氣相色譜—離子遷移譜技術分析干燥方式對檸檬片揮發(fā)性物質的影響

蔣 冰 丁勝華 張達莉 羅耀華 李 湘 付復華

(1. 湖南大學研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長沙 410125)

檸檬(Citruslimon(L.) Burm. f.)為屬蕓香科柑橘屬常綠小喬木，主要分布于東南亞、西歐、美國和中國等。據(jù)美國農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計[1]，2020年全球檸檬產(chǎn)量約840萬t，其中鮮銷量645萬t，進出口量達434萬t，加工量186萬t。檸檬富含維生素C、維生素B、核黃素和礦物質等，具有預防癌癥和心血管疾病等多種非傳染性疾病的功效特性[2]。鮮檸檬水分含量較高，不易保藏。干制可以使果蔬保持低水分，防止微生物生長，降低相關酶活性，實現(xiàn)長期貯藏[3]。王海鷗等[4]研究了真空凍結冷凍干燥、冷凍干燥、熱風干燥3種方式對檸檬片干燥特性及品質的影響，結果表明真空凍結冷凍干燥是高附加值檸檬片的首選干燥方法。杜騰飛等[5]比較了真空遠紅外干燥、熱風干燥和真空冷凍干燥制備檸檬片的相關品質，研究表明真空遠紅外干燥和真空冷凍干燥對品質保留均有良好效果。高煒等[6]采用冷凍干燥、熱風干燥、紅外干燥及真空干燥對檸檬片進行干制，探究分析多酚含量及抗氧化能力，結果表明冷凍干燥處理組與熱風干燥處理組檸檬游離態(tài)和總酚含量接近，檸檬中主要酚類物質是類黃酮。周琦等[7]研究表明微波功率1.01 kW、真空度72.4 kPa、檸檬片厚度4 mm條件下能較好地保持檸檬干的內外品質。王忠合等[8]采用超聲波預處理檸檬片，研究超聲輔助熱風干燥的動力學，通過多指標證明超聲預處理后熱風干燥與空白組和熱燙組相比，干燥速率增加，且能降低干燥過程維生素C的損失。

果蔬風味物質主要包括揮發(fā)性物質和非揮發(fā)性物質，前者決定果蔬特征香氣，并為后者合成提供前體物質[9]。前人[10]17-18[11]通過GC-MS分析檸檬中揮發(fā)性物質組成，發(fā)現(xiàn)檸檬片中萜烯類化合物占據(jù)主導地位，主要烯烴為D-檸檬烯、萜品烯、β-蒎烯，主要醛類化合物為檸檬醛、壬醛、癸醛、己醛，主要醇類化合物為α-松油醇、橙花醇、4-萜烯醇、芳樟醇、香葉醇，主要酯類化合物為乙酸橙花酯。此外，檸檬果皮中的揮發(fā)性物質種類多于果肉中的揮發(fā)性物質，主要香氣成分源自果皮[12]。氣相—離子遷移譜(GC-IMS)技術與頂空固相微萃取結合氣相色譜—質譜聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS)技術、電子鼻(E-nose)技術相比，具有檢測濃度低、響應速度快等優(yōu)點，已被廣泛應用于多類果蔬的檢測中[13-15]。然而，利用GC-IMS技術對不同干燥方式檸檬片中揮發(fā)性物質進行定性分析還鮮有報道。研究擬以尤力克檸檬為原料，采用氣相—離子遷移譜(GC-IMS)結合主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，研究4種干燥方式對檸檬揮發(fā)性物質的影響，以期為檸檬干制方法的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

檸檬：尤力克，原產(chǎn)地四川省安岳縣，選擇形狀規(guī)則大小均一，無傷痕和無蟲眼的檸檬作為試驗原料。

1.2 主要儀器與設備

精密分析天平：BSA124S型，廣州市授科儀器科技有限公司；

風味分析儀：FlavourSpec?型，配有Vocal軟件和IMS、NTST數(shù)據(jù)庫，德國G.A.S公司；

多功能切片機：mkd-p-1600a型，北京美科達科技公司；

冷凍干燥機：LGJ-25C型，北京四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9053A型，上海精宏實驗設備有限公司；

紅外烘干箱：SAK-505型，江蘇泰州圣泰科紅外科技有限公司；

真空干燥箱：ZF-6050型，上海捷呈實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理 選擇質量形狀相近的檸檬，清洗表面雜質。采用多功能切片機將檸檬切分成3 mm厚度的切片，選取大小均一、厚度均勻的檸檬片，收集備用。

1.3.2 檸檬片干燥 將4份質量相近的檸檬片分別通過4種干燥方式進行干燥，終點為檸檬片質量達到恒重。干制方法參照文獻[10]10進行修改。

(1) 冷凍干燥(FD)：冷阱溫度降至-50 ℃以下，物料溫度降至-30 ℃以下，預凍24 h，升溫速率保持為4 ℃/2 h，4層凍干面積均為0.25 m2，真空度低于30 Pa。

(2) 熱風干燥(AD)：溫度恒定60 ℃，風速恒定1 m/s，箱容積400 mm×400 mm×300 mm。

(3) 紅外干燥(IRD)：溫度恒定60 ℃，風速恒定1 m/s，加熱管功率225 W，箱容積400 mm×400 mm×200 mm。

(4) 真空干燥(VD)：溫度恒定60 ℃，箱容積415 mm×370 mm×345 mm，真空度保持為1 kPa。

收集干制檸檬片于避光密封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 GC-IMS分析條件 將干燥樣品粉碎，稱取0.2 g樣品(鮮檸檬切片，取2 g，含水率90%)，置于20 mL頂空瓶中，40 ℃平衡15 min后進樣。檢測條件根據(jù)文獻[13]修改如下：色譜柱MXT-5(15 m×0.53 mm×1 μm)，色譜柱溫度60 ℃，IMS溫度45 ℃，進樣針溫度65 ℃，載氣/漂移氣均為N2，進樣體積200 μL，分析時間20 min。漂移氣流量150 mL/min；載氣流量，0～2 min時為2 mL/min，2～20 min時由2 mL/min逐步提升至100 mL/min。試驗重復3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用GC-IMS儀器配套VOCal軟件查看數(shù)據(jù)的定性和分析譜圖，使用軟件內置的IMS數(shù)據(jù)庫和NIST數(shù)據(jù)庫進行物質的定性分析；使用Reporter插件進行二維和三維譜圖的差異對比，Gallery Plot插件用于比較揮發(fā)性有機物含量在不同樣品間的差異，Dynamic PCA 插件則用于主成分分析及其圖表的繪制；利用Origin 2018軟件中的Heat map with dendrogram插件繪制聚類分析熱圖；采用SIMCA 14.1進行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，PLS-DA方法基于同時分解預測量矩陣X和類別矩陣Y提取因子，將因子依據(jù)相關性從大到小排列，最后通過交互驗證確定隱變量個數(shù)，參與回歸建模，是一種經(jīng)典的多類別判別分析方法。

2 結果與分析

2.1 不同方式干燥檸檬片的揮發(fā)性物質定性分析

基于GC×IMS文庫5種處理方式的檸檬片均被鑒定出72種揮發(fā)性物質(圖1)，且檢出成分相同，具體包括20種萜烯類物質、16種酯類物質、13種醛類物質、13種醇類物質、7種酮類物質、2種酸類物質和1種呋喃類物質(表1)。此外，5個處理組樣品中還檢出了12種未被定性的揮發(fā)性物質。由圖1可知，在保留時間為100～600 s時共出現(xiàn)了61個信號峰，主要包括20種萜烯類物質、14種酯類物質、10種醛類物質、9種醇類物質、5種酮類物質、2種酸類物質和1種呋喃類物質；600～1 200 s時出現(xiàn)了9個信號峰，主要包括2種酯類物質、2種醛類物質、4種醇類物質和1種酮類物質。異松油烯、萜品烯、β-蒎烯、乙酸乙酯、壬醛、糠醇、3-羥基-2-丁酮等物質在遷移過程中還產(chǎn)生了二聚體或三聚體，其保留指數(shù)與保留時間非常接近，但遷移時間不同，新生成的二聚體質量大于單體，因此遷移時間增加[15]，生成的二聚體和三聚體信息可二次對揮發(fā)性物質定性，使定性結果更準確可靠。

表1 檸檬揮發(fā)性物質定性結果?

續(xù)表1

2.2 不同方式干燥檸檬片揮發(fā)性物質的氣相離子遷移譜圖分析

從圖2可直觀看出，不同樣品中的揮發(fā)性物質存在差異，如黃圈中的揮發(fā)性物質(α-松油醇)在鮮檸檬中含量較高，而在4種干制檸檬片中的對應的揮發(fā)性含量均降低；由于糠醛、己醛、β-大馬士酮等物質含量在圖中差異較小，因此選取俯視圖和差異圖進一步進行差異對比。

由圖3可知，4種干燥方式處理后的樣品中揮發(fā)性物質含量之間存在差異，且與鮮檸檬存在明顯差異，如IRD和AD處理中糠醛、己醛的信號峰紅色相較于其他處理顏色更深，說明此物質在IRD和AD處理后的檸檬片中含量更高；IRD和VD處理中β-大馬士酮的信號峰紅色相較于其他處理顏色更深，說明此物質在IRD和VD處理后的檸檬片中含量更高。

2.3 不同方式干燥檸檬片揮發(fā)性物質的指紋圖譜對比

由圖4可知，20種萜烯類物質(A區(qū)域)在干燥過程中含量變化相對穩(wěn)定，鮮檸檬和檸檬片均具有柑橘清香，何朝飛等[16]研究表明萜烯類物質是柑橘類水果主要的香氣成分。檸檬烯、β-蒎烯、月桂烯和異松油烯等是柑橘的主要香氣成分，在5種樣品中均有檢出，說明干制不會影響檸檬片的主要香氣組分[17]，其主要香氣成分由基因型決定，與品種相關[18]。試驗選用原料均為尤力克檸檬，各處理后的檸檬片香氣成分一致，離子遷移圖(圖1)也驗證了這點。在干燥處理后，檸檬中的主要醇類物質和酯類物質，包括α-松油醇、芳樟醇、正己醇、3-甲基-1-戊醇、異戊醇、2-甲基-1-丁醇、1-戊烯-3-醇、乙醇和苯乙酸乙酯、丁酸丙酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、異丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯(B區(qū)域)，其含量較鮮檸檬均下降。與其他2種干燥方式相比，IRD和AD處理更好地保留了丁酸乙酯、乙酸甲酯、丙酸乙酯等物質，這可能是由于冷凍干燥和真空干燥處理均在低真空環(huán)境進行干燥，導致酯類物質逸出。丁酸乙酯和丙酸乙酯具有甜果香味，乙酸甲酯具有香料氣味，說明IRD和AD處理可保留鮮檸檬中果香味揮發(fā)性物質。揮發(fā)性醇主要是由乙醇脫氫酶的作用產(chǎn)生，在高溫條件下相關酶鈍化或失活，從而造成醇類物質的損失[9]。α-松油醇是檸檬烯的降解產(chǎn)物，超過一定含量就會產(chǎn)生腐敗味[19]，鮮檸檬中α-松油醇含量較高，4種干燥方式均顯著降低了其含量，說明干制能抑制檸檬腐敗味的產(chǎn)生，達到貯藏的目的。與鮮檸檬相比，F(xiàn)D處理后E-2-己烯醛、己醛、香葉醇等物質含量上升，香葉醇呈玫瑰和天竺葵香味，是柑橘水果重要的香氣成分；AD處理后γ-丁內酯、糠醛、3-甲基-2-丁烯醛、3-羥基-2-丁酮、2-乙酰基呋喃、糠醇等物質含量上升(C區(qū)域)，2-乙?；秽涂反汲尸F(xiàn)甜的焦糖風味[19]，熱風干燥后的檸檬片呈現(xiàn)烤制風味；IRD處理后苯乙酮、E-2-戊烯醛、庚醛、戊酸等物質含量上升，苯乙酮、糠醛、己醛呈烤制香味，說明IRD檸檬片與鮮檸檬相比，烤制香味更為濃郁，可能與紅外加熱有關；VD處理后檸檬醛、β-大馬士酮、癸醛、壬醛、異胡薄荷醇、乙酸異戊酯、癸酸乙酯等物質含量上升，檸檬醛是檸檬香氣的主要成分，說明VD可保留部分鮮檸檬香氣成分。己醛、癸醛是鑒定橙皮油的一個標準，在5種樣品中均檢出[16]。除FD處理外，其余3種干燥后的檸檬片均為橙色，這是因為在加熱過程中，水分大量損失，檸檬表皮皺縮，美拉德反應使檸檬顏色由黃變橙[20]。鮮檸檬揮發(fā)性物質以萜烯類、酯類和醇類為主，干制后的檸檬片揮發(fā)性物質以萜烯類、醛類為主。

圖1 不同方式干燥檸檬片的揮發(fā)性物質離子遷移譜

圖2 不同方式干燥檸檬片的GC-IMS三維譜圖

紅色代表該物質在此樣品中含量比對照組高，如圖中紅色方框區(qū)域；藍色代表該物質在此樣品中含量比對照組低，如圖中藍色方框區(qū)域；顏色越深，說明含量差異越大

A為不同方式干燥檸檬片揮發(fā)性萜烯類物質；B為干燥處理后檸檬片含量下降的揮發(fā)性物質；C為AD處理后檸檬片含量上升的揮發(fā)性物質；每一列代表同一揮發(fā)性物質在不同樣品中的信號峰，紅色越深，含量越高，數(shù)字編號的是未鑒別的峰

2.4 不同方式干燥檸檬片揮發(fā)性物質的主成分分析

如圖5所示，PC1和PC2分別為53.6%和19.4%，總和為73%，能夠解釋樣品的總體變異[21]。鮮檸檬單獨位于第一象限，不同方式干燥檸檬片均位于第二、三象限，AD和IRD處理與鮮檸檬距離較近，可能是因為熱風處理相較其他方式對鮮檸檬中的丁酸乙酯、乙酸甲酯、丙酸等物質保留率較高；AD處理與IRD處理、VD處理較為相似，而與FD處理差異較大，這是由于前3種方式均采用了60 ℃ 熱加工處理，經(jīng)熱干燥處理的樣品風味較為接近。通過計算每兩個樣本之間的歐幾里得距離，得到不同干燥方式處理的檸檬樣品的最近鄰—歐氏距離圖(見圖6)。結果表明，5種樣品之間可明顯區(qū)分，IRD處理和AD處理距離最近，相似度最高，因為兩種干燥方式處理后的檸檬片中己醛、糠醛及部分未鑒別物質含量均有增加，與指紋譜圖和PCA結果一致。

圖5 不同方式干燥檸檬片揮發(fā)性物質的主成分分析

圖6 不同方式干燥檸檬片指紋圖譜的相似度分析

2.5 不同方式干燥檸檬片揮發(fā)性物質的PLS-DA分析

經(jīng)PLS-DA分析，模型的R2X=0.952、R2Y=0.973、Q2=0.912，R2X越接近1表明模型越穩(wěn)定，Q2>0.5表明預測率較高。圖7是PLS-DA置換結果(置換驗證次數(shù)200次)，右側是PLS-DA原始值，左側為PLS-DA模擬值，左側的R2和Q2均比右側低，且R2和Q2的回歸斜率大于1，Q2的回歸線截距為負值，說明該模型穩(wěn)定性良好，具有較好的預測能力[22-23]。

圖7 不同方式干燥檸檬片揮發(fā)性物質的PLS-DA擬合曲線

通過GC-IMS指紋圖譜，將不同干燥方式檸檬樣品中的72種揮發(fā)性物質基于PLS-DA模型中的變量投影重要性(VIP)將每個變量的貢獻進行量化，篩選VIP值>1的揮發(fā)性物質作為潛在的特征性物質。如圖8所示，檸檬干燥過程中共有23種可鑒定特征揮發(fā)性物質(VIP>1)，包括乙醇、丁酸乙酯(D)、乳酸乙酯、α-松油醇、糠醛(D)、β-大馬士酮、芳樟醇、苯乙酮、乙酸乙酯(D)、萜品烯(D)、E-2-乙烯醛(M)、E-2-乙烯醛(D)、檸檬醛、己醛、α-萜品烯(D)、莰烯、α-蒎烯(D)、α-水芹烯(D)、苯乙酸乙酯、壬醛(M)、萜品烯(M)、β-蒎烯(D)、雙戊烯(M)。

圖8 不同方式干燥檸檬片揮發(fā)性物質的VIP值分布

通過模型篩選，依據(jù)VIP值>1的23種揮發(fā)性物質的峰值強度繪制聚類熱圖，如圖9所示，每個處理組3個平行都聚為一類，平行性良好，處理間可較好區(qū)分；IRD處理和VD處理聚為第Ⅰ類，AD處理和IRD、VD處理聚為第Ⅱ類，F(xiàn)D處理和其他3種處理聚為第Ⅲ類，鮮檸檬與4種檸檬片聚為第Ⅳ類，說明鮮檸檬與4種檸檬片差異最大。利用GC-IMS從檸檬中共檢出20種萜烯類物質(表1)，經(jīng)PLS-DA，8種萜烯類物質是標志性揮發(fā)化合物，包括萜品烯(D)、α-萜品烯(D)、莰烯、α-蒎烯(D)、α-水芹烯(D)、萜品烯(M)、β-蒎烯(D)、雙戊烯(D)，經(jīng)過4種干燥處理，檸檬片中萜烯類物質均有增加(表2)，萜烯類物質是植物精油的主要成分，具有抑菌效果[15]，說明干制可達到貯藏檸檬的目的；利用GC-IMS從檸檬中共檢出16種酯類物質(表1)，經(jīng)PLS-DA，4種酯類物質是標志性揮發(fā)化合物，包括丁酸乙酯(D)、乳酸乙酯、乙酸乙酯(D)、苯乙酸乙酯，經(jīng)過4種干燥處理，檸檬片中酯類物質均有減少(表2)，但IRD和AD處理對于酯類物質保留效果較好，與指紋譜圖(圖4)結果一致；利用GC-IMS從檸檬中共檢出13種醛類物質(表1)，經(jīng)PLS-DA，6種醛類物質是標志性揮發(fā)化合物，包括糠醛(D)、E-2-乙烯醛(M)、E-2-乙烯醛(D)、檸檬醛、己醛、壬醛(D)，醛類物質對檸檬香氣有貢獻作用，總醛含量決定檸檬香氣質量[24]，檸檬醛為呈味物質，糠醛、己醛、壬醛等醛類物質對檸檬片香氣具有貢獻作用，經(jīng)過4種干燥處理，檸檬片中醛類物質均有增加(表2)，4種檸檬片的香氣品質均得到提升，其中糠醛和己醛呈烤制香味，在IRD和AD處理中含量增加較多，說明這兩種方式干制的檸檬片具有更明顯的烤制香味；利用GC-IMS從檸檬中共檢出13種醇類物質(表1)，經(jīng)PLS-DA，3種醇類物質是標志性揮發(fā)化合物，包括乙醇、α-松油醇、芳樟醇，經(jīng)過4種干燥處理，檸檬片中醇類物質均有減少(表2)，但IRD處理可保留更多的醇類物質，可能是由于真空環(huán)境會造成醇類物質損失，且熱風干燥強度較大時也會造成醇類物質損失；利用GC-IMS從檸檬中共檢出7種酮類物質(表1)，經(jīng)PLS-DA，2種酮類物質是標志性揮發(fā)化合物，包括β-大馬士酮、苯乙酮，經(jīng)過IRD和VD處理后兩種酮類物質均增加(表2)，β-大馬士酮和苯乙酮均呈現(xiàn)花香味，說明IRD和VD處理賦予了檸檬片更濃郁的花香味。與前面結果有所不同的是，熱圖顯示IRD與VD處理較為相近，但前兩種處理效果仍與AD處理接近，說明3種處理方式存在共通之處，可能是由于使用了同一干燥溫度。

圖9 不同方式干燥檸檬片揮發(fā)性物質的聚類熱圖

表2 檸檬中標志揮發(fā)性成分峰值強度?

3 結論

采用氣相色譜—離子遷移譜技術對比分析了鮮檸檬及4種干燥方式處理的檸檬片樣品中揮發(fā)性物質的差異。5種樣品共檢出并定性了72種揮發(fā)性物質，包括20種萜烯類物質、16種酯類物質、13種醛類物質、13種醇類物質、7種酮類物質、2種酸類物質和1種呋喃類物質，其中多對成分為其單體及二聚體和三聚體，由此構建風味物質遷移指紋圖譜。結果表明，標志揮發(fā)性萜烯類物質在干燥過程中較為穩(wěn)定，但酯類和醇類物質含量相對下降，干燥后4種樣品中的醛類物質有不同程度的上升；紅外干燥與熱風干燥和真空干燥效果的相似度較高，但紅外干燥相對于其他處理方式效果較好，對標志揮發(fā)性酯類物質保留率高于其他處理組11%～27%，同時標志揮發(fā)性醛類物質含量增加較多，與鮮檸檬相比增加了53%，對其風味具有積極影響。