半夏等15種常見(jiàn)中草藥提取物的抗氧化能力比較研究

豐丕雪 易弋 黃錦翔 嚴(yán)寅琿 馬振花 朱敦朝 趙早亞

摘? 要：采用體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，包括DPPH/超氧陰離子/羥自由基清除率、Fe2+螯合能力和總還原力的檢測(cè)，對(duì)半夏等15種中草藥水提物和醇提物的抗氧化能力進(jìn)行研究，并對(duì)其綜合抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，在不同的檢測(cè)方法下，同一中草藥的同種提取物會(huì)有不同的抗氧化能力，例如青果的水提物對(duì)于Fe2+螯合能力最強(qiáng)，螯合率達(dá)到了149.27%;而超氧陰離子自由基清除率僅為陽(yáng)性對(duì)照物的55.20%;對(duì)不同中草藥抗氧化能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)同一中草藥的水提物和醇提物的抗氧化效果不同，水提物抗氧化效果最好的分別是青果、丹參、薄荷，醇提物抗氧化效果最好的分別是青果、花椒、桑寄生;綜合水提物與醇提物的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)抗氧化能力最強(qiáng)的3種中草藥分別為青果、薄荷、丹參。上述結(jié)果說(shuō)明，青果、丹參和薄荷具有良好的抗氧化性能，可為未來(lái)挖掘新型天然抗氧化劑提供參考。

關(guān)鍵詞：中草藥;提取物;抗氧化能力;綜合評(píng)價(jià)

中圖分類(lèi)號(hào)：R282.710.5? ? ? ?DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2022.03.013

0? ? 引言

需氧型生物在細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生活性氧?；钚匝醯倪^(guò)多產(chǎn)生會(huì)引發(fā)一系列生化反應(yīng)，破壞細(xì)胞組分，致使細(xì)胞活性降低，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[1]?；钚匝踉谛柩跣蜕矬w內(nèi)主要包括超氧陰離子自由基以及羥自由基等[2]。使用抗氧化劑可以清除這些自由基，從而減輕生物體所受到的氧化損傷。常見(jiàn)的抗氧化劑按來(lái)源可以分為合成抗氧化劑和天然抗氧化劑[3-4]。目前，合成類(lèi)的抗氧化劑應(yīng)用廣泛，但是其可能有未知的毒性，在使用方面存在限制，因此，尋找更具安全性的天然抗氧化物質(zhì)成為抗氧化研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[5]。

中草藥文化有上千年的發(fā)展歷史，是中華之瑰寶，也是一種歷史傳承。我國(guó)的中草藥資源十分豐富，古代的《千金方》《本草綱目》等古籍都記載了大量的中草藥。眾多研究表明，很多中草藥都具有天然的抗氧化特性[6-7]。隨著研究的深入，也確定了中草藥中抗氧化物的具體成分，如蒽醌[8]、多糖[9-10]、酚酸[11-12]以及黃酮[13-18]等。通過(guò)研究中草藥的抗氧化性，進(jìn)而篩選強(qiáng)抗氧化活性物質(zhì)是發(fā)現(xiàn)新型天然抗氧化物的有效途徑。

目前雖然很多中草藥的抗氧化活性都已經(jīng)被檢測(cè)過(guò)，但多為單獨(dú)研究某一種中草藥。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)條件不同、檢測(cè)方法不同，所以無(wú)法合理比較各種中草藥抗氧化能力的強(qiáng)弱。本研究選擇15種中草藥，在同樣的條件下運(yùn)用5種抗氧化指標(biāo)分別比較它們的水提物和醇提物的抗氧化活性，從而更加客觀地評(píng)價(jià)所選中草藥的抗氧化能力。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 材料與試劑

本文所研究的15種中草藥分別為半夏、柴胡、芡實(shí)、千年健、厚樸、牛膝、丹參、薄荷、桑寄生、雞內(nèi)金、雞血藤、獨(dú)活、鉤藤、花椒和青果，采購(gòu)于廣西柳州某大藥房。實(shí)驗(yàn)試劑和實(shí)驗(yàn)儀器分別見(jiàn)表1和表2。

1.2? ? 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1? ? 中草藥浸出液的制備

水提：純水提取，料液比1∶15，轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度37 ℃，反應(yīng)2 h，然后常溫超聲提取30 min，濾液濃縮，最后用蒸餾水定容到質(zhì)量濃度為1 g/mL。

醇提：75%乙醇溶液提取，料液比1∶15，轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度37 ℃，反應(yīng)2 h，然后常溫超聲提取30 min，濾液濃縮，最后用蒸餾水定容到質(zhì)量濃度為1 g/mL。

1.2.2? ? ?中草藥提取物體外抗氧化能力檢測(cè)

1）對(duì)DPPH自由基的清除作用

參照Kong等[19]實(shí)驗(yàn)方法，樣品量取等體積的待測(cè)液與2×10-4? mol/L的DPPH溶液混勻;空白組用蒸餾水代替樣品組中的待測(cè)液;對(duì)照組用無(wú)水乙醇代替2×10-4? mol/L的DPPH溶液。反應(yīng)30 min后，在517 nm處測(cè)各組的吸光度值。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次（n = 3），下同。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如式（1）所示：

[DPPH自由基清除率=A2+A0-A1A0×100%]. （1）

式中：[A0]、[A1]、[A2]分別為空白組、樣品組和對(duì)照組的吸光度值。

2）對(duì)羥自由基的清除作用

鄰二氮菲-Fe2+被羥自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3+后，其在536 nm處的最大吸收峰消失[20]。參照張京芳等[21]方法，在損傷管中先加入1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液，再依次加入2 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）和1 mL蒸餾水，混勻后，加入1 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液，再次混勻后，加入1 mL 0.01%雙氧水，在37 ℃下水浴60 min;未損傷管以蒸餾水代替損傷管中加入的0.01%雙氧水;樣品管以1 mL樣品代替損傷管中加入的蒸餾水。在536 nm處測(cè)各組的吸光度值，羥自由基清除率計(jì)算公式如式（2）所示：

[羥自由基清除率=As-ADAu-AD×100%] .? ? （2）

式中：[As]、[AD]、[Au]分別為樣品管、損傷管和未損傷管的吸光度值。

3）對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

鄰苯三酚可以在堿性溶液中自動(dòng)氧化，生成? ?[·O-2]自由基和有色中間產(chǎn)物醌[22]。參照馮嬌等[23]方法，樣品組加入4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl（pH 8.2），在25 ℃下水浴20 min，再依次加入1 mL樣品液和0.4 mL 25 mmol/L鄰苯三酚，混勻后于25 ℃下水浴5 min，最后加入1.0 mL 8 mol/L鹽酸終止反應(yīng)?？瞻捉M以蒸餾水替代樣液，參比是Tris-HCl。在299 nm處測(cè)定各組的吸光度，超氧陰離子自由基清除率按式（3）計(jì)算：

[超氧陰離子自由基清除率=A0-A1A0×100%]. （3）

式中：[A0]和[A1]分別為空白組和樣品組的吸光度值。

4） Fe2+螯合能力的測(cè)定

羥基自由基與鄰近的生物分子迅速反應(yīng)，抗氧化物質(zhì)對(duì)金屬離子的螯合作用間接地促進(jìn)了其本身具有的抗氧化活性[24]。參照馬夢(mèng)嬌[25]的方法，樣品組依次加入1 mL樣品溶液、3.7 mL蒸餾水、0.1 mL 2 mmol/L 的FeCl2溶液和0.2 mL 5 mmol/L的菲洛嗪，在25 ℃下反應(yīng)10 min;空白組以蒸餾水代替樣品溶液，對(duì)照組以蒸餾水代替菲洛嗪溶液。在562 nm 處測(cè)定各組的吸光度值，F(xiàn)e2+螯合率按式（4）計(jì)算：

[Fe2+螯合率=1-A1-A2A0×100%]? .? ? （4）

式中：[A0]、[A1]和[A2]分別為空白組、樣品組和對(duì)照組的吸光度值。

5）總還原力的測(cè)定

抗氧化物質(zhì)通過(guò)提供電子可使自由基失活，還原力越大，則抗氧化活性越強(qiáng)[26]。采用Gao等[27]實(shí)驗(yàn)方法，總體系中含有1 mL 樣液，依次加入2.5 mL PBS和1 mL鐵氰化鉀溶液（10 g/L），振蕩均勻，在50 ℃下水浴20 min，加入2 mL三氯乙酸（100 g/L）和1.2 mL三氯化鐵（1 g/L）終止反應(yīng)，在700 nm處測(cè)定吸光度值，相對(duì)總還原力按式（5）計(jì)算：

[相對(duì)總還原力=A1A2×100%]? .? ? ? ?（5）

式中：[A1]和[A2]分別為陽(yáng)性樣品組和對(duì)照組的吸光度值。

6）各種中草藥抗氧化活性的綜合評(píng)價(jià)

按水提物和醇提物分兩大類(lèi)，根據(jù)每種檢測(cè)方法測(cè)出來(lái)的值進(jìn)行排名，排名第一為15分，排名第二為14分，依次類(lèi)推;對(duì)同一中草藥的水提物和醇提物的分?jǐn)?shù)分別求和，記為總分并統(tǒng)計(jì)排名。

1.3? ? 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA analysis），采用LSD法進(jìn)行多重比較分析，結(jié)果使用平均值[±]標(biāo)準(zhǔn)誤差（mean±SE）表示，結(jié)果真實(shí)程度用概率[P]表示，[P]值越小，表明結(jié)果越顯著。*、**、***分別表示[P<0.05]、[P<0.01]、[P<0.001]。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ?對(duì)DPPH自由基的清除作用

由圖1可知，不同中草藥提取物均具有不同程度的DPPH自由基清除能力。青果、雞血藤、薄荷具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力（≥ 90.00%），其中青果醇提物效果最好，清除率達(dá)到94.66%，其次是青果水提物、雞血藤醇提物、薄荷醇提物、雞血藤水提物，清除率分別為94.02%、92.32%、92.20%和91.49%。此外，同種中草藥的水提物和醇提物在同一濃度下的DPPH自由基清除能力可能存在顯著差異。例如，丹參水提物對(duì)DPPH自由基的清除能力顯著（P < 0.001）強(qiáng)于其醇提物;而花椒醇提物顯著（P < 0.001）強(qiáng)于其水提物。

2.2? ?對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

由圖2可知，不同中草藥提取物均具有不同程度的超氧陰離子自由基清除能力。青果、獨(dú)活、花椒、薄荷具有較強(qiáng)的超氧陰離子自由基清除能力（≥ 40.00%），其中青果水提物超氧陰離子自由基清除能力最強(qiáng)，清除率達(dá)到54.22%;其次是獨(dú)活水提物、青果醇提物、花椒醇提物、花椒水提物、薄荷水提物，清除率分別為46.68%、42.59%、42.54%、41.68%以及41.05%。此外，同種中草藥的水提物和醇提物在同一濃度下的超氧陰離子自由基清除能力可能存在顯著差異。例如，薄荷水提物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力顯著（P < 0.001）強(qiáng)于其醇提物。

2.3? ?對(duì)羥自由基的清除作用

由圖3可知，不同中草藥提取物均具有不同程度的羥自由基的清除能力。青果、薄荷、丹參具有更強(qiáng)的羥自由基清除能力（≥ 40.00%），其中青果醇提物羥自由基清除能力最強(qiáng)，清除率達(dá)到115.26%，其次是青果水提物，羥自由基清除率是99.23%。此外，同種中草藥的水提物和醇提物，在同一濃度下羥自由基清除能力可能存在顯著差異。例如，丹參水提物對(duì)羥自由基的清除能力顯著（P < 0.001）強(qiáng)于其醇提物;青果醇提物對(duì)羥自由基的清除能力顯著（P < 0.001）強(qiáng)于其醇溶液。

2.4? ? 對(duì)Fe2+的螯合能力

由圖4可知，不同中草藥提取物具有不同程度的Fe2+螯合能力。丹參、青果、千年健具有較強(qiáng)的Fe2+螯合能力（≥12.00%），其中丹參水提物Fe2+螯合能力最強(qiáng)，F(xiàn)e2+螯合率達(dá)到16.88%;其次是青果水提物，F(xiàn)e2+螯合率是14.33%。此外，同種中草藥的水提物和醇提物在同一濃度下的羥自由基清除能力

2.5? ? 相對(duì)總還原力

由圖5可知，不同中草藥提取物具有不同程度的相對(duì)總還原力。青果、雞血藤、薄荷、丹參具有更強(qiáng)的總還原力，相對(duì)總還原力（≥30.00%），其中青果水提物的總還原力最強(qiáng)，相對(duì)總還原力達(dá)到81.82%;其次是青果醇提物，相對(duì)總還原力是71.80%。此外，同種中草藥的水提物和醇提物在同一濃度下相對(duì)總還原力可能會(huì)存在顯著差異。例如，丹參水提物的總還原力顯著（P < 0.001）強(qiáng)于其醇提物;薄荷醇提物的總還原力顯著（P < 0.001）強(qiáng)于其水提物。

2.6? ?15種中草藥抗氧化活性綜合評(píng)價(jià)

通過(guò)綜合打分可以更加科學(xué)、合理地篩選出抗氧化能力較強(qiáng)的中草藥，為今后深入挖掘天然抗氧化劑打下基礎(chǔ)。表3為半夏等15種中草藥抗氧化能力總評(píng)價(jià)表。由表3可以看出，青果綜合抗氧化能力最強(qiáng)，總分高達(dá)147;其次是薄荷、丹參，其抗氧化能力的總分分別是109、107。

3? ? 討論

3.1? ?不同檢測(cè)方法下的抗氧化能力比較

運(yùn)用不同的檢測(cè)方法得到的同種中草藥提取物抗氧化能力的結(jié)果有明顯差異，如青果水提物對(duì)Fe2+的螯合能力（149.27%）和超氧陰離子自由基清除率（55.20%）明顯不同。Fu等[28]在研究五味子中黃酮類(lèi)化合物（PCF）的抗氧化活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)PCF濃度為2 mg/mL時(shí)，超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照的97.74% ，而羥自由基的清除率僅為陽(yáng)性對(duì)照的83.35%。Gao等[27]從金紅菇菌絲體中提取出多糖組分GRMP1，對(duì)其進(jìn)行體外抗氧化能力檢測(cè)，結(jié)果顯示，當(dāng)GRMP1濃度為2 g/L時(shí)，對(duì)羥自由基的清除能力最強(qiáng)，相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照維生素C羥自由基清除率約為96.94%，而超氧陰離子自由基清除率僅為陽(yáng)性對(duì)照的38.46%?？赡苁怯捎谕N中草藥提取物中含有多種抗氧化成分，這些物質(zhì)通過(guò)不同的機(jī)制發(fā)揮作用，從而在不同的檢測(cè)方法下會(huì)有不同的結(jié)果。

3.2? ?水提物和醇提物抗氧化活性差異分析

本文研究結(jié)果顯示，某些中草藥水提物和醇提物的抗氧化活性存在明顯差異。例如，丹參水提物的抗氧化能力均顯著高于其醇提物，可能是因其具有抗氧化作用的活性物質(zhì)大多是水溶性的。據(jù)報(bào)道，丹參中主要含有脂溶性的丹參酮類(lèi)和水溶性的酚酸類(lèi)化合物以及多糖等物質(zhì)，水溶性的酚酸類(lèi)主要有丹參素、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、紫草酸等[29-30]。這些酚酸具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗凝血和抗炎等[31]。Liang等[32]研究表明，丹參的水溶性成分丹酚酸A和丹酚酸B能夠顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的人卵巢顆粒瘤細(xì)胞系（KGN）細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，說(shuō)明丹參水溶性成分具有抗氧化活性。Yuen等[33]試驗(yàn)結(jié)果也表明丹參水提取物能降低線蟲(chóng)體內(nèi)的活性氧（ROS）水平，從而顯著減緩秀麗隱桿線蟲(chóng)阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease，AD）模型中的癱瘓進(jìn)程。除了丹參外，薄荷水提物對(duì)超氧陰離子、羥自由基的清除能力顯著強(qiáng)于其醇提物，這與陳智坤等[34]的研究結(jié)果相似。勾明玥等[35]對(duì)多種植物采用 DPPH 法測(cè)定抗氧化活性，結(jié)果顯示，雞血藤醇提物對(duì)DPPH自由基清除率為94.00%，其水提物的清除率只有48.00%，這與本研究中雞血藤醇提物的總還原力顯著強(qiáng)于其水提物的結(jié)果類(lèi)似，提示雞血藤的主要抗氧化成分是醇溶的。因此，同一中草藥采用不同的提取方式所獲得的抗氧化成分是不一樣的。

3.3? ? 15種中草藥抗氧化活性綜合分析

通過(guò)綜合評(píng)價(jià)可以發(fā)現(xiàn)，15種中草藥中抗氧化能力最強(qiáng)的3種分別是：青果、薄荷、丹參。這3種中草藥分別含有大量的抗氧化成分。如青果和丹參中含有酚酸類(lèi)和黃酮類(lèi)物質(zhì)，薄荷中含有大量的薄荷多糖和黃酮類(lèi)化合物[36]。酚酸類(lèi)物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，其能夠提供氫質(zhì)子，具有很強(qiáng)的抗氧化能力[37];薄荷多糖中含有的醛酸基團(tuán)能夠清除超氧陰離子，羥基和氨基具有較強(qiáng)的超氧陰離子、羥自由基清除能力[38];黃酮類(lèi)能夠作為氫離子供體，進(jìn)而抑制自由基的產(chǎn)生以及清除活性氧、活性氮[39]。這與本研究中青果、薄荷、丹參抗氧化能力強(qiáng)的結(jié)果是一致的。這些抗氧化物質(zhì)特殊的結(jié)構(gòu)使得中草藥具備清除自由基與活性氧的能力，進(jìn)而展現(xiàn)抗癌、抗菌、抗病毒作用[40]。如青果中的苦苷、酪醇、羥酪醇和馬鞭草苷被證明可以預(yù)防冠狀動(dòng)脈疾病和癌癥[40]，其中的多酚物質(zhì)（橄欖苦苷和羥酪醇）的抗氧化和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用已在文獻(xiàn)中得到廣泛證實(shí)[41-42]。同樣地，薄荷、丹參中的黃酮類(lèi)化合物也被證明具有抗氧化與抗炎作用[43-44]。本研究結(jié)果表明青果、薄荷、丹參具有良好的抗氧化作用，結(jié)合文獻(xiàn)可以推測(cè)是由于其中含有大量的抗氧化活性物質(zhì)，并發(fā)揮抗氧化、抗炎癥和抗癌作用，但是其具體的藥理成分還有待進(jìn)一步研究。

4? ? 結(jié)論

通過(guò)本文的研究，發(fā)現(xiàn)同一中草藥的水/醇提物的抗氧化活性存在差異，不同檢測(cè)方法下同一中草藥提取物的抗氧化能力也不同，采用不同的提取方式會(huì)獲得不同的抗氧化成分，抗氧化成分以及含量等的差異會(huì)導(dǎo)致中草藥提取物產(chǎn)生不同的抗氧化效果。通過(guò)綜合評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)青果、丹參、薄荷具有良好的抗氧化效果，可能與這幾種中草藥含有較多黃酮、酚酸、多糖等強(qiáng)抗氧化物質(zhì)有關(guān)。通過(guò)對(duì)中草藥抗氧化活性的測(cè)定，能夠?yàn)楹Y選天然抗氧化劑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)為尋找抗炎、抗菌或抗癌藥物提供理論支持。

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Comparative study on antioxidant capacity of extracts from 15 common Chinese medicinal herbs including Ban Xia （Pinelliae rhizoma）

FENG Pixue1，2，3， YI Yi1，2，3， HUANG Jinxiang1，2，3， YAN Yinhui1，2，3， MA Zhenhua1，2，3， ZHU Dunchao1，2，3， ZHAO Zaoya*1，2，3

（1. School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China; 2. Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources （Guangxi University of

Science and Technology）， Liuzhou 545006， China; 3. Key Laboratory of Sugar Resources Processing of

Guangxi Higher Education Institutions （Guangxi University of Science and Technology）， Liuzhou 545006， China）

Abstract： This paper investigated the antioxidant capacity of aqueous and alcoholic extracts from 15 Chinese medicinal herbs and assessed their comprehensive antioxidant capacity by performing in vitro antioxidant experiments including DPPH/ superoxide anion/hydroxyl radical scavenging rate， Fe2+? ? ?chelating capacity and total reducing power detection. The results showed that the same kind of extracts from the same Chinese medicinal herb with different detection methods would have different? ? ? ? ? ? ? ? ? ?antioxidant capacities， for example， the water extract of Qing Guo （Canarii fructus） had the strongest chelating ability to Fe2+， the rate of chelating reaching 149.2%， while the superoxide anion radical? ? ? ? ? scavenging rate being only 55.20%; A comprehensive assessment of the antioxidant capacity of? ? ? ? ? ?different Chinese medicinal herbs revealed that aqueous and alcoholic extracts of the same Chinese herb had different antioxidant effects， and the drugs with the best antioxidant effect from aqueous? ? ? ?extracts were Qing Guo （Canarii fructus）， Dan Shen （Salviae miltiorrhizae Radix）， Bo He （Menthae herba）; The drugs with the best antioxidant effect of the alcoholic extract were Qing Guo （Canarii? ? fructus）， Hua Jiao （Zanthoxyli pericarpium） ， Sang Jisheng （Taxilli herba）; Assessing the results of aqueous and alcohol extract， we found that the three drugs with most antioxidant capacity were Qing Guo （Canarii fructus）， Bo He （Menthae herba）， Dan Shen （Salviae miltiorrhizae Radix）. The above? ? ? ?results show that Qing Guo （Canarii fructus）， Dan Shen （Salviae miltiorrhizae Radix） and Bo He? （Menthae herba） have good antioxidant functions， which provides a theoretical support for the development of natural antioxidants.

Key words： Chinese medicinal herbs; extract; antioxidant capacity; comprehensive assessment

（責(zé)任編輯：于艷霞）