微生物法測(cè)定嬰幼兒奶粉中泛酸含量的研究

賀 燕 鐘菲菲 王曉慶 徐文泱 楊 滔

(1. 湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2. 長(zhǎng)沙市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

泛酸又名維生素B5，是一種重要的水溶性維生素。它具有酸性，易溶于乙醇和水，不溶于脂類溶劑，在酸性環(huán)境中易分解，在中性環(huán)境中較為穩(wěn)定，是嬰幼兒乳粉中添加的重要營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑[1-4]。目前泛酸的檢測(cè)方法有微生物法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MC/MS)[5-7]。微生物法主要是利用植物乳桿菌對(duì)泛酸的特異性，在含有泛酸樣品中根據(jù)生長(zhǎng)產(chǎn)生的光密度來測(cè)定泛酸的含量[8]，此方法靈敏度高，不僅能檢測(cè)出強(qiáng)化泛酸，還能檢測(cè)出原生泛酸，這是較儀器方法的優(yōu)異之處[9]。但由于現(xiàn)有的微生物方法GB 5009.210—2016中關(guān)鍵步驟試驗(yàn)條件不具體(菌液濃度的把控等)、提取方法存在不足、試驗(yàn)過程繁瑣(吸光度的測(cè)定)等，導(dǎo)致此方法具有操作過程既復(fù)雜，檢驗(yàn)試驗(yàn)又易失敗等缺點(diǎn)[10]。研究主要從菌種的選擇、濃度的確定、樣品前處理方法、吸收光度測(cè)定方法等方面進(jìn)行深入研究，優(yōu)化目前用于泛酸檢測(cè)的微生物方法，以期為后續(xù)國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法的修訂提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

嬰幼兒奶粉：市售；

質(zhì)控樣品：山東美正生物科技有限公司；

ATCC 8014植物乳桿菌、CICC 6076植物乳桿菌：上海北諾生物科技有限公司；

泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品：95.5%，德國(guó)DR.Ehrenstorfer公司；

乙酸鈉、乙醇、鹽酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器

電子天平：ME204E型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

紫外分光光度計(jì)：T9型，普析通用儀器有限公司；

高壓滅菌鍋：HVA-85型，日本平山制作所株式會(huì)社廠；

培養(yǎng)箱：MIR-254型，松下電器(中國(guó))有限公司；

酶標(biāo)儀：Infinite M200型，美國(guó)Tecan公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植物乳桿菌的選擇及制備優(yōu)化

本文以休閑口味調(diào)味泡菜脆口蘿卜為例，引用Q10方法[5]，通過加速貨架期試驗(yàn)[6](Accelerated Shelf-life Testing，ASLT)研究了3種不同包裝材質(zhì)對(duì)脆口蘿卜貨架期的影響。為該類型的產(chǎn)品選擇合適的包裝材料提供了重要的數(shù)據(jù)支撐。

(1) 不同來源的植物乳桿菌菌種測(cè)試：GB 5413.17—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測(cè)定》和GB 5009.210—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測(cè)定》中的微生物法均采用ATCC 8014植物乳桿菌，而對(duì)于其他來源的植物乳桿菌則未提及。采用不同來源的植物乳桿菌即ATCC 8014植物乳桿菌、CICC 6076植物乳桿菌，按照GB 5009.210—2016第一法(微生物法)來測(cè)定質(zhì)控樣品及市售嬰幼兒配方奶粉，分析不同來源的植物乳桿菌對(duì)嬰幼兒奶粉中泛酸測(cè)定的影響。

(2) 菌液濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響：將保存的ATCC 8014轉(zhuǎn)接到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基上，36 ℃培養(yǎng)18～24 h，再將其接種于乳酸桿菌肉湯中，36 ℃培養(yǎng)24 h。肉湯培養(yǎng)物先500 r/min 離心10 min留菌液，再以2 500 r/min 離心10 min，再將沉淀物用無菌生理鹽水洗滌3次。添加菌液或無菌生理鹽水將透光率調(diào)至60%，70%，80%，90%，以此菌懸液作為測(cè)試菌液用來測(cè)定樣品，菌液的添加量為50 μL。按照GB 5009.210—2016第一法(微生物法)，研究不同濃度的菌液直接添加至待測(cè)液中對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

(3) 菌液添加量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響：為簡(jiǎn)化菌液的制備和添加過程，制備系列5 mL乳桿菌接種肉湯，分別接種活化后的植物乳桿菌斜面培養(yǎng)物1環(huán)，于36 ℃培養(yǎng)20 h，將肉湯培養(yǎng)物首先500 r/min離心10 min留菌液，再將菌液以2 500 r/min離心10 min，再將沉淀物洗滌3次，充分洗滌后按2.5，5.0，10.0 mL的菌液量添加到400 mL泛酸測(cè)試培養(yǎng)基中，按照GB 5009.210—2016第一法(微生物法)測(cè)定質(zhì)控樣品，比較相同測(cè)試培養(yǎng)基添加不同菌液量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

1.3.2 泛酸樣品前處理方法 分別采用GB 5413.17—2010水解法和GB 5009.210—2016的直接提取法，對(duì)泛酸質(zhì)控樣品及奶粉樣品進(jìn)行測(cè)定，比較不同樣品前處理方法對(duì)結(jié)果的影響。

1.3.3 吸光度測(cè)定方法 吸光度的測(cè)定有紫外分光光度法和酶標(biāo)儀測(cè)定方法，對(duì)質(zhì)控樣品、市售的5個(gè)奶粉以及加標(biāo)樣品按照GB 5009.210—2016第一法(微生物法)處理，分別采用紫外分光光度法和酶標(biāo)儀法測(cè)定吸光度，比較吸光度測(cè)定方法對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

1.3.4 加標(biāo)試驗(yàn) 以9號(hào)樣品的奶粉作為試驗(yàn)樣品，添加10 μg加標(biāo)按照GB 5009.210—2016第一法(微生物法)進(jìn)行試驗(yàn)，本底樣品和加標(biāo)樣品分別進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，分析酶標(biāo)法測(cè)定對(duì)結(jié)果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌的選擇及制備優(yōu)化

2.1.1 不同來源的植物乳桿菌菌種對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

用ATCC 8014植物乳桿菌和CICC 6076植物乳桿菌按照GB 5009.210—2016第一法(微生物法)檢測(cè)質(zhì)控樣品及市售奶粉樣品1號(hào)、樣品2號(hào)、樣品3號(hào)測(cè)定泛酸結(jié)果見表1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 不同植物乳桿菌測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表1 不同來源的植物乳桿菌測(cè)定泛酸結(jié)果表

采用ATCC 8014植物乳桿菌、CICC 6076植物乳桿菌按照GB 5009.210—2016第一法(微生物法)測(cè)定的3個(gè)奶粉樣品和質(zhì)控樣品，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.82%～6.59%，在允許的相對(duì)偏差范圍內(nèi)。此外，以兩種不同來源的植物乳桿菌菌株得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線性方程y=0.004 8x+0.041 5(R2=0.995 2)和y=0.004 3x+0.041 8(R2=0.993 0)，線性良好且二者線性范圍一致，說明ATCC 8014植物乳桿菌和CICC 6076植物乳桿菌均可用來測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中的泛酸含量。有關(guān)研究[11-13]及現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)(GB 5009.210—2016和GB 5413.17—2010)均使用ATCC 8014植物乳桿菌測(cè)定泛酸，該菌貨期長(zhǎng)，但價(jià)格昂貴。

2.1.2 不同濃度菌液直接添加至待測(cè)液中對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響 用無菌生理鹽水調(diào)制透光率分別為60%，70%，80%，90%的菌液，由不同的菌液濃度得到的泛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，測(cè)定的質(zhì)控樣品結(jié)果見表2。

表2 不同濃度菌液測(cè)定的質(zhì)控樣品結(jié)果

由圖2可知，透光率為70%，80%，90%時(shí)，曲線吸光度值基本上呈線性增加，透光率為80%時(shí)菌液濃度所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性最好，泛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.007 3x-0.044 3，相關(guān)系數(shù)R2為0.991 2。分析原因?yàn)椋航臃N 60%透光率的菌液濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線由于菌液濃度較高，當(dāng)達(dá)到高濃度標(biāo)準(zhǔn)值(90～100 ng/mL)時(shí)，定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)消耗后，植物乳桿菌繁殖增加速度減緩，吸光度值增加幅度變緩，故曲線明顯趨向于持平；當(dāng)接種90%透光率菌液時(shí)，因?yàn)榻臃N量較少，在低含量的營(yíng)養(yǎng)成分的條件下，繁殖增加緩慢，較低濃度的吸光度值特別低。利用植物乳桿菌對(duì)泛酸的特異性進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，添加菌液濃度至關(guān)重要，菌液濃度不宜太高，太高則會(huì)出現(xiàn)高濃度標(biāo)準(zhǔn)值(90～100 ng/mL)的吸光值無明顯變化，太低則會(huì)出現(xiàn)低濃度標(biāo)準(zhǔn)值的吸光度值過低，同時(shí)不同管之間的平行性較差。

圖2 不同濃度菌液直接添加至待測(cè)液中所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線

從測(cè)定質(zhì)控樣品的結(jié)果來看，添加菌液透光率為60%～90%時(shí)結(jié)果均在質(zhì)控樣品允許接受的范圍內(nèi)，但從標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性以及平行測(cè)試管的平行性來看，以添加透光率為80%的菌液50 μL至測(cè)試管中，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品測(cè)定結(jié)果最佳。GB 5009.210—2016和GB 5413.17—2010標(biāo)準(zhǔn)方法及現(xiàn)有研究中對(duì)于菌液濃度的定量不明確或者范圍很廣，研究定量菌液濃度數(shù)據(jù)結(jié)果，有利于檢測(cè)操作的標(biāo)準(zhǔn)化，確保檢驗(yàn)試驗(yàn)的成功和檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

2.1.3 不同的菌液量直接添加至測(cè)試培養(yǎng)基中對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響 國(guó)標(biāo)方法及現(xiàn)有研究中一般接種一定范圍內(nèi)的透光率的菌液，此方法需要經(jīng)過多次調(diào)試和測(cè)定菌液濃度，對(duì)于初學(xué)的檢測(cè)者難度較大。為減少菌液的制備及接種過程，研究直接添加到測(cè)試培養(yǎng)基的菌液添加量，便于檢測(cè)過程的標(biāo)準(zhǔn)化操作。按2.5，5.0，10.0 mL的菌液量添加到400 mL泛酸測(cè)試培養(yǎng)基中，用來測(cè)定質(zhì)控樣品，得到接種2.5 mL菌液的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)試樣品在低濃度時(shí)，培養(yǎng)后吸光度值過低，而添加10.0 mL菌液的標(biāo)準(zhǔn)曲線在高標(biāo)準(zhǔn)液濃度70 ng/mL以上增加緩慢，在90，100 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度吸光度值基本無變化。因而以添加5.0 mL菌液到400 mL泛酸測(cè)試培養(yǎng)基中得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品測(cè)定結(jié)果最佳(見圖3)，線性極好，R2達(dá)到了0.996 9，測(cè)定得到的質(zhì)控樣品結(jié)果為3.83×103μg/100 g(質(zhì)控樣品泛酸參考值為2 970～4 610 μg/100 g)，基本接近中位值。

圖3 接種5.0 mL菌液至400 mL泛酸測(cè)試培養(yǎng)基得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 樣品前處理方法

由表3可知，利用水解法和直接提取法提取泛酸，兩種方法所得結(jié)果不一致，直接提取法明顯高于水解法，兩者測(cè)定的結(jié)果相對(duì)偏差范圍達(dá)到了12%～32%。其原因是：① 水解法中泛酸的提取通過121 ℃水解來實(shí)現(xiàn)，該過程可能會(huì)造成游離泛酸的分解而導(dǎo)致總泛酸測(cè)定結(jié)果偏低；② 直接提取法提取奶粉中全部的水溶性維生素包括生物素、煙酸也將全部被提取出來，生物素和煙酸對(duì)植物乳桿菌也有特異性，能促進(jìn)植物乳桿菌的生長(zhǎng)而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高，另外，直接提取法提取不經(jīng)過濾，樣品液明顯呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，也可能導(dǎo)致結(jié)果偏高。

表3 兩種前處理方法所得泛酸結(jié)果分析表

2.3 吸光度測(cè)定方法

GB 5413.17—2010第一法(微生物法)和GB 5009.210—2016第一法(微生物法)均要求采用紫外分光光度進(jìn)行測(cè)定。此法最大的弊端是開展大批量樣品檢測(cè)時(shí)耗時(shí)長(zhǎng)，并會(huì)導(dǎo)致后續(xù)樣品測(cè)定結(jié)果偏高，而酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度的速度則較快。從表4結(jié)果來看，用紫外分光光度法和酶標(biāo)儀測(cè)定的1個(gè)質(zhì)控樣品及5個(gè)奶粉樣品相對(duì)偏差在1.0%～4.8%，在GB 5413.17—2010第一法(微生物法)和GB 5009.210—2016第一法(微生物法)允許的偏差誤差范圍內(nèi)。由表5可知，采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度的加標(biāo)回收率達(dá)到了96.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.95%，回收率符合要求且測(cè)定方法的精密度高。為減少現(xiàn)行國(guó)標(biāo)法檢測(cè)泛酸時(shí)檢測(cè)吸光度的繁瑣程度，建議改用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，此法方便，測(cè)定耗時(shí)短，準(zhǔn)確度高。

表4 不同吸光度測(cè)定方法的結(jié)果分析

表5 酶標(biāo)法測(cè)定9號(hào)加標(biāo)樣品的結(jié)果分析表?

3 結(jié)論

(1) 植物乳桿菌CICC 6076作為測(cè)試菌株用來測(cè)定嬰幼兒食品中的泛酸含量具有和植物乳桿菌 ATCC 8014同等的效果，建議在允許(如內(nèi)銷食品檢驗(yàn))時(shí)替換使用。

(2) 為利于檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化操作，對(duì)微生物法關(guān)鍵測(cè)定步驟的菌懸液準(zhǔn)備研究出兩種標(biāo)準(zhǔn)化的定量操作條件：① 直接接種透光率為80%的菌液50 μL于滅菌測(cè)試管中；② 采用5 mL菌液(單一菌落接種5 mL乳桿菌肉湯培養(yǎng)20 h后的培養(yǎng)液)添加至400 mL滅菌測(cè)試培養(yǎng)基中，后者操作更簡(jiǎn)單。

(3) 用紫外分光光度法和酶標(biāo)儀測(cè)定的結(jié)果相對(duì)偏差小，且采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度加標(biāo)回收的回收率可達(dá)到96.9%，用酶標(biāo)儀測(cè)定泛酸的吸光度值，耗時(shí)短，準(zhǔn)確性高，故建議GB 5009.210—2016的后續(xù)修訂可在第一法中引入此方法測(cè)定吸光度值。

(4) 對(duì)于微生物法測(cè)定泛酸含量使用直接提取法導(dǎo)致結(jié)果偏高的原因還有待于深入研究，特別是如何避免和解決提取過程中因煙酸、生物素含量引起的結(jié)果偏高問題。