鷹嘴豆低聚肽抗疲勞活性研究

賈前生 劉遠洋 李 丹

(1. 黑龍江八一農墾大學體育教研部，黑龍江 大慶 163319；2. 黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319)

鷹嘴豆多肽是一種具有抗氧化、降血脂、提高免疫力等多種生理功能的生物活性多肽[1]。劉宇等[2]研究發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆多肽具有較強的抗氧化能力，其超氧陰離子的清除率顯著高于大豆蛋白水解物；Wen等[3]研究發(fā)現(xiàn)分子質量在1 000 Da的鷹嘴豆多肽可以顯著降低高脂模型大鼠血清中的甘油三酯及血清膽固醇的含量；李睿珺等[4]研究發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆多肽可能通過影響IL-17A、IL-2、IL-5、IL-9等細胞因子的分泌而提高小鼠的免疫力。

運動疲勞是一種因運動所引起的機體工作能力短時下降、能量供應不足的生理現(xiàn)象，代謝產(chǎn)物積累、氧化應激作用等都是運動中產(chǎn)生疲勞的重要因素[5]。植物蛋白活性肽比蛋白質更易于吸收利用，不僅能夠給機體提供能量，還可以通過清除機體內代謝產(chǎn)物和自由基等途徑起到抗運動疲勞作用[6-7]。鷹嘴豆中含有優(yōu)質植物蛋白，其消化吸收比率以及生物利用率遠高于其他豆類[8]。研究擬測定鷹嘴豆低聚肽的抗氧化活性，并研究鷹嘴豆低聚肽對小鼠負重游泳時間以及小鼠游泳后肌糖原和肝糖原含量、血尿素氮、乳酸、丙二醛等有害物質水平、抗氧化酶活性等指標的影響，以期為開發(fā)鷹嘴豆低聚肽抗疲勞產(chǎn)品提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性昆明小鼠：SPF級，體重18～22 g，北京維通利華公司；

Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶(2.0×105U/g)、Neutrase 0.8 L中性蛋白酶(1.5×104U/g)：諾維信生物技術有限公司；

西洋參粉：吉林集安市春及參茸有限公司；

2，2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)： 美國Sigma公司；

乳酸試劑盒、尿素氮試劑盒、肌糖原試劑盒、肝糖原試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒：南京建成生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

單列數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-6D型，上海左樂儀器有限公司；

電子天平：MF1035B型，濟南童鑫生物科技有限公司；

分光光度計: V-1600B型，青島明博環(huán)?？萍加邢薰?；

高效液相色譜儀：CTO-20AC型，日本島津公司；

高速冷凍離心機：fresco17型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

瓊脂糖凝膠電泳儀：Power Pac型，美國Bio-Rad公司；

全波長酶標儀：Bio-Rad 680型，美國Bio-Rad公司；

Milli-Q超純水儀：Direct-Q3型，美國Millipore公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 鷹嘴豆低聚肽的制備 參照王雨晴等[9]的方法并略作修改。將400 g鷹嘴豆蛋白加入5 L去離子水中，攪拌均勻。料液(m酶∶m底物=1∶100)在50 ℃、pH 8.0條件下經(jīng)堿性蛋白酶酶解3 h后，繼續(xù)在50 ℃條件下利用中性蛋白酶酶解2 h(m酶∶m底物=1∶50)。料液于100 ℃ 水浴10 min滅酶，然后離心(3 000 r/min，15 min)取上清液。利用1 000 Da的超濾膜過濾上清液，得到相對分子質量低于1 000 Da的鷹嘴豆低聚肽溶液，溶液經(jīng)濃縮、噴霧干燥后得到鷹嘴豆低聚肽粉末。

1.3.2 體外抗氧化活性的測定 參照Wu等[10]與Ahn等[11]的方法并略作修改。將等體積的待測液與DPPH溶液混合均勻，置于黑暗環(huán)境中30 min，在517 nm處測定吸光度(A1)。100 μL去離子水與100 μL DPPH溶液的混合溶液作為對照組并測定吸光度(A2)，同體積的乙醇溶液與去離子水的混合溶液作為空白組并測定吸光度(A0)。谷胱甘肽(GSH)作為陽性對照。按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

WDPPH——DPPH自由基清除率，%；

A1——樣品溶液在517 nm處的吸光度；

A2——對照組溶液在517 nm處的吸光度；

A0——空白組溶液在517 nm處的吸光度。

超氧陰離子自由基采用鄰苯三酚自氧化法檢測、羥自由基清除能力采用水楊酸法檢測，還原力采用鐵氰化鉀法檢測，計算各自的半抑制濃度(IC50)，進而表示鷹嘴豆低聚肽抗氧化功能。

1.3.3 動物試驗條件及分組 將60只昆明種雄性小鼠隨機分為5組即空白組，陽性對照組，鷹嘴豆低聚肽低、中、高劑量組，每組12只。經(jīng)過1周明暗交替12 h的適應性飼養(yǎng)，自由采食飲水，室溫為(22±2) ℃，相對濕度為(45±5)%。陽性對照組灌胃0.6 mg/(g·d)西洋參，低、中、高劑量鷹嘴豆低聚肽組分別灌胃0.5，2.0，3.5 mg/(g·d) 鷹嘴豆低聚肽，空白組連續(xù)4周灌胃等體積的蒸餾水。

1.3.4 力竭游泳試驗 末次灌胃30 min后，將尾根部負重5%體重的鉛絲小鼠置于深40 cm水箱中，待其鼻孔完全浸入水中7 s后，記錄不能浮出水面的時間。

1.3.5 乳酸、尿素氮、肝糖原的測定 負重游泳的小鼠吹干后休息30 min，處死，取腿部腓腸肌和肝臟，生理鹽水洗凈，吸干，按照試劑盒檢測方法檢測小鼠肌糖原、肝糖原含量。

1.3.6 疲勞相關生化指標測定 末次灌胃30 min后，小鼠不負重在溫水中游泳60 min，吹干后休息30 min，眼球取血，離心(3 000 r/min，10 min)制備清液，按照試劑盒說明書測定乳酸、尿素氮、CAT、SOD和GSH-Px的活力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行獨立樣本t檢驗。結果用平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 鷹嘴豆低聚肽體外抗氧化活性

由表1可知，鷹嘴豆低聚肽DPPH自由基含量與陽性對照組無顯著差異(P>0.05)，表明鷹嘴豆低聚肽具有一定的DPPH自由基清除能力。鷹嘴豆低聚肽對羥自由基的IC50值與陽性對照相比，二者無顯著差異(P>0.05)，表明鷹嘴豆低聚肽具有一定羥自由基清除能力。鷹嘴豆低聚肽對超氧陰離子自由基的IC50值顯著高于GSH陽性對照組(P<0.05)，表明鷹嘴豆低聚肽清除超氧陰離子自由基能力較弱。鷹嘴豆低聚肽的還原力顯著高于GSH陽性對照組(P<0.05)。

表1 鷹嘴豆低聚肽體外抗氧化活性?

2.2 鷹嘴豆低聚肽對小鼠體重的影響

由表2可知：在飼養(yǎng)的第7、14、21、28天，鷹嘴豆低聚肽低、中、高劑量組的小鼠體重與空白組、陽性對照組的均無顯著差異(P>0.05)。在飼養(yǎng)期間，小鼠體重未發(fā)生過快或過慢的增長，隨著飼喂時間的延長，小鼠體重隨之增加，各組小鼠精神狀態(tài)良好、行為特征未發(fā)現(xiàn)異常，表明鷹嘴豆低聚肽對小鼠正常生長無影響。

表2 鷹嘴豆低聚肽對小鼠體重的影響

2.3 鷹嘴豆低聚肽對小鼠力竭游泳時間的影響

由圖1可知，與空白組相比，中、高劑量組的鷹嘴豆低聚肽均顯著增加了小鼠負重力竭游泳時間(P<0.05)。高劑量組小鼠的力竭游泳時間與陽性對照組無顯著差異(P>0.05)。Kovacs-Nolan等[12]研究發(fā)現(xiàn)大豆肽不僅可以降低肌肉衰減率，還可以提高肌肉運動能力。由此可知，中、高劑量的鷹嘴豆低聚肽可以提高小鼠的運動耐力，一定程度上緩解體力疲勞。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4 鷹嘴豆低聚肽對小鼠肌糖原和肝糖原含量的影響

人體進行亞強度有氧運動時，肌糖原作為主要供能物質，其含量與持續(xù)亞強度運動時間呈正相關，同時，肝糖原補充供能，維持血糖穩(wěn)態(tài)。因此，糖原消耗量與疲勞程度緊密關聯(lián)[13]。由表3可知，低、中、高劑量組小鼠的肌糖原和肝糖原含量均高于空白組(P<0.05)，但低于陽性對照組，與劉娜等[14]、張鐵華等[15]研究結果一致。因此，鷹嘴豆低聚肽可以通過提高肌糖原和肝糖原含量為機體提供能量，從而使血糖穩(wěn)定在正常水平。

表3 鷹嘴豆低聚肽對小鼠肌糖原和肝糖原的影響?

2.5 鷹嘴豆低聚肽對小鼠體內有害物質濃度的影響

丙二醛是機體內氧自由基的重要代謝物，反映機體潛在的抗氧化能力、脂質過氧化的速率以及組織過氧化損傷的程度[16]。運動缺氧導致心肌組織中產(chǎn)生大量自由基。自由基作用于細胞膜上的不飽和脂肪酸，使膜脂發(fā)生過氧化作用，導致心肌細胞損傷，形成脂質過氧化，因此，在疲勞狀態(tài)下，丙二醛濃度升高[17]。由表4可知，相比于空白組，鷹嘴豆低聚肽低、中、高劑量組的丙二醛濃度顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性，表明鷹嘴豆低聚肽能夠通過抑制體內脂質過氧化來發(fā)揮抗疲勞作用。

表4 鷹嘴豆低聚肽對小鼠體內有害物質的影響?

血液中的乳酸是機體發(fā)生糖代謝的必然產(chǎn)物。血乳酸的升高會導致肌肉組織和血液的pH值下降，引發(fā)對人體功能有害的生化和生理過程[18]。由表4可知，相比于空白組，中劑量組和高劑量組小鼠的血乳酸濃度均顯著降低(P<0.05)。由此可知，中、高劑量的鷹嘴豆低聚肽能夠通過降低小鼠體內乳酸的堆積來緩解機體疲勞。

當機體內糖含量無法滿足運動供能的需求時，機體內的蛋白質就會參與供能反應[18]，經(jīng)肝臟代謝后產(chǎn)生血尿素氮，其含量與運動疲勞程度呈正相關[19]。因此，血尿素氮可以有效衡量機體疲勞程度。由表4可知，相比于空白組，低、中和高劑量組小鼠的血尿素氮濃度均顯著降低(P<0.05)。高劑量組小鼠的血尿素氮濃度顯著低于陽性對照組的(P<0.05)。綜上，鷹嘴豆低聚肽能夠降低小鼠體內代謝廢物的堆積從而緩解機體疲勞。

2.6 鷹嘴豆低聚肽對抗氧化酶活力的影響

CAT可將機體中過量的H2O2催化分解，以此保護細胞膜結構和功能完整，因此CAT常用來評價機體抗氧化能力。由圖2可知，相比于空白組，鷹嘴豆低聚肽低、中、高劑量組的CAT活力分別提高了4.80%，22.65%，45.53%。高劑量組CAT酶活與陽性對照組的無顯著差異(P>0.05)。

SOD是一種能夠清除代謝過程中有害物質的活性蛋白酶，其含量可以直接反映機體的疲勞程度[16]。由圖2可知，相比于空白組，鷹嘴豆低聚肽低、中、高劑量組的SOD活力分別提高了2.07%，14.77%，19.22%，中、高劑量組小鼠肝臟SOD活力顯著增高(P<0.05)。中劑量組SOD酶活與陽性對照組的無顯著性差異(P>0.05)。

GSH-Px是人體最重要的過氧化物酶之一，可將體內H2O2還原為無毒的羥基化合物，維持細胞膜結構與功能[20]。運動使身體產(chǎn)生強烈的脂質氧化和葡萄糖代謝等氧化反應[21-22]。由圖2可知，相比于空白組，鷹嘴豆低聚肽低、中、高劑量組的GSH-Px活力分別提高了4.60%，14.44%，24.84%，中、高劑量組小鼠肝臟GSH-Px活力顯著增高(P<0.05)。高劑量組GSH-Px酶活與陽性對照組的無顯著差異(P>0.05)。研究結果表明，鷹嘴豆低聚肽可以提高機體抗氧化酶的活性，清除因運動而產(chǎn)生的自由基，進而緩解疲勞。

圖2 鷹嘴豆低聚肽對小鼠抗氧化能力的影響

3 結論

利用雙酶水解法制備鷹嘴豆低聚肽，測定其抗氧化活性及反映疲勞程度的生化指標。結果表明，鷹嘴豆低聚肽DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力以及還原力均高于谷胱甘肽(陽性對照)；羥自由基清除能力與谷胱甘肽(陽性對照)接近。此外，與空白組相比，不同劑量的鷹嘴豆低聚肽均提升了小鼠負重力竭游泳時間、小鼠的肌糖原、肝糖原含量以及小鼠肝臟SOD活力；并且丙二醛含量、血乳酸濃度、血尿素氮濃度均降低；鷹嘴豆低聚肽提高了抗氧化酶的活力。因此，鷹嘴豆低聚肽具有顯著的抗疲勞作用。但鷹嘴豆低聚肽屬混合肽，其肽段組成以及起到抗疲勞作用的肽結構尚不明確，下一步擬開展鷹嘴豆低聚肽分離純化研究，明確具有抗疲勞作用的肽段組成，探討其抗疲勞機理。