌合體中供體的嵌合效率，并且Igf1r缺失不會導致胚胎早期發(fā)育阻滯，因此通過這種方式可以產生具有功能性嵌合器官的胎兒。

3.3 物種間進化距離

研究人員發(fā)現，與小鼠和大鼠之間的種內和種間嵌合體相比，人-動物嵌合胚胎的嵌合效率顯著降低。這種物種間屏障的原因尚不清楚，但是可能存在多種原因，包括配體-受體不相容以及遺傳多樣性導致黏附分子親和力的差異。并且當將相較于大鼠與小鼠遺傳距離更遠的草原田鼠（Microtus ochrogaster）的iPS細胞注射到小鼠囊胚中時，可以產生種間嵌合體，但是胚胎發(fā)育速率、嵌合性和成年存活率低于小鼠-大鼠嵌合體，這表明遺傳多樣性或進化距離是造成異種屏障的重要原因。

2021年，Zheng C.等發(fā)現了一種物種間細胞競爭的新模式。在共培養(yǎng)體系中，作為“失敗者”的人多能干細胞被“優(yōu)勝者”小鼠多能干細胞通過細胞凋亡的形式清除，而這種競爭力狀態(tài)似乎與物種間進化距離密切相關。但不同物種間na?ve狀態(tài)及分化后的PS細胞并不存在這一模式，并且不同物種之間primed狀態(tài)干細胞的競爭狀態(tài)不同。大小鼠之間和人猴之間的競爭力相似，未發(fā)現明顯的細胞競爭現象，但大小鼠、人猴和牛之間primed狀態(tài)干細胞之間相對競爭狀態(tài)是不同的，這種競爭狀態(tài)的不同會導致細胞競爭的發(fā)生。

4 應用與展望

種間嵌合體是研究發(fā)育、機體穩(wěn)態(tài)、干細胞潛能和疾病的優(yōu)秀實驗模型。種間嵌合體的應用可能存在以下幾種方向：（1）提供嵌合體來源的人類器官。利用基因操作技術，可以通過種間囊胚互補或種間靶向器官互補產生人類器官，幫助解決全世界器官供體嚴重短缺的難題。2010年，T.Kobayashi等在研究中成功在小鼠體內產生了完全來自大鼠的胰腺，使用大鼠iPS細胞補充無法發(fā)育出胰腺的小鼠胚胎中的胰腺器官。以這種方式從PS細胞生成的器官與動物的原始器官具有相同的功能。而使用囊胚互補進行人體器官生產，需要使用大型動物宿主，豬、羊、猴可能是比較合適的選擇，因為它們的器官大小與人類相似。目前已產生了Pdx1敲除的基因編輯綿羊，可能作為種間器官生成的宿主。盡管取得了這些進展，但要實現在動物身上產生用于移植的人體器官的夢想還有很長的路要走。（2）用于體內疾病建模。實驗生物學的一個重要目標是開發(fā)允許在體內條件下研究人類疾病的模型系統(tǒng)，轉基因動物成功地模擬了多種人類疾病，但未能為如帕金森氏癥或阿爾茨海默氏癥等復雜的疾病提供與疾病相適應的表型。鑒于疾病特異性iPS細胞能夠攜帶導致疾病病理學的所有遺傳改變，因此人類干細胞產生的人類-宿主動物種間嵌合體可以用作疾病建模，幫助研究人員更好地了解人類疾病的病因、發(fā)病時間和進程；另外作為藥物篩選平臺可以用于在體內環(huán)境測試候選藥物的功效和安全性，具有很高的臨床應用價值。

但關于嵌合體的研究和人類臨床應用仍存在一些倫理和社會問題，包括動物福利、供體細胞來源、公眾對嵌合體的不認可及對人類-非人嵌合體可能“人格化”的擔憂。目前人們難以預測嵌合體動物在試驗過程中可能遭受的疼痛或殘疾，因此研究人員必須對嵌合體比對待現有的實驗動物更謹慎。并且盡管目前生產嵌合體用于生物學研究是合法的，但有些人認為制造嵌合體使用人類ES細胞或源自流產胎兒的細胞是不道德的。除此之外，人類與非人類嵌合體最有爭議的方面是擔心來自人類的細胞可能賦予嵌合體一些人類特征，產生具有人類生殖細胞和智力的動物。