蛇足石杉內(nèi)生真菌Cladosporium tenuissimum MT-35的代謝產(chǎn)物研究

石璠鈺，楊洪蕓，莫 婷，齊博文，王雯靜，張蓓蓓，劉 曉，史社坡*

1北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥現(xiàn)代研究中心，北京100029；2寧夏回族醫(yī)藥研究所，銀川750021

蛇足石杉(Huperziaserrata(Thunb.ex Murray)Trev.)是石杉科石杉屬植物，又名千層塔，以全草入藥，具有清熱解毒、生肌止血、散瘀消腫的功效，可用于治療跌打損傷、毒蛇咬傷、瘀血腫痛等[1]。據(jù)文獻(xiàn)報道，蛇足石杉的根、莖、葉中均存在豐富的內(nèi)生菌，這些內(nèi)生菌在體外培養(yǎng)時，可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)豐富多樣的代謝產(chǎn)物[2,3]；部分內(nèi)生真菌在體外發(fā)酵培養(yǎng)時還可以產(chǎn)生石杉堿甲[4,5]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，從蛇足石杉中分離鑒定出多株內(nèi)生真菌，進(jìn)一步對其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行研究，分離鑒定了一系列結(jié)構(gòu)新穎的雜萜、聚酮類代謝產(chǎn)物，部分化合物在體外具有顯著的抗炎和乙酰膽堿酯酶抑制活性[6-9]。C.tenuissimumMT-35是課題組前期從蛇足石杉中分離純化的一株內(nèi)生真菌，其發(fā)酵產(chǎn)物具有一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性。因此，課題組對該株內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，結(jié)合體外活性篩選，期望能夠獲得具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的代謝產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Autopol IV全自動旋光儀(美國Rudolf)；高效液相離子阱飛行時間質(zhì)譜分析系統(tǒng)：UFLC SIL-20AC自動進(jìn)樣器，CTO-20AC 柱溫箱，SPD M20A紫外檢測器，LC-20ADXR 泵，IT-TOF-MS 配備ESI離子源(日本Shimadzu)；Varian 500核磁共振儀(美國Varian)；Waters 2998半制備型高效液相色譜儀(美國Waters)；ODS半制備柱(SunFireTMC18，10 × 150 mm，5 μm)；ODS柱色譜填料(Li-Chroprep RP-C18，40～63 μm，德國Merck)；柱色譜用硅膠(200～300目)及薄層色譜用GF254硅膠預(yù)制板均為青島海洋化工廠生產(chǎn)；MCO-18AIC(UV)CO2培養(yǎng)箱(日本 Sanyo)；MCO-18AIC細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本Sanyo)；AE2000倒置熒光顯微鏡(中國Motic)；M1000多功能酶標(biāo)儀(瑞士 Tecan)；脂多糖(LPS)(美國Sigma)；胎牛血清(美國Hyclone)；DMEM培養(yǎng)基(購自日本Corning公司，批號：8121625，詳細(xì)組成可見參考說明書)。

蛇足石杉(Huperiaserrata(Thunb.ex Murray)Trev.)于2015年7月采自福建省南平市(標(biāo)本編號：201507)。本研究所用菌株由課題組自蛇足石杉中分離純化，經(jīng)形態(tài)特征及ITS-rDNA鑒定基因組測序(GenBank中序列號為OM131669)為枝孢菌屬極細(xì)枝孢菌Cladosporiumtenuissimum，菌種保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代研究中心(菌種編號：CladosporiumtenuissimumMT-35)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取與分離

C.tenuissimuMT-35于無菌環(huán)境下接種于0.5 L × 40瓶糙米培養(yǎng)基中，25 ℃室溫培養(yǎng)40天后，用醋酸乙酯超聲提取3次。提取液合并濾過，減壓濃縮得浸膏120 g。經(jīng)正相硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯(20∶1→1∶1)、二氯甲烷-甲醇(20∶1→0∶1)梯度洗脫，合并得到8個流分Fr.1～8。Fr.2經(jīng)反相硅膠柱色譜分離，甲醇-水(3∶7→1∶0)，并結(jié)合半制備HPLC(流動相∶乙腈-水 38∶62，tR= 13 min)分離純化得化合物8(30 mg)；Fr.4經(jīng)反相硅膠柱色譜，甲醇-水(3∶7→1∶0)梯度洗脫，結(jié)合半制備HPLC(流動相∶乙腈-水 22∶78，tR= 18 min)分離純化得化合物7(15 mg)；Fr.6經(jīng)反相硅膠柱色譜，甲醇-水(3∶7→1∶0)梯度洗脫，結(jié)合半制備HPLC分離純化得化合物1(2.5 mg；流動相∶乙腈-水 20∶80，tR= 18 min)、2(5.2 mg；流動相∶乙腈-水 20∶80，tR= 38 min)、3(3.3 mg；流動相∶乙腈-水 23∶77，tR= 9 min)、4(4.2 mg；流動相∶乙腈-水 30∶70，tR= 12 min)、9(4.2 mg；流動相∶乙腈-水 85∶15，tR= 18 min)；Fr.8經(jīng)反相硅膠柱色譜，甲醇-水(3∶7→1∶0)梯度洗脫，結(jié)合半制備HPLC分離純化得化合物5(5.1 mg；流動相∶甲醇-水 20∶80，tR= 17 min)、10(4.5 mg；流動相∶甲醇-水 50∶50，tR= 25 min)、6(2.4 mg；流動相∶甲醇-水 30∶70，tR= 20 min)。

1.2.2 抗乙酰膽堿酯酶活性篩選

采用改良的Ellman法測定各單體化合物的乙酰膽堿酯酶抑制活性[2,10]。在96孔板中每孔加入100 μL的PBS緩沖液(pH 8.0)，20 μL乙酰膽堿酯酶(50 U/L，溶于PBS中)，20 μL樣品溶液(終濃度為100、20、4 mg/L，溶于含2% 的DMSO的PBS溶液中)，20 μL濃度為1.2 mmol/L的碘代硫代乙酰膽堿作為酶反應(yīng)底物。在37 ℃條件下恒溫孵化30 min后加入20 μL 4%的十二烷基硫酸鈉(SDS)終止反應(yīng)，并加入20 μL 0.6 mmol/L的5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸，DTNB)，立即測定反應(yīng)體系在405 nm波長下的吸光度。單體化合物的百分抑制率通過公式I=[1-(A樣品-A背景)/A空白]× 100%計算獲得，其中A樣品為加藥組，A背景為沒有加入酶的對照組，A空白為未加樣品。通過計算不同樣品濃度對乙酰膽堿酯酶的抑制率來計算不同單體化合物的IC50值。以上每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，石杉堿甲作為陽性對照。

1.2.3 抗炎活性篩選

比較不同化合物抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO能力，對其抗炎活性進(jìn)行評價[7,11]。取對數(shù)期的RAW 264.7細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基終止消化，低速離心，重懸于新鮮培養(yǎng)基中。將細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基稀釋至4×105個/mL，以每孔40 000個細(xì)胞接種于96孔板中，CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育24 h。用二甲基亞砜(DMSO)配制濃度為25 mmol/L單體化合物母液，經(jīng)培養(yǎng)基稀釋后加入96孔培養(yǎng)板至終濃度分別為100、20、4 μmol/L，孵育1 h，再加入終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的LPS，繼續(xù)孵育24 h。從96孔板各孔中吸取100 μL上清至酶標(biāo)板內(nèi)，每孔加入50 μL Griess R1，室溫避光放置5 min，再加入50 μL Griess R2，室溫避光放置5 min。在540 nm條件下測定吸光度。計算各化合物對NO釋放的抑制率，并得出半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色無定型粉末；ESI-MS：m/z192[M+H]+，分子式為C10H9NO3。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.93(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，7.48(1H，t，J=7.5 Hz，H-7)，7.31(1H，d，J=8.5 Hz，H-8)，7.24(1H，t，J=7.5 Hz，H-6)，3.84(3H，s，3-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：163.1(C-2)，131.8(C-3)，154.7(C-4)，124.0(C-5)，123.3(C-6)，130.9(C-7)，116.3(C-8)，136.7(C-9)，117.4(C-10)，60.6(3-OCH3)?；衔?結(jié)構(gòu)已有文獻(xiàn)[12]報道，但其完整的NMR數(shù)據(jù)在文獻(xiàn)中沒有報道。因此，在對化合物的二維NMR圖譜(HMBC和HSQC圖譜)進(jìn)行分析的基礎(chǔ)，本文中對化合物1的NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行了詳細(xì)歸屬，鑒定其結(jié)構(gòu)為4-hydroxy-3-methoxy-2(1H)-quinolinone。

化合物2淡黃色粉末；ESI-MS：m/z225[M+H]+，分子式為C11H12O5。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：12.62(1H，br s，9-COOH)，6.89(1H，s，H-5)，6.50(lH，s，H-8)，4.01(3H，s，H-12)，2.36(3H，s，H-11)，1.83(3H，s，H-10)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：162.8(C-2)，103.2(C-3)，165.2(C-4)，97.5(C-5)，156.8(C-6)，141.9(C-7)，120.0(C-8)，166.9(C-9)，8.7(C-10)，13.1(C-11)，57.0(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道基本一致，故鑒定化合物2為acropyrone。

化合物3淡黃色粉末；ESI-MS：m/z243[M+H]+，分子式為C12H10N4O2。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：11.70(1H，s，NH)，7.91(1H，s，H-6)，7.71(lH，s，H-9)，2.49(3H，s，H-11)，2.46(3H，s，H-12)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：150.1(C-2)，160.6(C-4)，128.6(C-6)，144.5(C-7)，138.7(C-8)，125.8(C-9)，19.5(C-11)，20.1(C-12)，130.1(C-4a)，138.3(C-5a)，141.6(C-9a)，146.5(C-10a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道基本一致，故鑒定化合物3為lumichrome。

化合物4白色粉末；ESI-MS：m/z189[M+H]+，分子式為C10H8N2O2。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.73(1H，s，H-2)，8.30(lH，dd，J=7.0，2.0 Hz，H-4)，7.48(1H，dd，J=6.5，1.5 Hz，H-7)，7.26(2H，m，H-5，6)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：139.5(C-2)，113.1(C-3)，122.9(C-4)，123.9(C-5)，124.7(C-6)，114.0(C-7)，183.1(C-8)，168.2(C-9)，127.9(C-3a)，138.0(C-7a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道基本一致，故鑒定化合物4為(1H-indol-3-yl)oxoacetamide。

化合物5淡黃色粉末；ESI-MS：m/z154[M+H]+，分子式為C7H7NO3。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.45(1H，d，J=2.5 Hz，H-5)，7.96(1H，dd，J=9.5，2.5 Hz，H-3)，6.53(1H，d，J=9.5 Hz，H-2)，3.61(3H，s，N-CH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：167.2(C-1)，119.3(C-2)，141.1(C-3)，112.5(C-4)，145.7(C-5)，165.3(4-COOH)，38.6(N-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報道基本一致，故鑒定化合物5為1,6-dihydro-1-methyl-6-oxo-3-pyridinecarboxylic acid。

化合物6白色粉末；ESI-MS：m/z113[M+H]+，分子式為C4H4N2O2。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.39(1H，d，J=7.5 Hz，H-5)，5.44(1H，dd，J=7.5，1.5 Hz，H-6)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：151.5(C-2)，164.3(C-4)，100.2(C-5)，142.2(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[17]，故鑒定化合物6為尿嘧啶。

化合物9黃色油狀物；ESI-MS：m/z280[M+H]+，分子式為C18H33NO。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：5.34(4H，m，H-9，10，12，13)，2.78(2H，t，J=7.5 Hz，H-11)，2.20(2H，t，J=7.5 Hz，H-2)，2.06(2H，q，J=6.5 Hz，H-14)，0.91(3H，t，J=7.0 Hz，H-18)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：179.3(C-1)，36.5(C-2)，26.5(C-3)，30.2，30.3，30.4(C-4～C-6)，28.2(C-7)，26.9(C-8)，129.1(C-9)，130.9(C-10)，30.7(C-11)，129.1(C-12)，130.9(C-13)，30.5(C-14)，28.2(C-15)，32.6(C-16)，23.6(C-17)，14.4(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報道基本一致，故鑒定化合物9為9(Z),12(Z)-十八碳二烯酰胺。

化合物10棕色無定型粉末；ESI-MS：m/z387[M+H]+，分子式為C20H18O8。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.58(1H，s，H-7′)，7.44(1H，d，J=1.5 Hz，H-2)，7.30(1H，s，H-2′)，7.28(1H，d，J=15.5 Hz，H-7)，7.07(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，7.05(1H，d，J=8.0 Hz，H-6′)，6.80(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.73(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.38(1H，d，J=15.5 Hz，H-8)，3.97(3H，s，3′-OCH3)，3.70(3H，s，3-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：125.9(C-1)，113.6(C-2)，148.8(C-3)，149.6(C-4)，116.1(C-5)，126.4(C-6)，128.4(C-7)，145.8(C-8)，164.5(C-9)，130.2(C-1′)，112.4(C-2′)，150.5(C-3′)，149.1(C-4′)，114.8(C-5′)，123.2(C-6′)，145.8(C-7′)，118.0(C-8′)，167.3(C-9′)，56.0(3-OCH3)，56.6(3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報道基本一致，故鑒定化合物10為8-O-4-dehydrodiferulic acid。

化合物1～10結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～10的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2.2 抗乙酰膽堿酯酶活性篩選

所述單體的抗乙酰膽堿活性篩選結(jié)果顯示，化合物3對乙酰膽堿酯酶具有一定的抑制活性，IC50為77.9±11.1 μmol/L(陽性對照石杉堿甲IC50為0.6±0.1 μmol/L)其余化合物在濃度為100 μmol/L時，對乙酰膽堿酯酶無明顯抑制活性。

2.3 抗炎活性篩選

所述單體的抗炎活性篩選結(jié)果顯示，化合物3、7、8、9對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮具有抑制活性，IC50值分別為36.8±1.0、3.9±0.2、36.6±0.0、53.2±1.4 μmol/L(陽性對照吲哚美辛IC50為39.0±13.8 μmol/L)，其余化合物在濃度為100 μmol/L時，對RAW 264.7細(xì)胞NO釋放無明顯抑制活性。

3 討論與結(jié)論

微生物在體外發(fā)酵培養(yǎng)時可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎多樣的代謝產(chǎn)物[6]，通過對微生物代謝產(chǎn)物的分離鑒定并結(jié)合活性篩選，有望發(fā)現(xiàn)具有開發(fā)潛力的活性分子。C.tenuissimum是課題組前期從蛇足石杉中分離得到的一株內(nèi)生真菌，文獻(xiàn)報道該菌在喬松(Pinuswallichiana)、美登木(Maytenushookeri)等植物中也曾分離報道，Naseer、Dai等[21,22]對其在馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中發(fā)酵的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，分離得到多個大環(huán)內(nèi)酯類聚酮，其中部分化合物具有抗菌活性。在本研究中，從C.tenuissimum的糙米發(fā)酵產(chǎn)物中共分離鑒定了10個代謝產(chǎn)物，包括6個含氮類化合物，2個甾體類化合物，2個聚酮類化合物，部分化合物具有抗乙酰膽堿酯酶和抗炎的生物活性。其中化合物1的結(jié)構(gòu)雖已有報道[11]，但其核磁數(shù)據(jù)尚無文獻(xiàn)參考，本文利用二維核磁共振(2D NMR)等方法，對其碳?xì)鋽?shù)據(jù)進(jìn)行了準(zhǔn)確歸屬。上述研究結(jié)果對進(jìn)一步了解極細(xì)枝孢菌C.tenuissimum代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型和活性天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)有一定的參考意義。但是，在對該菌株的系統(tǒng)分離研究中，發(fā)現(xiàn)該株內(nèi)生真菌在本文報道的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其代謝產(chǎn)物非常有限，沒有分離到文獻(xiàn)中報道的大環(huán)內(nèi)酯類成分，可能是由于培養(yǎng)條件不同或者內(nèi)生菌的植物宿主不同，導(dǎo)致其代謝產(chǎn)物不同。在后續(xù)研究中，可以嘗試改變發(fā)酵培養(yǎng)條件或者嘗試不同真菌共培養(yǎng)的方法，結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)分析導(dǎo)向，篩選出合適的培養(yǎng)條件后，再開展LC-MS導(dǎo)向性分離，盡量避免低層次的重復(fù)性分離。另一方面，隨著目前基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，基于基因挖掘技術(shù)進(jìn)行新穎結(jié)構(gòu)活性天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)策略，成為研究的前沿?zé)狳c(diǎn)[23]。通過激活特定基因簇的表達(dá)，或者將相關(guān)的基因簇在其他異源體系中進(jìn)行表達(dá)，有望發(fā)現(xiàn)大量常規(guī)條件下無法獲得的新穎產(chǎn)物。